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Guion de prcticas

Biologa

Grado en biotecnologa Curso 2012-2013

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SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGA La utilizacin, tanto de productos qumicos como de material biolgico entraa ciertos riesgos, que en este curso se han tratado de reducir al mnimo. Para ello, el alumno deber seguir las siguientes normas bsicas: 1. Es importante vestir una bata adecuada para proteger las ropas y especialmente el

cuerpo. Al inicia y finalizar el trabajo, lavarse las manos con agua y jabn. 2. Est estrictamente prohibido fumar, comer o beber en el laboratorio. Cuando

se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc 3. Mantener el rea de trabajo limpia, y el laboratorio en general. No dejar basura

sobre las mesas, fregaderas o reas comunes (puntas de micropipeta utilizadas, resto de soluciones, papeles,.) todo el material descartable debe ir inmediatamente a la papelera (general o vidrio) o al fregadero (segn su consistencia y la indicacin del profesor). Dejar el laboratorio y el material limpio (con jabn y pasado por agua destilada) antes de dejar el laboratorio. 4. Una vez utilizadas las preparaciones, tirar los cubreobjetos al contenedor para

vidrio. Si se olvidan encima de las mesas se rompen y es muy fcil cortarse con ellos. Los portaobjetos, una vez limpios, se colocaran en su sitio. 5. Antes de utilizar por primera vez cualquier producto qumico, leer las indicaciones

del bote. Si es necesario, utilizar guantes o mascarilla durante la manipulacin. En caso de duda, preguntar al profesor. 6. Nunca se debe pipetear con la boca: utilizar las peras o las micropipetas disponibles

en el laboratorio. En el caso de disoluciones voltiles o txicas, trabajar en campana extractora. Es esencial utilizar etiquetas y rotuladores. Marcar bien las disoluciones que se preparen, y no utilizar nunca botellas "sospechosas" ni soluciones o reactivos sin etiquetar. El saber que es cada cosa y que contiene cada frasco es el mejor sistema para evitar confusiones y accidentes innecesarios. 7. No deben dejarse botellas de disolventes voltiles (ter, acetona, isopropanol...)

abiertas sobre la mesa. Tampoco deben exponerse al sol o a las proximidades de alguna llama. Manejar los mecheros de alcohol con extremado cuidado, no movindolos una vez encendidos, y no dando fuego de un mechero a otro. 8. No utilizar ningn microscopio por primera vez sin atender a las indicaciones

previas del profesor. Si un microscopio da seales de comportamiento anormal, avisar inmediatamente al profesor. Dicho aparato deber ser desconectado inmediatamente Biologa curso 201213 Pgina 2

hasta que sea revisado y reparado. Debe tenerse cuidado con el derrame de soluciones conductoras de la electricidad, que son la mayora, especialmente si estn en contacto con enchufes o cables; en caso de que as ocurra, debe desconectarse primero la corriente, limpiar la solucin vertida, lavar la zona afectada con abundante agua destilada y secarla bien. 9. Las clulas y los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama o

en campana de flujo laminar. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes. 10. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin del experimento deben estar apartados del lugar de trabajo.

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PRACTICA 1 y 2. MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO Y MEDIDA DEL TAMAO DE UN OBJETO MICROSCPICO

OBJETIVOS:

- Conocer las caractersticas y el funcionamiento de un microscopio. - Aprender a manejarlo con soltura. - Efectuar mediciones del tamao de objetos de dimensiones microscpicas.

1. DESCRIPCIN DEL MICROSCOPIO

2.1. SOPORTE MECANICO

-UN PIE PESADO o base, que da estabilidad al microscopio. -UN BRAZO, que articula con: -EL TUBO OPTICO: lleva las lentes oculares en la parte superior, y objetivos, en la pieza giratoria o revolver en la parte inferior.

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-LA PLATINA: es la plataforma sobre la que se colocan las preparaciones. Lleva un carro mvil que permite desplazamientos transversales y en sentido vertical. La distancia entre el tubo ptico y la platina puede variar, lo que permite el enfoque. La variacin de distancia entre estos, puede hacerse con el tornillo macromtrico, cuyo giro da lugar a una gran variacin de distancia (enfoque grosero) y con el tornillo micromtrico cuyo giro corresponde a pequesimas variaciones de distancia (enfoque fino). 2.2. PARTE PTICA -OCULARES: Puede haber dos lentes oculares (microscopio binocular) o una sola (microscopio monocular). En muchos modelos, puede ajustarse la distancia entre ellos (binculos) para adaptarse a la distancia interpupilar de cada usuario. El aumento est indicado en ellos (X10, X12... etc). En el ocular puede incluirse una escala micromtrica para medir objetos. -OBJETIVOS: se encuentran situados en la base de una pieza giratoria llamada revlver. Cada microscopio lleva un juego de diversos objetivos, que permite trabajar con diferentes aumentos. Los aumentos estn indicados en la lente (por ejemplo: 40 x = 40 aumentos). -SISTEMA DE ILUMINACIN: pueden tener el sistema de iluminacin incorporado en la base, o captar mediante un espejo, luz procedente de una lamparita o luz solar. Usar la parte cncava para luz artificial, y la parte plana para luz solar. -DIAFRAGMA: regula la cantidad de luz que pasa a travs del espcimen y a travs de las lentes del microscopio. La posicin del diafragma debe de ser adaptada a cada muestra y a cada aumento utilizado. Permite el contraste de la muestra con el medio que lo rodea. -CONDENSADOR: consiste en una lente o serie de lentes que dirigen la luz hacia el espcimen. El condensador puede colocarse a diferentes distancias en algunos microscopios. Estas piezas son variables segn el modelo de microscopio.

2. USO DEL MICROSCOPIO

Los aumentos totales, con cada juego de objetivos se obtienen multiplicando los aumentos del objetivo por los aumentos del ocular.

NORMAS GENERALES No tocar nunca las lentes con los dedos. Las lentes se limpian con papel especial para lentes. Cualquier otro material puede daarlas. Empezar a trabajar con objetivos de pequeo aumento (objetivo buscador). Ajustar la iluminacin ptima. Pgina 5

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No efectuar el movimiento de aproximacin tubo ptico/platina (preparacin) mirando por el ocular.

2.1 ENFOQUE:

-Colocar la preparacin en la platina, sujetarla con las pinzas de presin lateral y centrarla mediante los tornillos situados a la derecha. Cerciorarse de que la posicin de la preparacin es: portaobjetos abajo y cubreobjetos arriba. -Colocar el objetivo girando el revolver, tras levantar ligeramente el tubo ptico (los objetivos de mayores aumentos suelen ser ms largos). -Aproximar, mirando por fuera, el tubo ptico y la preparacin (Tornillo macromtrico). -Mirando por el ocular, girar muy despacio, alejando el tubo ptico con el tornillo macromtrico. Los aumentos de un objetivo son inversamente proporcionales a la distancia focal, por lo que dependiendo del objetivo, el plano de enfoque va a estar ms o menos prximo a la preparacin. -Tras obtener el mximo de nitidez con el tornillo macromtrico, afinar el enfoque con el micromtrico. Observar que pueden verse ntidos diferentes planos de nuestra muestra. Adaptar la iluminacin usando las diferentes posiciones del condensador, y la apertura del diafragma. Cada muestra y cada aumento usado requieren la adaptacin de la iluminacin. -Tras realizar el enfoque con un objetivo de poco aumento, centrar la muestra en el campo, y girando el revolver colocar el objetivo de mayor aumento, repitiendo el proceso de enfoque.

Cuestiones: 1. Aumentos totales Cmo se calculan?. Calcular para vuestro caso concreto. Citar marca, modelo y caractersticas de vuestro microscopio. 2. Cmo debes preparar tu microscopio para comenzar el enfoque con una preparacin? 3. Qu tipo de aumento es aconsejable utilizar al empezar a examinar una preparacin? El cambio de objetivo al observar una muestra implica adaptar la iluminacin?

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3. MEDIDA DE OBJETOS MICROSCPICOS MATERIAL: - Micrmetro ocular - Micrmetro objetivo Para medir las dimensiones de material microscpico es necesario disponer de una escala o micrmetro ocular (algunos oculares llevan incorporado el micrmetro). Esta escala deber de ser calibrada, para conocer el valor de sus divisiones en cada una de las posibilidades de aumentos del microscopio, con un micrmetro objetivo.

PROCEDIMIENTO:

1.- Colocar el micrmetro ocular dentro del ocular sin tocar las lentes, desenroscando la parte superior e introduciendo la escala (excepcionalmente puede haber casos en que se introduce en la parte inferior). Comprobar que el micrmetro ocular est correctamente incorporado dentro del ocular, debe observarse la escala con nitidez. 2.- Calibrar: comparando con una longitud conocida (micrmetro objetivo), se calibra el valor de las divisiones del ocular, en cada posibilidad de aumento de nuestro microscopio. Enfocar la escala del portaobjetos de la forma habitual. La escala objetiva tiene un milmetro dividido en centsimas de milmetro. Al ser observada y comparada, permitir calibrar el valor de las divisiones del ocular. Calibrar primero con el objetivo de menor aumento. Un procedimiento simple puede ser hacer coincidir los orgenes de ambas escalas, y buscar divisiones que coincidan exactamente colocando ambas escalas paralelas, lo ms prximas posible, pero sin que se superpongan. Por ejemplo, si 50 divisiones del ocular, coinciden con 70 divisiones del objetivo, es decir con 70 centsimas de milmetro. ocular (?) 50 divisiones 1 luego x= 70 =1.4 centsimas de milmetro. 50 La unidad de medida en microscopa ptica suele ser la milsima de milmetro, el micrmetro (m), luego, una divisin equivalente a 14 m. objetivo (conocida) 70 centsimas de mm. x

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El calibrado suele hacerse 3 veces, enfocando y desenfocando, y se halla la media. Cuanto ms larga es la superficie comparada de las escalas menor ser el error cometido. Se procede de idntica manera con los diferentes objetivos disponibles. 3.- Medida: Una vez conocida la equivalencia en micras de la escala ocular con cada posibilidad de aumento, puede procederse a medir las muestras problema. Se retira el micrmetro objetivo, y se sustituye por la preparacin a medir, girando si es necesario el ocular, para superponer la escala a la longitud a medir; se cuenta el nmero de divisiones, y se multiplica por su valor en micras. Por ejemplo si mide 30 divisiones, como cada una de ellas vale 14 m el tamao real del objeto ser 30 x 14 m = 420 m.

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4. PREPARACIN DE UNA MUESTRA DE TIERRA DE DIATOMEAS PROCEDIMIENTO 1. Tomar una alcuota de tierra de diatomeas y ponerla en el centro de un portaobjetos. 2. Aadir una gota de agua. 3. Colocar el cubreobjetos con cuidado. Una de las aristas del cubreobjetos se pone en contacto con el borde de la gota, y muy despacio se baja, para evitar que se forman burbujas de aire. 4. Medir el dimetro o longitud de una serie de ejemplares de la misma especie, y calculad los valores medios dando las dimensiones reales. Adems se observaran al microscopio y medirn granos de polen distintas preparaciones que ya han sido previamente montadas.

Cuestiones: 1.- Qu es un micrmetro ocular?. Dnde est situado? 2.-Qu objetivo se ha de calibrar en primer lugar? 3.-Cul es la unidad de medida habitual en microscopia ptica? 4- Resultados de la calibracin

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Anexo: Relacin entre la distancia focal, el dimetro del campo e iluminacin del campo:

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PRACTICA 3. OBSERVACIN DE TIPOS CELULARES PROCARIOTAS.

OBJETIVOS:

- Montar preparaciones sencillas. - Uso del objetivo de inmersin. - Observacin de tipos celulares procariotas. - Aprendizaje de tcnicas de tincin sencillas.

MATERIAL Y REACTIVOS:

- Placas de agar nutritivo - Bastoncillos - Portaobjetos y cubreobjetos. - Mechero de alcohol. - Objetivo de inmersin y aceite. - Alcohol 70% y absoluto. - Cristal violeta, safranina, lugol

4.1 OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS.

Las cianobacterias comprenden un grupo grande y heterogneo de organismos procariotas fototrficos. Tienen una distribucin muy extensa en la naturaleza, tanto en ecosistemas terrestres como acuticos. Las dimensiones de las clulas de cianobacterias fluctan desde 0.5 a 1 m de dimetro (tamao caracterstico de las bacterias), hasta 60 m de dimetro. Algunas cianobacterias filamentosas forman a partir de clulas vegetativas heterocistos (clulas especializadas en la fijacin de nitrgeno).

PROCEDIMIENTO:

1. Tomar con una pipeta pasteur una gota de un cultivo de Anabaena variabilis y ponerla en el centro de un portaobjetos. 2. Colocar la arista del cubreobjetos en contacto con el borde de la gota. Biologa curso 201213 Pgina 11

3. Bajar el cubreobjetos muy despacio evitando que se formen burbujas de aire

Figura 1. En los filamentos pueden observarse dos tipos de clulas: las vegetativas (ms abundantes, verdes) y heterocistos (aproximadamente 2-3 %; son amarillentas y ligeramente ms grandes). Estas ltimas estn especializadas en la fijacin del nitrgeno atmosfrico y constituyen un caso interesante de diferenciacin celular en procariotas. 4. Observar al microscopio la morfologa de las cianobacterias y hacer mediciones de las mismas. NOTA. Los portas debern lavarse y se colocarn limpios y secos en sus recipientes. Los cubres se tiran a la basura; se ruega cuidado en no dejarlos abandonados en las mesas, pues pueden daar a los dems.

3.2. OBSERVACIN DE LA FLORA BACTERIANA BUCAL MEDIANTE TINCION DE GRAM.

La tincin de Gram es un tipo de tincin diferencial muy utilizado en microbiologa para la visualizacin de bacterias. Segn reaccionan a la tincin Gram, las bacterias se pueden dividir en dos grandes grupos: gram positivas (color azul-violceo) gram negativas (color rojo). Estas diferentes maneras de reaccionar frente a la tincin Gram se deben a diferencias en la estructura de la envoltura celular de estas bacterias (ver figura 2). Las bacterias se tien con una solucin de cristal violeta y yodo, decolorndose posteriormente con alcohol y/o acetona. Las bacterias gram positivas, al poseer una envoltura celular ms resistente Biologa curso 201213 Pgina 12

retienen el primer colorante, manteniendo su coloracin azul-violcea. Por el contrario las bacterias gram negativas no resisten a la decoloracin y tras aadir la safranina (colorante de contraste) quedaran coloreadas de rojo.

Figura 2. Envoltura celular bacteriana. A causa de las diferencias en la estructura de la envoltura celular, algunas bacterias (bacterias grampositivas) retienen ,a tincin Gram (introducida por Hans Christian Gram en 1882) y otras no (bacterias gram-negativas).

PROCEDIMIENTO:

Pueden observarse bacterias de la flora normal de la boca, procediendo de la forma siguiente: 1. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado (limpiar con alcohol del 70 %) aadir una gota de agua y extender el material procedente de pasar suavemente un bastoncillo por la superficie interna de la mejilla. 2. Secar al aire o suavemente a la llama de un mechero de alcohol. PRECAUCION: No mover el mechero despus de encendido ni inmediatamente antes de hacerlo. No utilizar un mechero para encender otro. No soplar para apagar el mechero. Hacerlo con la campana de cristal correspondiente. 3. Fijar la extensin, una vez seca, pasndola dos o tres veces por la llama (el porta debe poderse coger con las manos, sin que queme; la temperatura ptima es de 45-50 C). Esta operacin es muy importante, ya que evita la prdida de la preparacin en las etapas posteriores. Biologa curso 201213 Pgina 13

4. Con el portaobjetos frio, cubrir el frotis con unas gotas de cristal violeta, y dejar actuar al colorante durante 3-5 minutos. 5. Eliminar el colorante con agua, y arrastrar los restos que pudieran quedar con unas gotas de lugol. Aadir unas gotas de lugol y dejar actual 30 segundos. La preparacin adquiere un color pardo-negro. Lavar suavemente con agua abundante. 6. Decolorar con alcohol. Inclinando el porta, se deja deslizar la solucin, dejando que el sobrenadante vaya derramndose por el extremo opuesto. Se verter alcohol-acetona hasta observar la preparacin incolora o escasamente teida. Prolongar la decoloracin puede llevar a resultados errneos. 7. Lavar suavemente con abundante agua. 8. Para poner de manifiesto las bacterias Gram negativas, utilizaremos un segundo colorante, pues al no retener el colorante de Gram, permaneceran incoloras. Para ello, aadir dos gotas de safranina y mantener durante un minuto. 9. Lavar cuidadosamente con agua abundante y dejar secar al aire. 10. Una vez completamente seca, observar la preparacin con el objetivo de inmersin. Colocar el condensador en posicin alta y el diafragma abierto. Poner una gota de aceite de inmersin en la zona central del frotis. Aproximar el objetivo de inmersin hasta que haga contacto con la superficie de la gota, y enfocar la preparacin moviendo suavemente el tornillo micromtrico. El objetivo de inmersin proporciona unos 100 aumentos (ver cada caso); su distancia focal es tan pequea que no utilizamos cubreobjetos pues el grosor de ste impedira el enfoque de la preparacin. Por otra parte, la utilizacin del aceite de inmersin (mayor ndice de refraccin que el aire) proporciona las mejores condiciones para la observacin de la preparacin. El objetivo de inmersin deber limpiarse tras su uso. Durante el uso este objetivo hay que ser cuidadoso para no ensuciar con aceite los otros objetivos. Observar el distinto comportamiento de las bacterias frente a la tincin. Hacer observaciones referentes a la morfologa, agrupacin, tamao, etc de los

microorganismos.

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Las bacterias tienen distintos tamaos y formas cocos bacilos

espirilos

1 monococo 2 diplococos 3 estafilococos 4 estreptococos 5 sarcina 6 tetradas

Fig. 1-10 Essential Cell Biology (Garland 2010)

Cuestiones:

1. Cul es la razn por la que se utiliza el aceite de inmersin? 2. Identificar las morfologas de los distintos microorganismos observados, haciendo esquemas de las distintas preparaciones. Cmo crees que se originan este tipo de agrupaciones? 3. Describe brevemente las diferencias entre la clula procariota y la eucariota

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PRACTICA 4. OBSERVACION DE TIPOS CELULARES EUCARIOTAS I: CLULA VEGETAL Y ORGNULOS OBJETIVOS:

- Confeccionar preparaciones temporales de tejidos vegetales. - Aprendizaje de tinciones selectivas. - Observacin de orgnulos celulares en clulas diferenciadas de organismos pluricielulares

MATERIALES

- Cubre y portaobjetos. -Tnica de cebolla. - Lugol. - Hojas de cola de zorro, tomate, patata.

4.1 OBSERVACIN DE PLASTIDIOS A. CLOROPLASTOS.

PROCEDIMIENTO:

- Colocar una hoja (preferentemente joven) de cola de zorro (Ceratophylum demersum) bien extendida en un porta. - Aadir una gota de agua y montar el cubreobjetos. - Observar al microscopio el tamao, morfologa, nmero de cloroplastos (fcilmente distinguibles por el color verde de la clorofila). B. CROMOPLASTOS.

PROCEDIMIENTO:

1. Tomar una pequea cantidad de la pulpa de un tomate y colocarla entre porta y cubreobjetos. Comprimir suavemente para extender la muestra.

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2. Se observarn clulas sueltas con los cromoplastos desperdigados en su interior en forma de pequeos grnulos. Cada cromoplasto ofrece el aspecto de una esfera incolora, conteniendo pequeas agujas rojas de licopeno cristalizado.

C. AMILOPLASTOS: PROCEDIMIENTO:

1. Raspar el material objeto de estudio (patata, cereales, legumbres) sobre un porta. 2. Aadir una gota de agua y otra de lugol. Poner el cubre y observar con el microscopio.

Cuestiones: 1. Dibujar y describir: cloroplastos, cromoplastos y amiloplastos 2. Describe brevemente las funciones de los orgnulos observados.

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PRACTICA 5. OBSERVACION DE TIPOS CELULARES EUCARIOTAS II: ELEMENTOS FORMES SANGUNEOS

OBJETIVOS:

- Confeccionar preparaciones temporales de tejidos animales. - Aprendizaje de tinciones selectivas. - Observacin de orgnulos celulares en clulas diferenciadas de organismos pluricelulares.

MATERIAL Y REACTIVOS:

- Vidrio de reloj; pinzas de madera; lancetas; aguja enmangada, mechero de alcohol. - Cubre y portaobjetos. - Metanol -Solucin de May-Grnwaland (eosinato de azul de metilo) y Solucin Giemsa (azul de metilo, azur eosina) diluida. - Material biolgico: muestra de sangre

TEJIDO SANGUINEO

Para la observacin de elementos formes presentes en la sangre se utilizar el mtodo panptico. La prctica comprende dos partes: A. Obtencin de un frotis sanguneo FROTIS: es una extensin de material suficientemente fina para poder ser observada al microscopio con objetivo de gran aumento (en nuestro caso utilizaremos el objetivo de inmersin). B. Fijacin y coloracin de los elementos formes y clulas sanguneas

A. Obtencin de un frotis sanguneo

1. Colocamos una gota de sangre en uno de los extremos del portaobjetos.

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2. Colocamos el otro portaobjetos formando un ngulo de 45C, lo acercamos a la gota y esperamos que al tocarla se extienda por capilaridad a lo largo de la superficie lateral. Arrastrar por todo el portaobjetos. 3. Dejar secar a temperatura ambiente.

B. Coloracin por el mtodo panptico

1. Verter 10 gotas de la solucin de Eosinato de azul de metilo sobre el frotis, dejndolo actuar el reactivo durante 3 minutos. Se debe evitar que la preparacin se seque durante el tratamiento. 2. Verter sobre la superficie del frotis 10 gotas de agua destilada. Inclinado el portaobjetos para que se mezcle bien el agua con el reactivo. Dejar actuar la mezcla durante 1 minuto. 3. Retirar el colorante anterior por deslizamiento y sin lavar verter sobre el frotis la solucin de Giemsa. Dejar actuar de 15-20 minutos. 4. Lavar rpidamente, evitando que la pelcula del colorante quede adherida sobre la superficie del frotis. 5. Dejar secar al aire la preparacin. 6. Observar al microscopio. Es aconsejable una primera exploracin de la preparacin con una lente de pequeo aumento con el objeto de localizar una buena zona. Despus colocar una gota de acetite de inmersin sobre la muestra y utilizar el objetivo de inmersin para la visualizacin de la misma.

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Cuestiones: 1. Qu es un frotis?, Cmo se prepara? 2. Comenta brevemente el fundamento de la tcnica de tincin utilizada 3. Qu elementos o clulas son las ms abundantes en la sangre? 4. Qu tipo de glbulos blancos son los que se ven con ms frecuencia? 5. Por qu los eritrocitos y las plaquetas no pueden ser considerados verdaderas clulas?

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PRACTICA 6. TRANSPORTE CELULAR: TURGENCIA Y PLASMLISIS La capacidad de mover selectivamente iones y molculas orgnicas a travs de una membrana es un proceso bsico en la funcin celular. Algunas molculas apolares y de pequeo tamao atraviesan la membrana por difusin simple. Sin embargo, para la mayora de los solutos este movimiento est mediado por protenas transportadoras que permiten la difusin facilitada o el transporte activo de los solutos a favor o en contra de gradiente de concentracin electroqumico respectivamente. Pero para comprender correctamente el mecanismo de transporte de solutos, necesitamos entender tambin las fuerzas que actan sobre el agua y determinan su movimiento dentro y fuera de las clulas. El agua se mueve a travs de una membrana semipermeable (osmosis) impulsada por diferencias en la presin osmtica. Las disoluciones de igual osmolaridad que el citosol celular son isotnicas. Una clula rodeada por una disolucin isotnica no gana ni pierde agua. En una disolucin hipertnica, con osmolaridad mayor que el citosol, la clula se retrae y deshidrata al salir el agua. En las clulas vegetales el movimiento de salida de agua facilita la separacin entre la membrana y la pared celular (plasmlisis) perdiendo su turgencia. Contrariamente, la clula se hinchar en una solucin hipotnica OBJETIVOS: -Comprender el proceso osmtico -Diferenciar el proceso en clulas animales y vegetales, comparando el proceso in vitro, por medio de la observacin microscpica de preparaciones de sangre y elodea. MATERIAL Y REACTIVOS: -Cubre y portaobjetos -Pipetas Pasteur. -Gradilla y tubos de ensayo. -Placas Petri. -Cristal violeta al 0.01%. -Muestra de sangre -Epidermis de cebolla -Soluciones de NaCl al 0.6%, 0.9%, 1.2% y 4%.

PROCEDIMIENTO: 1. Aadir con una Pipeta Pasteur 3-4 gotas de sangre en los tubos de plstico de 1.5 mL con las soluciones de NaCl al 0.6%, 0.9% y 1.2%. Biologa curso 201213 Pgina 21

2. Dejar reposar durante 2 minutos y realiza una preparacin en un portaobjetos para cada concentracin de NaCl. 3. Observar al microscopio y comparar el tamao que presentan los eritrocitos para cada solucin. 4. Prepara tres placas Petri con 10-15 mL de agua y de las soluciones de NaCl al 0.9% y 4%. Corta varios trozos de epidermis de cebolla y coloca una en cada placa, espera 10 minutos. 4. Realizar una preparacin para cada muestra de epidermis de cebolla procedente de distintas concentraciones. Observa el estado de las clulas, si la membrana celular est separada de la pared celular, la clula est plasmolizada. Opcionalmente y para facilitar la observacin de las clulas se puede aadir una gota de cristal violeta (solo una).

Cuestiones 1. A qu se refieren los trminos hipotnico, isotnico e hipertnico? 2. A qu concentracin observas plasmlisis en las clulas de la epidermis de la cebolla?. En la naturaleza En qu casos se puede provocar plasmlisis en las plantas?. 3. Se habran obtenido los mismos resultados si se hubiera empleado un alga marina en el experimento? 4. En su medio natural, las clulas contienen generalmente concentraciones ms elevadas de biomolculas e iones que sus alrededores, de forma que la presin osmtica tiende a impulsar agua hacia el interior de las clulas. Qu mecanismo han surgido a lo largo de la evolucin en las clulas procariotas y clulas eucariotas vegetales y animales para evitar la lisis osmtica?

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PRACTICA 7. OBSERVACIN DE NUCLEO INTERFSICO Y MITOSIS.

OBJETIVOS: -Confeccionar preparaciones temporales de tejidos vegetales. - Aprendizaje de tinciones selectivas. - Observacin de orgnulos celulares en clulas diferenciadas de organismos pluricielulares -Tinciones selectivas de cromosomas en preparaciones temporales de tejidos vegetales en los que se encuentran clulas en divisin. -Observacin de cromosomas y figuras mitticas.

MATERIAL Y REACTIVOS:

-Papel de filtro -Vidrio de reloj; pinzas de madera; lancetas; mechero de alcohol. -Cubre y portaobjetos. -Tnica y raicillas de cebolla. -Orcena actica al 2% (orcena al 2 % en cido actico). -Orcena clohdrica (formada por 9 partes de una disolucin de orcena actica al 2 % y 1 parte de HCl 1N).

7.1

OBSERVACION

DE

CELULAS

VEGETALES

EUCARIOTAS:

NUCLEO

INTERFASICO EN TUNICA DE CEBOLLA

PROCEDIMIENTO:

1. Cortar un trozo de tnica de cebolla. 2. Colocarla sobre un vidrio de reloj 3. Cubrir la preparacin con 5 6 gotas de orcena. 4. Calentarla suavemente a la llama de un mechero hasta que se observe la aparicin de humos blancos muy tenues. Tener cuidado de que el reactivo no hierva ni se seque. 5. Pasar el material a un portaobjetos. 6. Aadir una gota de agua; colocar un cubre. Biologa curso 201213 Pgina 23

7. Eliminar el exceso de la mezcla de reactivo y agua sobre el cubre con papel de filtro. 8. La observacin microscpica se realiza con objetivos de pequeo aumento, buscando la parte de la preparacin en la que se vean las clulas individualmente. Realizar observaciones relativas a la forma y tamao de las clulas, posicin del ncleo, etc.

7.2 TINCIN RPIDA DE CROMOSOMAS: OBSERVACIN DE LA MITOSIS.

La mitosis es una etapa del proceso de divisin celular que permite que la dotacin gentica de las clulas hijas se mantenga exactamente igual a la de la madre. En organismos vegetales el material ms adecuado son los meristemos en crecimiento, y en particular los de la raz, con una tasa de reproduccin muy elevada en las clulas apicales.

PROCEDIMIENTO:

1. Para la observacin de los cromosomas utilizamos una raicilla de cebolla (Allium cepa). Tomad la raz completa para evitar que otro compaero la considere intacta. 2. Cortar el pice de la raz, aproximadamente medio centmetro. 3. Colocar la raz en un vidrio de reloj que contenga una pequea cantidad de orcena clorhdrica, pasando aquel sobre el mechero durante algunos segundos; este calentamiento se repite de 3 a 5 veces, teniendo especial cuidado de que no llegue a ebullicin ni se seque. 4. Una vez realizado este calentamiento, se toma la raicilla y se coloca sobre un porta. Acto seguido se vierte un gota de agua y con la ayuda de la lanceta se extiende en el portaobjetos y se desgarran los tejidos. Para terminar de montar la preparacin se pondr el cubreobjetos y se aplastar fuertemente para terminar de extender lo muestra, recogiendo el exceso de orcena actica si rezuma por los bordes del cubre. 5. Observar al microscopio y realizar un esquema.

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Cuestiones: 1. Hacer observaciones relativas a la forma, tamao y posicin del ncleo en las preparaciones observadas. 2. Por qu se utiliza el pice de raz de cebolla para observar mitosis?. Comenta brevemente las diferencias observadas entra las clulas presentes en tnica de cebolla y las del meristemo apical. 3. Esquema de las diferentes fases mitticas que se observan 4. En este caso 2n=16. Qu es lo que recibe cada una de las dos clulas hijas durante la mitosis? Y en la meiosis?

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