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B. El Crecimiento de la Bacteria Individual 1.

Crecimiento relativo a Divisin En los pocos casos donde los crecimientos de bacterias individuales han sido medidos directamente, se ha encontrado que generalmente el ndice de crecimiento sigue la misma curva sigmoide (con forma de S) que es tpico de las clulas de plantas mayores y animales. El ndice mximo es alcanzado cuando el organismo ha alcanzado como un 75% de su tamao total en divisin, y el ndice es el ms bajo inmediatamente antes e inmediatamente despus de la divisin. Unos cuantos casos han sido observados, sin embargo, donde el ndice de crecimiento de la clula es relativamente independeiente del estado de divisin. Se asume que estos ltimos son multinucleados donde las divisiones nucleares no ocurren necesariamente de manera simultnea. La primera entonces puede ser asumida que es un uninucleado. 2. Efectos Ambientales en Crecimiento Celular Individual Sobre un cierto mnimo, un incremento en la temperatura generalmente resulta en un incremento aproximadamente linear en el ndice de crecimiento sobre un rango de 20 o 25C. La temperatura mnima vara de especies a especies, y dentro de una especie puede ser influenciado por la composicin del medio. Sin embargo, declina abruptamente y generalmente cae a cero dentro de 5C de su cima. Un segundo efecto de temperatura a veces observado es que el tamao promedio de muchos organismos unicelulares justo antes de la divisin es ms grande a temperaturas ms bajas. Algunas excepciones que han sido reportadas de mantener un tamao aproximadamente celular constante son Saccharomyces cerevisiae en el rango de 21 a 37C y Salmonella typhinurium entre 25 y 37C. Otros factores ambientales tambin influyen el crecimiento del organismo individual, pero ya que estos factores tienen un desarrollo ____________ similar de todo el cultivo bacterial, estn discutidos en otra parte en este captulo, y en los Captulos 2, 4 y 5. C. Medidas de Crecimiento La mayora de los estudios de crecimiento bacterial han medido los cambios en un cultivo bacterial desarrollado en medio lquido. Las tcnicas para tales estudios son usualmente mucho ms simples que las requeridas para medir el crecimiento de clulas individuales. Las medidas del desarrollo de un cultivo caen en dos amplias clases: aquellas que determinan crecimiento y aquellas que siguen la multiplicacin. Es importante distinguir entre estos dos fenmenos. Por crecimiento queremos decir incremento en la cantidad (masa) de protoplasma en el cultivo. Multiplicacin, por otro lado, es definido como el incremento en poblacin o nmero de clulas. Monod (1949) sugiri los trminos densidad bacterial y concentracin celular para estas dos propiedades de cultivo bacterial. Debido a que el promedio en tamao de las clulas raramente permanece constante durante fermentacin, es evidente que el crecimiento y multiplicacin raramente proceden en grados iguales. Tcnicas que miden crecimiento son las que se emplean comnmente en estudios de cinticas de fermentacin.

1. Mtodos Directos de Medicin Los mtodos directos para medir densidad bacterial involucran como un paso inicial la centrifugacin de un volumen medido del fludo de cultivo, seguido usualmente por uno o ms lavados de clulas. El peso seco de las clulas, el volumen de las clulas, o la cantidad de algunos constituyentes celulares como el nitrgeno o fsforos, pueden entonces ser determinados. La dificultad aqu es que el contenido de agua de las clulas, la cantidad de material capsular, e incluso la composicin qumica de las clulas, puede cambiar durante el ciclo de crecimiento. Consecuentemente, es difcil, o hasta imposible, obtener una correlacin precisa y consistente entre los resultados de estos diversos mtodos. Otra dificultad es que ninguno de los mtodos distingue entre las fracciones viables o no viables de la biomasa. Mientras los mtodos directos son suficientemente precisos para muchas aplicaciones, las inexactitudes e inconsistencias han obstaculizado la investigacin de cinticas de fermentacin, especialmente para las etapas muy tempranas y muy tardas del ciclo de crecimiento. Una dificultad adicional con los mtodos de medicin directa es que los resultados nunca estn disponibles inmediatamente, y horas o incluso das pueden intervenir entre tomar la muestra y el establecimiento final de la densidad bacterial. 2. Mtodos Indirectos de Medicin Aunque es una medida indirecta de densidad bacterial, la turbidimetra se ha vuelto el mtodo ms comnmente usado. Es un mtodo relativamente simple para usar, sus resultados estn disponibles casi de inmediato, y a travs de gran parte del ciclo de crecimiento es suficientemente preciso para muchas aplicaciones. Un segundo mtodo de medicin indirecta para seguir el crecimiento, usar un analizador infrarrojo _________ para medir el CO2 en los gases celulares de un cultivo aerado, tiene dos ventajas que pueden recomendarlo para algunas aplicaciones. Primero, casi no hay prcticamente ningn letargo de medicin y segundo, no se toma ninguna muestra del fluido del cultivo as que no hay ningn riesgo de contaminar la fermentacin. Medidas de multiplicacin usualmente emplean cuentas microscpicas (para poblacin total) o mtodos de placa (para poblacin viable) para determinar el nmero de clulas por unidad de volumen de cultivo de fluido. D. El Ciclo de Crecimiento En el estudio del desarrollo de cultivos bacteriales, la aproximacin clsica ha sido dividir el ciclo de crecimiento en una serie de fases en base de cambios en el ndice de crecimiento (Fig. 1). Aunque los lmites entre las fases estn usualmente localizados en puntos de infleccin definidos en las curvas de crecimiento con tiempo, las fases escogidas y descritas por diferentes trabajadores no han sido siempre las mismas. An ms, la forma de la curva del ciclo de crecimiento es definitivamente influenciada por el mtodo de medicin. Para esta discusin usaremos las fases descritas por Monod (1949) y Buchanan (1918). En la Fig. 1 stas son: (1) Fase de letargo (fase estacionaria inicial); (2) Fase de aceleracin (fase de aceleracin de crecimiento positiva); (3) Fase crecimiento logartmico (fase exponencial); (4) Fase de retardo (fase de aceleracin de crecimiento negativa); (5) Fase estacionaria (fase estacionaria mxima); (6) Fase de muerte en aceleracin (fase de declive); (7) Fase de muerte logartmica.

A partir de estas fases se crea una imagen bastante general de crecimiento bacterial. En casos individuales cualquiera, o incluso varias, de estas fases pueden estar ausentes, y ocasionalmente un patrn ms complejo de crecimiento es observado. 1. La Fase de Letargo Cuando se transfiere a un nuevo medio, la poblacin bacterial a veces queda constante por un periodo de tiempo el cual puede ser extremadamente corto o puede durar por horas antes de que pueda detectarse un incremento. Ocasionalmente, ocurre un decremento temporal en la poblacin. La terminologa usada en la literatura publicada tiende a ser algo confusa en este punto. Algunos autores usan el trmino letargo para designar la fase 2 (Fig. 1); otros agrupan las fases 1 y 2 bajo el trmino letargo. Juntas, las dos fases representan un periodo de ajuste para cultivo bacterial. 2. La Fase de Aceleracin Despus de la fase estacionaria inicial el cultivo empieza a desarrollarse; muchas generaciones sin embargo, son requeridas antes deque los organismos se hayan ajustado completamente para crecimiento y multiplicacin en un grado mximo en el ambiente nuevo en particular. Quesnel (1960), observando el comportamiento individual de bacterias durante las fases de letargo, encontr que para E. coli desarrollada en un medio sinttico los tiempos de generacin fueron prolongados a la tercera y cuarta (y posiblemente la quinta) generaciones despus de la inoculacin. La segunda fase ha sido representada como un periodo donde todas las numerosas reacciones ligadas que comprometen el metabolismo del organismo se acumulan a un estado estable en un grado mximo y constante. Cuando este estado estable ha sido logrado, o aproximado, el cultivo ha pasado a la fase logartmica (exponencial). Por qu el cultivo no entra inmediatamente a un estado estable despus de transferir? Qu factores influyen la longitud de las fases de letargo? Cmo difieren los organismos de estas fases de los organismos que crecen exponencialmente? Numerosos estudios en los ltimos 70 aos han estado enfocados a estas incgnitas. Las preguntas son relevantes, no slo en la bsqueda para entender los procesos de vida, pero tambin en las fermentaciones industriales donde prolongacin innecesaria de un proceso represente una prdida econmica. Los factores principales del conocimiento moderno de las fases de letargo estn resumidos brevemente aqu. Tratamientos ms completos son dados por Winslow y Walker, Hinshelwood, Monod, Clifton y Lamanna y Mallette. 1. El ndice de crecimiento de las fases de letargo excede al ndice de multiplicacin. Como consecuencia, las clulas individuales son ms grandes en promedio que durante cualquier otra fase del ciclo de crecimiento. La actividad enzimtica, como el consumo de oxgeno, evolucin de calor, o produccin de dixido de carbono, es la misma en una base de unidad por peso seco o base de unidad de nitrgeno durante esta fase de ajuste como durante la fase logartmica, pero, debido al tamao celular ms grande, la actividad por clula es mayor cerca del final de esta fase que en cualquier otro tiempo en el ciclo de crecimiento. 2. La longitud de las fases de letargo depende bsicamente en las especies y en el medio usado para cultivacin. Generalmente, las especies que tienen largos

tiempos de generacin en la fase logartmica tambin muestran fases de letargo ms largas. Medios pobres tambin resultan en fases de letargo largas. Adems, cuando el organismo es transferido a un nuevo tipo de medio, las fases de letargo son ms largas que cuando se hace transferencia a un medio similar. 3. Otra variable importante que influye la longitud de las fases de letargo es la condicin de las clulas que abarcan el inculo. Las clulas que estn en un periodo de crecimiento logartmico en transferencia exhiben poco o ningn letargo cuando son transferidos en el mismo medio. Clulas de la fase estacionaria requieren un periodo relativamente largo de ajuste, y clulas de las fases de declive requieren periodos an ms largos. 4. Otras cosas siendo iguales, las fases restantes del ciclo de crecimiento no son afectadas por la extensin de las fases de letargo. 5. Generalmente, entre ms largo sea el inculo, ser ms corta la longitud de las fases de letargo. 6. Las clulas durante las fases de letargo retardado y exponencial adelantado difieren en sus caractersticas fisiolgicas y qumicas en otros estados del ciclo de crecimiento. El cultivo es algunas veces referido como estar en su juventud fisiolgica en este punto. Estas clulas jvenes difieren de las clulas despus en el ciclo de crecimiento principalmente en que: a. Las clulas jvenes son ms sensibles a cambios ambientales como el calor y agentes qumicos. b. La carga electrofortica en estas clulas es ms baja, y son ms resistentes a aglutinacin por cido La interpretacin moderna de estos hechos ha sido puesta a prueba por Lamanna y Mallette. Ms recientemente, investigacin en el papel de cidos nucleicos en los mecanismos de control de crecimiento ha provedo una mejor comprensin. Del punto de vista industrial donde es necesario obtener el grado general mximo de produccin para utilizar el equipo completamente, una meta lgica es acortar las fases de letargo tanto como sea posible. De los hechos descritos arriba, las medidas para ser empleadas deberan incluir: 1. Usar como el inculo un cultivo activo de crecimiento, generalmente un cultivo de 16-24 horas en su fase de crecimiento exponencial. 2. Usar en la serie de inculo, un medio de esta misma composicin como se usa en la fermentacin a gran escala. 3. Usar inculos relativamente grandes, casi siempre de un 5% del volumen de escala completa. 3. Fase Logartmica Si el logaritmo de alguna cantidad de crecimiento, masa celular o volumen celular, por ejemplo, est puesto contra el tiempo, esa porcin de la curva de crecimiento que cae en lnea recta de una cuesta positiva es llamada la fase logartmica o exponencial (fase 3 en Fig. 1). La opcin de crecimiento variable determinar los lmites exactos de la fase logartmica observada debido a su ndice de crecimiento (incremento en protoplasma) y el grado de divisin (incremento en nmeros) rara vez quedan en balance en cultivos microbiales. Durante la fase logartmica para divisin, el tiempo promedio de generacin sigue siendo constante.

El ndice de crecimiento especfico puede ser definido como el incremento en masa bacterial por unidad de tiempo por unidad de masa bacterial. As, para esta fase escribimos (6-1a) O, en la forma integrada (6-1b) (6-1c) Donde X0 es la concentracin de organismos, usualmente como peso seco por litro de cultivo X00 es la concentracin inicial de organismos en tiempo cero, es el tiempo en _____ y kc es el ndice de crecimiento especfico durante la fase logartmica, tambin ______ el ndice de crecimiento constante. El tiempo necesario para duplicar la masa bacterial puede ser derivado de la ecuacin (61b). Si X0/X00 = 2, entonces (6-2) Donde g es el tiempo de duplicacin. Seguir la densidad bacterial durante el ciclo de crecimiento no da el mismo valor de ___ as como cuando se sigue a la concentracin celular. El g aparente tambin vara con el tipo de medicin. Las constantes para crecimiento y para multiplicacin pueden aproximarse una de la otra por un corto periodo, pero eso ocurre slo cuando el tamao celular promedio queda constante. Slo bajo estas circunstancias podemos hablar de crecimiento balanceado. Cuando nmeros bacteriales son la variable medida, el g entonces determinado es el tiempo promedio de generacin, o es una aproximacin cercana a ste. Sin embargo, slo cuando ocurre crecimiento por fisin binaria podemos hablar del tiempo de generacin. De otra manera, g es el tiempo de duplicacin, que es simplemente un nmero determinado matemticamente anlogo a las constantes de vida media encontradas en degradacin radioactiva. Aunque muchos microbilogos tratan a la fase exponencial como un periodo de estado estable en donde se logra crecimiento balanceado, este no es el verdadero estado _______. Ni el tamao celular ni la composicin celular queda constante durante esta fase. Perret ha propiamente descrito a la fase logartmica como ese periodo en el cual la suma de todos los componentes celulares no vaporizados sustancialmente en unos 100110C incrementa a un grado que, dentro de los lmites de error experimental, es ms o menos proporcional a su propia magnitud. La muerte es un factor durante la fase logartmica. Powell, por ejemplo, ha encontrado que ms del 99% de las clulas nacidas durante esta fase son viables.

4. Fase de Retardo A medida que el medio de cultivo va escaseando de sustancias nutrientes esenciales y se acumulan productos metablicos txicos, las clulas se vuelven progresivamente menos capaces de mantener el alto ndice de crecimiento especfico logrado durante la fase logartmica. El ndice de crecimiento se desacelera. En esta regin la forma de la curva de crecimiento puede variar ampliamente. A veces el crecimiento contina en un grado muy alto y entonces cesa abruptamente si la fuente energa se termina. En otros casos la fase logartmica es comparablemente ms corta y la fase de retardo es larga. Esto puede ser observado con frecuencia, por ejemplo, en fermentaciones donde el cido es producido pero el pH no es controlado. La especie es tambin un factor importante en determinar la duracin de esta fase. Es durante la fase de retardo que la muerte de las clulas bacteriales comienza a ser importante. La variable de crecimiento que es medida en este punto tiene una influencia extraordinaria en la aparente duracin de esta fase. Si se determina la concentracin de clulas como clulas viables por unidad de volumen, la longitud de esta fase de desaceleracin es comparable con la de las fases anteriores. Por otro lado, si la masa total de clulas por unidad de volmenes la variable medida, la fase puede parecer extremadamente larga. En este ltimo caso, slo cuando el grado de lisis de clulas muertas ha igualado al grado de regeneracin de nuevo protoplasma bacterial el cultivo parece pasar a la siguiente fase. 5. La Fase Estacionaria La fase estacionaria abarca el periodo durante el cual la poblacin bacterial parece permanecer constante en un nivel mximo. Como con la fase de retardo, la posicin y duracin de esta fase son determinadas hasta cierto punto por el crecimiento variable medido. La importancia de esta fase vara con fermentacin. Una fermentacin hornada para alcohol es terminada poco despus de que las clulas viables han llegado a su mxima concentracin; se produce muy poco alcohol adicional despus de esto. Por otra parte, en algunas fermentaciones antibiticas el periodo ms importante de formacin de productos ocurre despus de que se ha alcanzado la fase estacionaria. La poblacin mxima lograda parece ser determinada por muchos factores que actan simultneamente. En muchos casos, la concentracin de una sustancia esencial, especialmente la concentracin de la fuente de energa, limita el crecimiento. La concentracin de oxgeno o de un nutriente orgnico o inorgnico puede tambin ser influyente. En concentraciones bajas, la produccin total de microorganismos es esencialmente proporcional a la concentracin inicial de un nutriente esencial. An cuando todos los alimentos son suplidos en exceso, otros factores, especialmente la acumulacin de productos txicos, actan para limitar el alcance del crecimiento. Ambos factores pueden estar involucrados en concentraciones de intermediarios. Se ha sugerido que la apretadura fsica es un factor en donde ocurre que cada clula requiere un cierto volumen mnimo de medio (espcio M) para crecimiento. Sin embargo, en algunos casos donde la apretadura ha sido asumida, aeracin insuficiente es un factor limitante ms probable. Tambin se ha sugerido que el crecimiento requiere de la concentracin de alimento por unidad de superficie celular para estar por encima de un cierto valor mnimo. La apretadura es rara vez un factor en fermentaciones industrailes;

en tales concentraciones bacteriales altas los ndices de crecimiento es probable que queden poco econmicos por largos periodos. 6. Las Fases de Muerte La fase estacionaria es seguida por la fase de muerte acelerada y la fase de muerte logartmica respectivamente. Aunque la muerte bacterial inducida por agentes fsicos o qumicos ha sido estudiada extensivamente, sorprendentemente se ha puesto poca atencin a estas fases de declive que son la culminacin normal de crecimiento en medios ordinarios. Los ndices de crecimiento y muerte no son observados usualmente de manera separada en estudios bacteriales. Donde la concentracin de clulas viables es medida en intervalos, se aprende de la diferencia neta entre los ndices de multiplicacin y muerte. De otra forma, una serie de conteos totales de clulas lleva slo al ndice de multiplicacin. El ndice de crecimiento especfico puede ser determinado de una serie de medidas de densidad _______ slo si el porcentaje de clulas viables es tambin conocido. Ambas curvas de poblacin total y viable tienden a ser irregulares durante las fases de declive. E. Las Ecuaciones de Crecimiento de Monod Las ecuaciones (6-1a), (6-1b) y (6-1c) fueron escritas para crecimiento en la fase logartmica. En su lugar ecuaciones generales de crecimiento similares pueden ser escritas ahora: (6-3a) Y (6-3b) Cuando se usa sin un superndice, X designa la concentracin de organismos como peso seco de clulas por unidad de volumen de cultivo lquido. Ntese la distincin entre el ndice de crecimiento dX/d y al ndice de crecimiento especfico (1/X) (dX/d) o k. El primero es el ndice actual del incremento en concentracin de organismos mientras que el ltimo es el ndice del incremento por unidad de concentracin de organismo. Ntese tambin que en las ecuaciones anteriores (6-1) y (6-2) donde se us kg, se asumi la fase logartmica y este trmino fue esencialmente constante. En las ecuaciones ms generales, (6-3a) y (6-3b), se sustituy a k. Ya que k vara a lo largo del ciclo de crecimiento, no puede llamarse propiamente una constante del ndice de crecimiento, a pesar de la prctica prevalerte. Una constante variable es una contradiccin de trminos, y la designacin de coeficiente de ndice de crecimiento o ndice de crecimiento especfico es preferible para k. Se asume generalmente que el ndice de crecimiento especfico est relacionado a la concentracin de una sustancia de crecimiento esencial por una ecuacin relativamente simple (6-4)

Donde K es la constante de Michaelis-Menton, knm es el ndice de crecimiento especfico, y Xa es la concentracin del nutriente de limitante. Esta ecuacin, la cual es de la misma forma que la relacin entre actividad enzimtica y concentracin de sustrato, fue aplicada para microorganismos por Monod. Originalmente, la ecuacin (6-4) fue aplicada a cultivos donde el nico nutriente limitante fue glucosa o alguna fuente similar de carbono y energa. Continuos experimentos de cultivo han mostrado, sin embargo, que la ecuacin tambin se aplica cuando el nutriente limitante es un amino cido esencial como el triptfano o arginme. Adems se aplica cuando la concentracin de nitrgeno inorgnico o fosfato o incluso sulfato es limitante. La forma general de la funcin es mostrada en la Fig. 2. Monod tambin mostr que cuando el crecimiento es limitado por la concentracin de la fuente primaria de carbono y energa, la produccin de bacterias es linealmente proporcional a la cantidad de sustrato utilizado. As, para un periodo de crecimiento finito, una constante de produccin, Y, es definida donde Y = masa formada de organismos/masa utilizada de sustrato (6-5) En un sistema dado se asume frecuentemente que la produccin Y tiene un valor especfico y nico en cada ndice de crecimiento. Mientras que esto puede ser cierto para algunas fermentaciones aerbicas, la produccin puede variar considerablemente con la concentracin de sustrato y el ndice de crecimiento, y la asuncin deberan ser verificados para cada sistema investigado. Estrictamente, si K en la ecuacin (6-4) es finita, el crecimiento bacterial no puede ir a travs de una verdadera fase logartmica; asumir una regin de crecimiento logartmico es equivalente a asumir que K = 0 en la ecuacin (6-4). Como lo indic Northam, son comunes valores bajos de K relativa a Xa, y sigue a partir de (6-4) que el crecimiento bacterial terico frecuentemente puede ser cercanamente aproximado por asumir el crecimiento logartmico. A medida que el crecimiento contina, sin embargo, Xa disminuye, y la curva de la ecuacin (6-4) se desva incrementadamente de la curva obtenida cuando K = 0. F. Limitaciones y Modificaciones de las Ecuaciones de Crecimiento de Monod Si la ecuacin (6-4) es trazada con un ndice de crecimiento especfico k0 como una funcin de concentracin de nutrientes Xg, la curva pasa a travs del origen. (Lnea slida de la Fig. 2) Lamanna y Mallette han llamado atencin al hecho de que aunque la curva descrita por la ecuacin (6-4) generalmente encaja bien con los datos experimentales, los datos en concentraciones bajas no son adecuados para establecer si la curva en realidad pasa a travs del origen o si __________ en algn valor positivo en la abscisa. Si este es el caso, este valor positivo representa una concentracin mnima de glucosa (u otro nutriente) bajo el cual el crecimiento es imposible. Perret ha sealado otra limitacin importante en la ecuacin (6-4): aplica al limitante y no a un ndice de crecimiento especfico transitorio. La concentracin de nutrientes vara durante el crecimiento de la hornada, y generalmente cae tan rpido que las concentraciones de componentes dentro del sistema celular no tienen tiempo de llegar a sus niveles de estado exponencial. As, el ndice de crecimiento especfico que es

observado para una concentracin dada de nutrientes ser mayor que el verdadero ndice de crecimiento especfico. Perret llama a este fenmeno hysteresis de ndice de crecimiento, y l concluye que la curva de la Fig. 2 debera ser reemplazada en realidad por una familia de curvas. Tcnicas de cultivo continuas han sido utilizadas en un intento para verificar la ecuacin (6-4). Resultados experimentales tienden a confirmar la ecuacin en ndices de crecimiento relativamente bajos, pero el acuerdo es slo justo en los ndices de crecimiento altos. Contois sugiere que la densidad bacterial tambin influye el ndice de crecimiento especfico y que la ecuacin (6-4) debera modificarse a (6-6) Donde K2 es una constante. Contois encuentra que sus propios datos y otros publicados encajan mejor con (6-6) que con (6-4). Una segunda modificacin tambin ha sido propuesta, (6-6b) Pero los datos hasta ahora no son lo suficientes para determinar si Ka es real o no. II. LA CLULA BACTERIAL A. La __________ Cintica de Perret Las cinticas qumicas no pueden ser consideradas aparte de la estequiometra y las modinmicas; las cinticas de fermentacin no son la excepcin. Microorganismos en desarrollo interactan con los ___________ en un intercambio activo de materiales y energas, y las leyes de qumica y fsica aplican en todos aspectos. Hasta muy recientemente, sin embargo, la aplicacin de las leyes de termodinmicas para el fenmeno de crecimiento no ha sido particularmente exitosa o esclarecedora. Parte de la dificultad ha venido del hecho de que la termodinmica clsica es derivada de estudios de sistemas idealmente cerrados, mientras que organismos vivientes deben generalmente ser tratados como sistemas abiertos. Las termodinmicas de sistemas de estado estable (definidos como sistemas abiertos en equilibrio dinmico con su ambiente) son una disciplina relativamente nueva, y su aplicacin a fenmenos biolgicos apenas ha comenzado. El primer paso necesario, la construccin de un modelo cintico vlido para una poblacin de crecimiento bacterial, ha tomado parte por Perret en un escrito pionero importante. La descripcin que sigue est basada en su escrito, se invita a que el estudiante se refiera a ste para ms detalles. Considere primero un sistema qumico abierto de volumen fijo. Las palabras clave aqu son de volumen fijo, y aunque este sistema pueda resultar ser particularmente poco satisfactorio como un modelo cintico, el modelo final llegar en examinar primero las propiedades de sistemas ms simples, aunque menos satisfactorios, que empiezan con el sistema linear simple de la Fig. 3. En la Fig. 3 el smbolo A representa el material fuente en solucin homognea y el material hundido (sink) en una solucin homognea. A puede corresponder a algn

material nutriente, E a un producto metablico, y la solucin homognea para el medio lquido que rodea las clulas bacteriales. Para propsitos de esta discusin, todas las reacciones estn referidas como reversibles, homognea, unimolecular, y, a menos que se mencione antes, de primer orden. La presin y temperatura se asume que son constantes. Como se indica con las flechas marcadas de la figura, hay un flujo de material a travs del sistema de izquierda a derecha. Este flujo resulta de asumir que la concentracin del material fuente est sobre el nivel, y la concentracin del material hundido (sink) est por debajo del nivel al cual los compuestos pueden estar en equilibrio uno con otro. Las lneas verticales en la Fig. 3 representan la capa limitante que encierra el sistema y puede de hecho ser una membrana o interfaz. La capa limitante es permeable a A y E, pero es impermeable a los compuestos intermediarios B, C y D. El sistema abierto linear simple aproxima la biofase de un cultivo bacterial en muchos aspectos importantes. Materiales fuente (nutrientes) son tomados del medio que los rodea. Los materiales son transformados por una serie de pasos qumicos (metabolismo) y los productos resultantes son descargados como desperdicios. En un ambiente constante el sistema tiende a un estado independiente del tiempo. Ah, sin embargo, termina la similitud. Cuando un sistema qumico abierto de volumen fijo es mantenido en un ambiente constante, tiende hacia un estado estable en el cual su masa queda sin cambios, mientras que la poblacin bacterial en desarrollo incrementa su masa y volumen logartmicamente. El sistema propuesto no puede, entonces, servir como un modelo cintico bacterial. El sistema en expansin prueba ser mucho ms satisfactorio como modelo. En este sistema la biofase bacterial es una entidad delimitada la cual puede incrementar su volumen y masa en grados iguales de su propio acuerdo. Ya que cada componente tiende a asumir un valor constante, esta expansin endgena es un crecimiento balanceado. Si la membrana que une al sistema en la Fig. 3 es referido como elstico, solvente puede permear la membrana casi de manera instantnea, y A y E pueden permearla mucho ms lento. Con un sbito incremento en volumen, un solvente del exterior inmediatamente llena el espacio extra y diluye todos los componentes dentro del sistema. Para reestablecer el estado estable, la concentracin de A comienza a elevarse, y esto es seguido sucesivamente por los correspondientes incrementos en B, C y D. El resultado es un gradiente ms escarpado de potenciales de flujo durante este estado de transicin que durante el estado estable. Si la mereasa en volumen es gradual y continua en lugar de sbita, el gradiente de potencial de flujo nunca se desva mucho de los valores de estado estable. En grados mayores de expansin, sin embargo, hay una diferencia pequea pero definitiva entre las concentraciones actuales y las de estado estable de los componentes. Las concentraciones actuales en cualquier instante son iguales a las concentraciones de estado estable caractersticas del volumen ms pequeo que existi algn tiempo atrs. Este tiempo retardado, el tiempo que pas desde que el sistema tuvo un volumen menor, cuenta para la curva de crecimiento hysteresis descritas anteriormente. Debe recordarse que el cultivo bacterial como un todo est bajo consideracin aqu y no al organismo solo. A pesar de las fluctuaciones en los tiempos de multiplicacin individuales, el volumen total incrementa continuamente, y las concentraciones internas son esencialmente constantes en crecimiento balanceado.

El sistema en expansin finalmente propuesto por Perret es el que se muestra en la Fig. 4. Incluye varios tipos de rutas y enlaces que son posibles, y pueden, dentro de sus obvias limitaciones, ser consideradas como el modelo de cintica elemental de una biofase bacterial, y posiblemente de otros sistemas biolgicos tambin. En la Fig. 4 la ruta principal procede A, A, B, C, hasta F, J es un nutriente alternativo mayor, y la secuencia J, J, K, C, hasta F representa una ruta alternativa mayor. Las dos rutas mayores controlan el crecimiento del sistema. M es un nutriente menor. Est metabolizado a Q por medio de una ruta menor, los componentes de los cuales comprometen una fraccin insignificante de la masa total. La ruta menor est ligada a la ruta mayor a travs de la reaccin agrupante O D que est tan despegado que los ndices de flujo a travs de las dos rutas estn virtualmente independientes la una de la otra. Bajo ciertas circunstancias, sin embargo, las rutas menores pueden contribuir significativamente al flujo total. La secuencia que queda E X Z Z con su difurcacin Y es extremadamente importante. Por el momento, sin embargo, ignoraremos la bifurcacin Y mientras nos concentramos en la parte Z. Si la secuencia de bifurcacin a Z termina internamente, la secuencia principal tiende hacia un estado estable en un ambiente constante, y las solubilidades de X y Z determinan el destino de la secuencia de bifurcacin. Ahora se hacen dos asunciones importantes: (1) Z siempre queda bien abajo del nivel donde estara en equilibrio con X, y (2) el volumen del sistema es de alguna manera proporcional a la cantidad total de Z y es controlado por eso. El mecanismo de este control es inmaterial, pero por simplicidad Perret supone que Z forma la membrana limitante del sistema. La membrana incrementa su rea por intussuscepcin (intussusception); para el cultivo como un todo, sin embargo, el cociente de volumen al rea de superficie no cambia durante la expansin. Las lneas de zig-zag son usadas para unir al sistema en la Fig. 4 para mostrar que el volumen ya no es constante. Para una concentracin constante de A las siguientes declaraciones acerca de la ruta A a E y la secuencia de bifurcacin a Z son vlidas (la ruta a Y an es desconocida): 1. Flujo por unidad de volumen, o grado de flujo a travs de la secuencia principal, es constante. 2. La concentracin de D es entonces constante. 3. El cociente de formacin de Z por unidad de volumen es entonces constante. 4. Cada incremento en Z resulta en un incremento correspondiente en el volumen del sistema. 5. El incremento en el cociente de volumen es entonces proporcional para el cociente de formacin de Z. 6. As, el cociente de incremento del volumen (o masa) del sistema est en cualquier instante proporcional al volumen (o masa). El enunciado 6 un sistema que est creciendo logartmicamente, es decir donde el ndice de crecimiento especfico es constante. Tambin sigue que el valor de este ndice de crecimiento especfico disminuye a medida que la concentracin de A disminuye. Ntese que el sistema descrito hasta ahora puede crecer logartmicamente sin autocatlisis. Incluyendo atocatlisis en el sistema, sin embargo, el ndice de flujo tiende hacia un valor mximo limitante a medida que la concentracin de A se incrementa. Incrementos mayores en la concentracin de A no resultan en ningn incremento en el

ndice de crecimiento especfico. Este es el comportamiento actualmente observado en cultivos bacteriales. Se incluye autocatlisis asumiendo que X en la rama lateral cambia a Y as como a Z, y que Y (o un derivado de Y) acta como un catalizador para la reaccin B C. El catalizador est denotado como cd en la Fig. 4. Por un anlisis cuidadoso de este sistema, puede mostrarse que en grados mayores de expansin el catalizador se acerca a un estado de estar continuamente saturado con sustrato, y la reaccin B C entonces se aproxima a orden cero. As, mayores incrementos en la concentracin de A no resultan en incrementos en el ndice de flujo a travs del sistema. Bajo estas circunstancias la reaccin B C puede ser referida como una reaccin maestra la cual limita el grado de este proceso. Perret contina para demostrar que hay patrones de comportamiento que estn implcitas en el modelo cintico del sistema en la Fig. 4 que se parecen mucho al ciclo de crecimiento bacterial, incluyendo las fases de letargo, aceleracin, logartmica, desaceleracin, y estacionaria. La forma general de la relacin entre el ndice de crecimiento y la concentracin de nutrientes pueden ser deducida nicamente del modelo cintico. Durante el estado exponencial el ndice de crecimiento especfico, k, de un sistema en expansin autocatalizado est relacionado a la concentracin de nutrientes, A, y la concentracin de produccin de desperdicios, E. En general, con pequeas concentraciones de A habr una relacin de primer orden entre k y la concentracin de A; a medida que la concentracin de A incrementa, se acerca a una relacin de orden cero, y el ndice de crecimiento se acerca asintticamente un valor mximo limitante. La curva de la Fig. 2 es una de muchas que encajan en esta descripcin. La concentracin que gobierna el ndice de crecimiento especfico no es la concentracin real de A en el medio, pero ms bien es una concentracin efectiva de A. La concentracin efectiva aqu est definida como la diferencia entre la concentracin real de A en el medio y la concentracin que estara en equilibrio con la concentracin dada de E en el medio. As, el modelo cintico requiere que el cociente de crecimiento caiga a cero antes de que el nutriente A est consumido totalmente si E est presente en el medio. Sin embargo, la presencia de rutas metablicas alternadas complica este anlisis. Finalmente, debe de notarse que en el modelo cintico propuesto, es enteramente posible que el ndice de crecimiento especfico puede quedar virtualmente constante a pesar de cambios sustanciales en las concentraciones de nutrientes, como en la fase logartmica. B. Control de Patrn de Reacciones Dentro de las Clulas Las clulas bacteriales sintetizan y degradan una variedad de compuestos, muchos de ellos extremadamente complejos, en secuencias largas de reacciones puntuales. Las rutas convergen donde interactan dos intermediarios, y divergen donde un intermediario tiene dos o ms posibles funciones. Muchas combinaciones alternadas de rutas pueden ser capaces de producir los productos de complejo final, y cada especie tiene su propio set caracterstico de patrones de reaccin disponibles,

Los ltimos quince aos han visto un notable progreso en elucidar las recciones enzimticas especficas por las cuales amino cidos, purinas, y pirimidinas son sintetizados. Un alto grado de integracin es obvio, ya que las rutas individuales de biosntesis deben estar coordinadas una con otra y con las reacciones productoras de energa de la clula. Ms an, la clula se ajusta a s misma a cada cambio en su ambiente (como durante el ciclo de crecimiento) y de alguna manera, a partir de las enzimas disponibles en su arreglo gentico, selecciona slo aquellas enzimas que necesita para crecimiento ptimo en la biosntesis. Si, por ejemplo, un amino cido ya est presente en el medio, la clula lo utiliza ms que ocuparlo en la prctica menos eficiente de sintetizarlo an siendo capaz de hacerlo. Se ejerce control sobre ndices as como sobre rutas. Ms recientemente, se han hecho inicios para entender la naturaleza de algunos de estos mecanismos de control y del papel que juegan los cidos nucleicos en ellos. Con el riesgo de sobre-ejemplificacin, algo del conocimiento actual y puntos de vista de este tema importante estn resumidos aqu. Cuatro niveles moleculares de organizacin aparentemente interactan en el flujo de informacin entre el ncleo bacterial y el citoplasma (Fig. 5). En la biosntesis de un producto final, un amino cido, por ejemplo, cada paso sucesivo requiere su propia (enzima) catalizadora especfica. Cada enzima que una clula bacterial es capaz de hacer requiere a cambio que la clula lleve la informacin para hacerla de generacin en generacin. El transportador gentico es el citrn, el cual se asume que acta como una plantilla, cuando es necesario, para impartir especificidad al ARN. Aparentemente, despus de que el ADN de citrn ha impartido especificidad al ARN, el ARN puede actuar independientemente en sntesis protenica sin estar en contacto con el ADN. La mayora del ARN de la clula bacterial est unido como partculas ribosomales que tienen pesos moleculares de mucos millones. Las partculas ribosomales han sido identificadas como el sitio de sntesis protenica, y presumiblemente las plantillas de ARN son responsables por la especificidad de las protenas. El conocimiento actual no nos dice si la plantilla est unida firme o desprendidamente al ribosoma. Si est firmemente unida, cada ribosoma es el sitio especfico para la sntesis de una protena dada. Si el agrupamiento est suelto, las plantillas son probablemente productos de vida corta, y los ribosomas actan como sitios no especficos para sntesis. Al menos cuatro pasos son requeridos en la sntesis de una protena especfica: (1) Los amino cidos necesarios, si no estn presentes ya, deben ser sintetizados; (2) los amino cidos deben estar arreglados en la secuencia especfica requerida; (3) deben hacerse los enlaces pptidos entre cidos; (4) la cadena pptida debe ser doblada y reticulada en una secuencia especfica. Las bacterias se ajustan a su ambiente, no por casualidad o a propsito, pero ms bien por una regulacin automtica de sus actividades enzimticas. Las bacterias han evolucionado de tal manera que esta regulacin automtica al ndice de crecimiento ms alto posible en el ambiente dado y para mxima eficacia. Cuando el ndice de crecimiento mximo no es compatible con eficiencia mxima, los organismos tienden hacia el ndice de crecimiento mayor a pesar de que baje su eficiencia. Generalmente, los ajustes sirven a las bacterias para utilizar los nutrientes disponibles; se forman cantidades suficientes de todas las enzimas e intermediarios metablicos, pero se evitan excesos de estos. Algunos

de los mecanismos de control descubiertos parecen trabajar en una sola enzima mientras que otros movilizan una ruta metablica entera o quitarla de la accin. La mayora de los mecanismos de control metablicos que han sido estudiados caen en las clases principales: (1) la ley de accin de masa operando en reacciones de equilibrio reversible; (2) aquellos mecanismos que involucran la sntesis de una enzima; (3) aquellos mecanismos que regulan el ndice de actividad enzimtica; y (4) aquellos mecanismos que actan en la permeabilidad de la clula para regular su arreglo qumico ______ cada uno de estos mecanismos ser descrito brevemente sin ejemplos, pero los papeles de adaptacin _______ , y seleccin natural en estos mecanismos estn ms all del espectro de este captulo. En una secuencia de reacciones enzimticas reversibles, el grado para cada reaccin depende, por la ley de accin de masa, de las concentraciones intracelulares de su sustancia y producto. Ya que cada producto intermediario es el sustrato para la siguiente reaccin, el grado de sntesis del producto final puede depender en: la concentracin intracelular del producto final, el grado al cual el producto final es utilizado, el grado de una reaccin que establece el ritmo dentro de la ruta, o, si el sustrato mismo originado viene de alguna otra ruta sinttica dentro de la clula, el grado al cual esto es provedo. Si excesos de intermediarios aparecen en cualquier punto, se desaceleran reacciones anteriores por la ley de la accin de masa hasta que se usen los excesos. Es particularmente anlogo a un convoy militar que no puede ir ms rpido que su vehculo de motor ms lento (reaccin que establece el ritmo, incluyendo abastecimiento y borrado), y es tambin particularmente anlogo al flujo del fluido en una pipa donde el ritmo es determinado por la presin detrs de l (concentracin de sustrato) o la succin delante de l (concentracin de producto). En el segundo grupo de mecanismos incluimos la induccin de enzimas y represin de enzimas. Por induccin, el ndice de sntesis enzimtica puede ser simulado tanto como muchos dobleces de cien (hundred-fold). Usualmente, el inductor es el sustrato especfico de la enzima o un compuesto relacionado, pero algunas sustancias aparentemente no relacionadas tambin parecen actuar como inductores en algunos estudios. Represin enzimtica, la cual est definida como la reduccin del grado de sntesis de una enzima especfica, es el opuesto a la induccin. Es frecuentemente un fenmeno de feed-back donde un metabolito producido en el final de una ruta metablica acta como un represor para la enzima de un paso anterior. As, el producto final puede prevenir la sobreproduccin de enzimas y metabolitos en una forma ms rpida y directa que la posible a travs de un simple respaldo provedo por la ley de accin de masa. La sntesis de muchas enzimas puede inclusive ser inhibida por el mismo represor. Estudios recientes de las cinticas de induccin para muchas enzimas muestran que despus de la adicin del inductor hay un retraso de unos tres minutos antes de que aparezca la enzima. Este retraso no es un efecto de permeabilidad. Se ha sugerido que un sistema represor de inductores acta aqu y que el retraso es principalmente debido al tiempo requerido para degradar a la forma represora de ARN, y finalmente combinar al ARN con ribosomas. La tercera clase de mecanismos incluye tanto estimulacin como inhibicin de actividad enzimtica. La estimulacin de la actividad enzimtica ocurre a travs de saturacin de la enzima, y tambin por otros medios. La inhibicin de enzimas especficas es

generalmente de naturaleza feed-back donde uno de los productos finales de una ruta sinttica acta para inhibir la actividad de una enzima en el principio de la ruta. En muchos casos de inhibicin por feed-back, la evidencia experimental no es suficiente para mostrar si la formacin de la enzima es reprimida o su la actividad de la enzima es inhibida. Los dos mecanismos difieren bastante en funcin fisiolgica. El control por represin es el mecanismo que acta ms despacio por l la clula lega al arreglo enzimtico para crecer en un ambiente dado. Por otro lado, el control por inhibicin de actividad enzimtica ayuda a integrar las diversas actividades sintticas y catablicas de la clula para que ninguna reaccin se salga de lugar. ______, el control puede ejercerse por el manejo del ambiente intracelular. Algunos compuestos pueden ser excluidos de la clula, algunos pueden entrar a la clula por difusin simple, y otras pueden ser introducidas a la clula y concentrarlas ah por mecanismos de transporte activo llamados permeasas. Mecanismos similares probablemente acten para minimizar la prdida de intermediarios metabolitos de la clula.