Curso de Anlisis Instrumental Instituto de Ingeniera Qumica Facultad de Ingeniera - 2007

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Ampliamente utilizada Gran sensibilidad Determinaciones cuantitativas exactas

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Determinacin de compuestos no voltiles (alto Peso Molecular, iones metlicos) o termolbiles. Aplicabilidad a sustancias de inters general (industria, salud, medioambiente). Aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, etc.

Juan Bussi

Solventes como Fase Mvil

Interacciones qumicas entre la muestra, la fase mvil y el relleno de la columna, determina el grado de migracin y separacin de componentes contenidos en la muestra. Compuestos con interacciones ms fuertes con la fase mvil que con la fase estacionaria eluirn ms rpidamente de la columna (tiempos de retencin menores). La fase mvil puede ser alterada en el transcurso del anlisis para manipular las interacciones de los componentes de la muestra con la fase estacionaria. Elucin Isocrtica: composicin constante de la fase mvil Elucin por gradiente: los distintos analitos son eludos con incremento de la composicin de la fase mvil en la fase orgnica. Elucin politptica: se combinan varios tipos de tcnicas.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

Polaridad creciente
Insoluble en agua No Polar No Inico Polar 102 Adsorcin
(Reparto en fase inversa)

Definiciones Coeficiente de distribucin K = cS/cM Tiempo de retencin: tM Velocidad lineal media v = u x ft Velocidad de migracin u v=ux 1 1 + KVS/VM

Soluble en agua Inico

Reparto
(Reparto en fase normal)

Intercambio inico

PesoMolecular

10

104 Exclusin por tamao (Penetrabilidad sobre gel)

106

105

(Filtracin sobre gel)

Factor de capacidad de una especie A: kA = KA VS/VM tR tM kA = tM

Distintos mtodos son complementarios.

Eficacia de columnas para HPLC

Factor de selectividad para dos especies A y B (tR)B tM = KB/KA = kB/kA = (tR)A tM Altura de plato terico H = 2/L N de platos tericos N = L/H

Conceptos de Altura de Plato Terico y factores que lo afectan como en otras cromatografias. H = A + B/u + (CS + CM) u (ecuacin de Van Deemter) Velocidades lineales menores que en CG Altura de plato menor que en GC (1 orden de magnitud). Longitud de columnas menor (25 a 50 cm).

Efecto del tamao de partcula del relleno CS y CM dP2 Aumento de eficiencia con disminucin del tamao de partcula (tamao usuales entre 2 y 10 m

Ensanchamiento extracolumna
Debido a diferencias de velocidad entre distintas capas del lquido que se desplaza en tubos de inyeccin, de conexin y detectores. Gradientes no se compensa por difusin. Hex = r 2u 24DM Reduccin del dimetro de tubos a menos de 2.5 mm.

Efecto del tamao de muestra

Ms notorio en Adsorcin y Reparto

Instrumentacin
Elevadas presiones para alcanzar caudales necesarios. Equipamiento sofisticado y caro.

Recipientes para una o ms fases mviles

De vidrio o acero de 0.2 a 1 L

Cmara de mezcla para disolventes Ventajas de la elucin con gradiente (relacin variable de volmenes de dos o ms disolventes) Mejora de resolucin en tiempos de anlisis ms cortos.

Sistemas de pretratamiento de fases mviles

Para eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin desgasificacin por vaco calentamiento agitacin inyeccin de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio). Filtros para polvo y partculas slidas en suspensin.

Sistemas de bombeo
Generacin de presiones superiores a 6000 psi. Cada de presin en una columna: : viscosidad Lu P = dP2

Mtodo comn: filtracin a vaco a travs de filtro millipore de tamao de poro muy pequeo (eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin).

: parmetro adimensional (valor cercano a 500 para columnas bien empacadas) dP: dimetro de partcula del relleno

Flujo libre de pulsaciones (minimizacin de errores de medicin) Variaciones menores a 1% son normales Intervalo de caudales entre 0,1 y 10 mL/min Control y reproducibilidad de caudal mejor al 0,5%. Cambio de volumen de lquidos y sellos al cambiar la contrapresin: 1 dV = V dP T Caudal = Dimetro Pistn*desplazamiento - *P*V-P*compr.sellos y
burbujas.

Coeficientes de compresibilidad isotermos de algunos solventes usados en HPLC.

Solvente Metanol Agua n-hexano n-octano Isopropanol cloroformo Dietil ter

(10-11Pa-1) 120 45 150 100 100 105 185

En sistemas de bombeo por jeringa (250 mL) la compresin del solvente (a 400 atm) puede requerir varios mL de desplazamiento del pistn. Programacin por microprocesadores que corrige desvos

vara para mezclas de solventes en anlisis con elucin por gradiente

Bombas recprocas Componentes resistentes a corrosin (juntas de acero inox o tefln). Altas presiones no suponen riesgo de explosin (s riesgo de incendio). Las ms utilizadas Movimiento cclico de uno o ms pistones con vlvulas de entrada y salida. Elementos compresibles en el circuito atenan variaciones. 2 Pistones es la opcin ms adecuada Ventajas: pequeo volumen interno (35 a 400 L), altas presiones (>10000 psi), fcil adaptacin a sistemas por gradiente y caudales constantes e independientes de la contrpresin de la columna y viscosidad del disolvente. Desventajas: flujo con pulsaciones.

Prdidas en vlvulas Funcionamiento normal:

prdidas pequeas y constantes Mayor incidencia a bajos caudales (L/min). Fabricantes suministran diagnsticos para deteccin de prdidas

Bombas de desplazamiento
Cmara con un mbolo impulsado por un motor Ventajas: flujo libre de pulsos, independiente de viscosidad y contrapresin Desventajas: capacidad de bombeo limitada (0.25 L), poco prctica para reposicin y cambio de disolvente.

Test para prdidas

Reemplazo de columna por una vaca de V=1.5 mL Llenado con disolvente y tapado. Prender la bomba hasta que la presin alcanza 300 atm. Apagar la bomba y registrar cada de presin en funcin del tiempo (normal < 2 atm/min)

Bombas neumticas Ventajas: baratas Exentas de impulsos Desventajas: Capacidad limitada y de presin de salida. Caudal dependiente de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin. No sirven para elucin con gradiente. Presiones menores a 2000 psi. Control de caudal Medicin de caudal mediante cada de presin a travs de un tubo en la salida de la bomba. Programa de Ordenador

Sistema de inyeccin de muestra

Volmenes pequeos para evitar ensanchamiento de picos (dcimas de L a 500 L).

Inyeccin manual.
Sencilla Evitar despresurizacin (microjeringas capaces de resistir 1500 psi). Inyecciones a flujo detenido Reproducibilidad: dispersin 2%-3% o mayor

Inyeccin con bucles

Ventajas Inyeccin a presiones de hasta 7000psi Precisin de dcimas por ciento. Volmenes de bucles entre 0,5 y 500 L.

Columnas
Tubos rectos de acero inoxidable Tubos de vidrio hasta presiones de 600 psi Longitud entre 10 y 30 cm Acoplables Dimetro interno entre 4 y 10 mm Tamaos de partculas entre 5 y 10 m Columnas comunes: longitud 25 cm, dimetro interno 4.6 mm, relleno de partculas de 5 m: 40000 a 60000 platos/metro Columnas de alta eficacia de menores dimensiones con hasta 100000 platos/metro.

Precolumnas
Eliminacin de materia en suspensin y componentes que se unen irreversiblemente al relleno. Saturacin del solvente con la fase estacionaria (minimiza prdidas de relleno. Tamao de partcula mayor al de la columna

Rellenos Pelicular:
Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas con dimetros entre 30 y 40 m. Recubrimiento con una capa delgada y porosa de distintos compuestos y recubrimiento adicional de fase estacionaria lquida y retenida por adsorcin. Tratamientos qumicos para mejorar fijacin. Ampliamente utilizados en precolumnas

Columna termostatizada
Entre temp. ambiente y 100-150C.

Partculas porosas.
Micropartculas porosas con dimetro entre 3 y 10 m. Preparadas por aglomeracin a partir de partculas pequeas. Recubrimiento con pelculas orgnicas unidas qumicamente o fsicamente.

Materiales ms utilizados como soportes

slice, almina, resinas de poliestireno. divinilbenceno o carbohidratos. Parmetros fsicos: porosidad, tamao de poro, tamao y rigidez de partcula, tamao. Parmetros qumicos. Polaridad, acidez-basicidad, estabilidad frente a solventes y pH, reactividad superficial.

Detectores
Propiedades de la fase mvil (Indice de Refraccin, constante dielctrica, densidad) Propiedades del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente lmite).

Detectores de absorbancia (71%)

Volumen de 1 a 10 L, longitud de 2 a 10 mm Presiones < 600 psi (necesitan reductores de presin) Dispositivos de doble haz (los ms comunes) Seal proporcional al Log I/Io Filtros (longitudes de onda determinados) Monocromadores (redes de difraccin)(UV y Visible) Cromatogramas a una fija o variable segn el analito. Barrido de para un analito con detencin de flujo Detectores de diodos permiten recoger el espectro completo en 1 segundo (cromatografa tridimensional.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo

Barrido de entre 2.5 y 15 m Cubetas con ventanas de NaCl o CaF2, long. 0,2 y 1,0 mm, volumen 1,5 a 10 L. Limitacin: baja transparencia de los disolventes (agua, alcoholes)

Detectores de fluorescencia
Detector colocado perpendicularmente al haz de excitacin Fuente de excitacion de Hg y filtros Xenn y monocromador de red lser sintonizables en desarrollo Tratamiento previo para dar derivados fluorescentes. Alta sensibilidad (materiales de inters farmacutico, clnico, productos naturales y del petrleo).

Detectores de ndice de refraccin

Detector universal No dependen del caudal Robustos Sensible a cambios de temperatura Menor sensibilidad que otros detectores.

Detectores electroqumicos
Elevada sensibilidad, sencillez, extensa aplicabilidad Electrodo indicador de platino, oro, carbn vtreo o pasta de carbono, electrodo de referencia y contraelectrodo se colocan ms adelante en el canal de flujo.

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Detectores por espectrometra de masas

Sistemas para introduccin de la fase mvil en cmara de vaco Introduccin directa de una pequea cantidad de lquido Vaporizacin previa de solvente y posterior desorcin-ionizacin de solutos. Termovaporizador-ionizador Aplicable a compuestos termoestables y no voltiles (pptidos, nucletidos. Espectros de impacto electrnico

Rellenos tipo siloxano para fase inversa: Grupo R: C8 (n-octilo), C18 (n-octadecilo) Mecanismos de retencin de solutos (por disolucin, equivalente a una fase lquida no polar, por adsorcin fsica

Cromatografa de Reparto
La ms utilizada Para compuestos polares, no inicos, de baja a moderada masa molecular (<3000) Ms recientemente para compuestos inicos derivatizados (formacin de pares inicos). Lquido-lquido: fase estacionaria unida por adsorcion fsica

Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de siloxano en fase inversa (Figura 28.15 Skoog). pH<7,5 para evitar hidrlisis del siloxano.

Desventaja: prdida de fase estacionaria por disolucin en la fase mvil Fase unida qumicamente: soporte ms comn es la slice. dimetro entre 3, 5 o 10 m); porosidad (hasta 0.80)
Hi Hi OH Si OH
Grupo silanol aislado Grupos silanoles vecinos

Hi OH Hi OH Si

Hi

Ln km = ao,i - a1,i 2 + (a2,i 22) 2: fraccin en volumen del componente orgnico

OH Si

OH Si

Hi
Agua unida a grupos silanoles

Si

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Cromatografa de fase normal

Slice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos das mol/m2 de grupos OH Inmovilizacin qumica (90% de rendimiento)
Si OH + X Si (CH2)n L Si O Si (CH2)n L

Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre slice o almina y fase mvil apolar. Competencia del disolvente y del analito por el relleno es determinante de los factores de retencin. Solventes no polares (etilter, cloroformo y n-hexano). Ecuacin de Soczewinski: ln ki = ln ki(2) Si lnx2

slice n = 8 o 18

organoclorosilano

siloxano X2: fraccin molar del componente de ms polaridad Rellenos tipo siloxano para fase normal: amino (C3H6NH2) (los ms polares) diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia) dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia) ciano (C2H4CN) (los menos polares)

L: metil, amino, carboxil, ciano, diol Recubrimiento mximo 4 mol/m2 de grupos. Silanos residuales se desactivan con clorotrimetilsilano

Cromatografa de fase inversa

Fase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase mvil polar (agua, metanol, acetonitrilo). Cambios de solvatacin del analito en el disolvente es determinante de cambios de factores de retencin.

Criterios de seleccin
Polaridad de la fase estacionaria similar a la de los analitos. (Evitar tiempos de retencin muy altos). Fase mvil con polaridad distinta a la fase estacionaria Polaridad creciente: Hidrocarburos < teres < steres < cetonas < aldehdos < amidas < aminas < alcoholes < agua k (factor de retencin) entre 2 y 5 Indice de polaridad P de Synder (J. Chromatog. Sci 1978, 16, 223) Para una mezcla de solventes A y B: P = APA + BPB A B: fracciones en volumen PA, PB: ndices de polaridad Cambio de 2 unidades en P cambio de k en un factor de 10 k2 k1 = 10 (P1 P2)/2

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Selectividad En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano. Agua para ajustar k. En fase normal se ajusta con etilter, cloruro de metileno y cloroformo, nhexano para ajustar k. Formacin de derivados 1) Reduccin de polaridad que haga posible el uso de cromatografa de reparto 2) aumento de respuesta del detector 3) aumento de selectividad de la respuesta Cromatografa de pares inicos Fase mvil: agua + disolvente orgnico (metano o acetonitrilo + compuesto inico con contrain de carga opuesta a la del analito. Contrain forma un par inico con el analito: especie neutra retenida por el relleno de fase inversa.

Cromatografa con fases estacionarias quirales Ms apropiada en HPLC que en CG Relleno recubierto con un ismero pticamente activo.

Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto

Campo Frmacos Bioqumica Productos de alimentacin Productos de la industria qumica Mezclas tpicas Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Aromticos condensados, tensioactivos, propulsores, colorantes Pesticidas, herbicidas, fenoles, PCB Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.

Contaminantes Qumica forense Medicina clnica

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Cromatografa de Adsorcin (Lquido-slido)

Fases estacionarias: slice y almina Seleccin del disolvente Fuerza del disolvente 0 (energa de adsorcin por unidad de superficie). 0 vara no linealmente con la relacin de volmenes de dos disolventes. Eleccin de disolventes Un aumento de 0.05 unidades de 0 disminuye k en un factor de 3-4. Cambios de se logran por ensayos previos con distintos disolventes. Ensayos por cromatografa de capa fina Aplicaciones de la cromatografa de adsorcin Para compuestos no polares con masa molecular < 5000 Compuestos con solubilidad limitada en disolventes acuosos Complementario con Reparto Separa ismeros

Cromatografa inica
Equilibrio de intercambio entre iones de la fase mvil y iones del mismo signo en la superficie de la fase estacionaria (resinas de intercambio). xRSO3-H+ slido + Mx+ (RSO3-)x + slido xH+

disolucin

disolucin

xRN(CH3)3 OH- + Axslido

[RH(CH3)3+]xAx- + xOHslido disolucin

disolucin

Primera etapa: adsorcin de iones en la cabeza de la columna Segunda etapa: elucin de iones adsorbidos con una disolucin diluida de cido clorhdrico. KII = [RSO3-B+]s[H+]ac [RSO3-H+]s[B+]ac

[RSO3-B+]s [B+]ac

= KII

[RSO3-H+]s [H+]
ac

Rellenos Partculas esfricas porosas copolmeros de estireno y divinilbenceno (8%) emulsionados (estables entre pH 0 y 14). Activacin por grupos cidos (sulfnico) o bsicos (aminas cuaternarias). Nuevos desarrollos: partculas esfricas (30 a 40 m), no porosa, de vidrio o polmero, recubierta con resina de intercambio inico (menor difusin) Fase mvil Disoluciones acuosas con metanol u otros disolventes orgnicos y especies inicas para formar un buffer. Cromatografa inica con columnas supresoras Electrolito eluyente enmascara la respuesta del Detector de conductividad a los iones del analito.

[H+]ac y [RSO3-H+]s >> [B+] [RSO3-B+]s [B+]ac Kex alta CS CM

= KII =

tiempo de retencin elevado

Tl+ >Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+ Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Cp2+>Zn2+>Mg2+>UO22+ SO42->C2O42->I->NO3->Br->Cl->HCO2->CH3CO2->OH->F-

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Columna supresora convierte iones de la fase mvil en especies poco ionizadas Ejemplo: H+(ac) + Cl-(ac) + Resina+OH-(s) Resina+Cl-(s) + H2O Resina-Na+(s) + H2CO3 (ac)
Eluyente NaOH

NaBr, NaCl, NaF, NaOH (diluyente) Bomba Inyector NaBr NaOH NaCl NaF

Na+(ac) + HCO3-(ac) + Resina-H+(s)

Sistema para separacin de analitos aninicos usando columna supresora

Columna separadora + Resina OH (s)

HBr H2O HCl HF Conductancia Columna supresora - + Resina H (s)

Detector Tiempo

Residuos

Aplicaciones orgnicas y bioquimicas Aminocidos, vitaminas, azcares y preparaciones farmacuticas, alimentos. (figura 28-25) Cromatografa de exclusin de iones (para cidos dbiles) Fase mvil: solucin acuosa de HCl diluido Fase estacionaria: resina de intercambio catinico en su forma cida Columna supresora de resina catinica con Ag para supresin de contribucin inica del eluyente. Para cidos y bases dbiles (y sus sales): coeficientes de distribucin se relacionan inversamente con las constantes de disociacin. Aplicaciones a especies cidas en leche, caf, vino, etc.

Regeneracin (cada 8 10 horas) Desarrollo reciente de supresores de membranas supresoras de intercambio inico con regeneracin continua: alta velocidad de intercambio. Cromatografa inica con una sola columna: deteccin debida a pequeas diferencias de conductividad entre iones del analito y del eluyente. Mtodo fotomtrico para deteccin de iones no absorbentes (figura 28-24

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Cromatografa de exclusin por tamao

Para masas moleculares elevadas Relleno: partculas polimricas con una red de poros uniforme (10 m) en los que pueden difundir molculas del soluto y del disolvente. Tiempo de residencia depende del tamao efectivo de las molculas. Molculas ms grandes no se retenidas y eluyen primero. Separacin por tamao, no implica interacciones qumica o fsica con el relleno. Rellenos de slice: retienen por adsorcin y catalizan descomposiciones. Se modifican por sustituyentes orgnicos (sililacin). Rellenos de copolmeros estireno-divinilbenceno: hidrofbicos.

Propiedades de los rellenos comerciales tpicos para la cromatografa de exclusin por tamao

Tipo Poliestirenodivinilbenceno

Tamao de partcula m 10

Tamao promedio de poro, A 102 103 104 105 106 125 300 500 1000

Lmite de exclusin en peso molecular 700 (0.1 a 20) x 104 (1 a 20) x 104 (0.1 a 20) x 105 (5 a >10) x 106 (0.2 a 5) x 104 (0.03 a 1) x 105 (0.05 a 5) x 105 (5 a 20) x 105

Slice

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Teora Vt = Vg + V i + Vo Vt: volumen total de la columna Vg: volumen ocupado por matriz slida del gel Vi: volumen del disolvente retenido Vo: volumen libre exterior Volumen de elucin = Vo: analitos no retenidos Volumen de elucin = Vo + K Vi analitos de tamao intermedio (K entre 0 y 1). Lmite de exclusin: peso molecular por encima del que no existe retencin. Lmite de penetracin: peso molecular por debajo del cual las molculas pueden penetrar completamente en los poros.

Aplicaciones Filtracin sobre gel Disolventes acuosos y relleno hidroflicos Penetrabilidad sobre gel: disolventes orgnicos no polares y rellenos hidrofbicos. Separacin de productos naturales de alto peso molecular. Separacin de homlogos y oligmeros Determinacin de la distribucin de pesos moleculares en polmeros o productos naturales (comparacin con patrones). Ventajas Tiempo de separacin cortos y bien definidos (entre Vo y Vo+Vi) Bandas estrechas No hay prdida de muestra No hay desactivacin de la columna

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Desventajas Nmero limitado de bandas No diferencia compuestos de tamao semejante (ismeros)

Cromatografa de Capa Fina (cromatografa

bidimensional)
Capa delgada de un Soporte inmovilizado sobre una superficie plana de vidrio, plstico o metal. Fase mvil se mueve por capilaridad, por gravedad o por un potencial elctrico. Otras modalidades menos usadas (en papel, electrocromatografa) Caractersticas: Rapidez y Bajo costo. Aplicaciones: Ensayos previos a los de columna Control de pureza en la industria.

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