COMO REALIZAR UN FROTIS INVESTIGACIN DE UN FROTIS Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo

con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber. PASOS PARA REALIZAR EL FROTIS Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. TINCIN DE GRAM La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Tincin Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C. Enjuague Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% . Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 3 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias. Decoloracin Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tincin de contraste Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

Tincin de Ziehl Neelsen

a) Filtre la fucsina fenicada antes de usarla. b) Cubra la superficie del extendido con fucsina. c) Pase la llama del mechero (o torunda empapada en alcohol) por debajo de la lmina, hasta que se produzca la emisin de vapores blanquecinos. Deje de calentar y repita el procedimiento dos veces ms. La emisin de los vapores blanquecinos debe lograrse tres veces en 5 minutos, que es el tiempo adecuado de contacto entre el extendido y el colorante. La fucsina no debe hervir sobre la lmina, si disminuye por evaporacin o derrame, hay que reponerla. d) Elimine la fucsina con agua del tubo a baja presin, de manera que la pelcula no se desprenda. e) Gire la lmina para lavar su cara inferior y as eliminar la fucsina ah depositada. f) Cubra la superficie del extendido con alcohol-cido al 3% efectuando un movimiento de vaivn y espere 2 minutos de modo que el alcohol-cido lo decolore y arrastre suavemente la fucsina. Esta operacin puede repetirse hasta que sobre el extendido se observe un color rosado. g) Lave la lmina con agua segn se describe en el punto d. h) Cubra el extendido durante 1 minuto con solucin de azul de metileno. i) Lave ambas caras de la lmina con agua. j) Seque las lminas a temperatura ambiente, en posicin vertical, con el extendido hacia el frente. k) Revise la identificacin de los frotis y rotlelos de nuevo si se borraron durante la tincin.

Observacin microscpica La observacin microscpica debe determinar la presencia de BAAR (concordancia cualitativa) y establecer su nmero aproximado por campo microscpico (concordancia cuantitativa). Considere campo microscpico til aquel en el cual se observan elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura. Observe cada campo microscpico, en superficie y profundidad, con objetivo de inmersin Establezca una pauta uniforme de observacin El nmero de campos que se debe observar variar segn la cantidad de bacilos que contenga la muestra. Si no se encuentran BAAR o se observa menos de 1 bacilo por campo en promedio, deben examinarse por lo menos 100 campos. Si se encuentran de 1 a 10 BAAR por campo en promedio, es suficiente observar 50 campos. Si se encuentran ms de 10 BAAR por campo en promedio, basta con observar 20 campos. Cuando aparecen grumos de bacilos se debe contar como uno. Si el nmero de grumos que aparece es significativo, se debe hacer la observacin en el reporte: hay BAAR en grumos, para indicar que el nmero verdadero de BAAR puede ser mayor que el que se reporta. Cuando el frotis es de otro tipo de muestra, que no sea esputo o del sedimento de un esputo, solamente se reporta cualitativamente.

Reporte de resultados Negativo (-): No se encuentran BAAR en 100 campos observados (c.o.). o si se encuentran menos de 3 BAAR en 300 campos pticos observados. Nmero exacto: de 1-9 BAAR en 100 campos observados. Positivo (+): Promedio de menos de 1 BAAR por campo, en 100 campos observados. Lo que es lo mismo, de 10 a 99 BAAR en 100 campos Positivo (++): Promedio de entre 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados. Positivo (+++): Promedio de ms de 10 BAAR por campo, en 20 campos observados.

Ejemplos: Si observa 24 BAAR en 100 campos pticos: 24/100=0,24 Lo que implica menos de 1 y corresponde reportar: BAAR positivo (+). Si observa 5 BAAR en 100 campos pticos: Lo que implica de 1-9 en 100 campos observados y corresponde reportar: Positivo (5) BAAR en 100 campos.

TINCIN DE CPSULA La cpsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulacin de material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular. Las cpsulas se pueden clasificar en funcin del grado de asociacin con la superficie celular, o por su consistencia: Cpsula rgida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de partculas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un lmite exterior definido. Cpsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partculas. Adems, es deformable y carente de lmites precisos. Cpsula integral: ntimamente asociada con la superficie celular, con la pared Celular Cpsula perifrica: asociada a la superficie celular slo en determinadas Condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior. Hay una cierta confusin en la nomenclatura de las cpsulas. Por eso cabe destacar que CPSULAS en sentido estricto son aquellas de tipo rgido e integral. Capas mucilaginosas son las de tipo flexible y perifrico. Las cpsulas son estructuras inertes no vivas, carentes de papel activo (metablico) pero que confieren a las bacterias importantes propiedades: Adhesin a otras clulas: microcolonias y consorcios Adhesin a sustratos inertes o vivos: colonizacin de sus nichos ecolgicos (p. ej. Tejidos de organismos superiores) Proteccin contra agentes antibacterianos La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenacin regular radial, o a veces en lminas concntricas. El material capsular se compone de 35 macromolculas asimtricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades repetitivas: polisacridos o polipptidos. Mtodo La observacin a microscopa ptica en fresco es difcil, ya que su ndice de refraccin es similar al del medio. Se recurre a tincin negativa por medio de nigrosina o tinta china. 1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, aadir una gota de tinta china y mezclar bien.

2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensin de clulas con tinta china. Evitar que se formen burbujas. 3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes. Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensin ser absorbido por los papeles. 4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las manos con jabn. 5. Observar al microscopio, se debe de ver la clula teida de negro y la cpsula en blanco. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para aumentar el contraste de las clulas.

TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN) Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters. FUNDAMENTO Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante. REALIZACIN Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

1.Preparar los frotis bacterianos indicados.

2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min. Nota: evitar que la muestra hierva. Aadir ms colorante si ste se evapora; es importante que la muestra no se seque.

3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4. Teir con safranina 1 min.

5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

6. Secar la preparacin.

7. Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfologa de las tres especies del gnero Bacillus. TCNICAS PARA TEIR HONGOS Tincin de hongos con azul lactofenol Objetivo: Preparar la muestra a partir de un alimento que contenga hongos para poder estudiar la estructura de aquel microorganismo. Examinar el aspecto microscpico y macroscpico de la morfologa talfica. A partir de de la tincin de con azul de lactofenol con el mtodo de la cmara hmeda. Introduccin: l anlisis de la calidad de los alimentos incluye la determinacin de los hongos que se encuentran en los alimentos, cuando se degradan. Los hongos pertenecen al grupo de eucariota en este estn las levaduras, mohos y setas. Los hongos deuteromicotos con los conidios y conidiforos no tienen ningn tipo de proteccin.

El tal de un hongo est formado por hifas (son filamentos cilndricos constituidos, generalmente estn ramificadas) y estas ests estn divididas por septas. Y el conjunto de hifas se le llama micelio. La reproduccin asexual de los hongos tiene a lugar en las esporas, que se encuentran en las extremidades de las hifas. Estas esporas tiene una estructura como las uvas. Las esporas asexuales de los hongos se pueden formar de varios tipos;

Clamidiporas Conidiosporas

Los hongos se encuentran de manera asexual y sexual. Y las floriduras que desarrollan encima de los alimentos, pertenecen al grupo; Deuteromicetos, es una subdivisin artificial(reproduccin asexual). La tincin con azul de lactofenol de la pared externa de las estructuras taloficas, se realizan en una sola etapa. Material

Alimento podrido (tomate, naranja) Solucin de azul de lactofenol Cultivo en una placa de petri (TSA) Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio ptico Nansa de picadura Aceite de inmersin Bec Bunsen Agua salina fisiolgica

Procedimiento: Para poder observar los hongos en el microscopio ptico, sin tener ningn tipo de error es aconsejable;

Limpiar el portaobjetos con la disolucin ter etlico (v/v). Secarlo con el papel, hasta que este totalmente seco, y no tenga nada de ter, ya que es un alcohol y puede eliminar las bacterias existentes.

Se coloca una gota de agua salina fisiolgica encima del portaobjetos. Y con la ayuda de la Nansa de picadura esterilizada en el Bec Bunsen se pica un trocito de hongo de la naranja podrida y se expanden por encima de la gota de agua salina fisiolgica, hasta que no se seque. O si no se deja al aire libre para que el portaobjetos se seque. Despus de que se seque la muestra, se coge una gota de azul de lactofenol con una aguja estril y se aade encima de la muestra. Es aconsejable esperar un par de minutos, despus de introducir el reactivo.

Se cubre la muestra con el cubreobjetos y esta preparacin ya esta lista para poder ser observado en el microscopio ptico. Hay que intentar que no queden burbujas de aire en la preparacin, ya que sino lo que se observara mayoritariamente sern las burbujas. Antes de coger el microscopio ptico hay tener en cuenta que depende de como se coja el instrumento se pueden estropear las lentes pticas, ya que al coger bruscamente se pueden desviar de su origen. Con la ayuda de las pinzas se coloca la muestra. Y se centra la muestra con la ayuda del condensador. Sobretodo tener en cuenta que en el principio de todo para observar las estructuras se usa una resolucin de 4X. Despus de encontrar el microorganismo, se puede ir aumentando hasta llegar a la resolucin ms grande. Para poder ver bien el microorganismo. Tincin de Giemsa La tincin de Giemsa es un mtodo habitual para el examen de frotis sanguneos, cortes histolgicos y otro tipo de muestras biolgicas. Este mtodo tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la clula huspedes. La coloracin de giemsa se emplea tambin para teir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la tcnica de citoconcentracin para parsitos sanguneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parsito principal, con excepcin de los trofozoitos jvenes y el plasmodium falciparum. Tambin se emplea la modificacin de Wright. Este mtodo de tincin permite tambin la tincin diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio ptico el ncleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas pueden ser tratados con varios compuestos qumicos que producen la alternancia de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene un patrn de bandas caracterstico, permitiendo que aberraciones estructurales como borrados, duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que permite la identificacin de cromosomas marcadores.

Fundamento Estos organismos adquieren una coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La tcnica de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico y se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.

Preparacin de la muestra Para muestras histolgicas, los mejores resultados se obtienen en muestras fijadas con formol, incluidas en parafina y cortadas entre 3 y 6 micras. Procedimiento 1. 2. 3. 4. Desparafinar e hidratar. Aplicar solucin de trabajo de Giemsa durante 10 minutos. Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios. Aclarar con xilol, 3 cambios.

Resultados 1. 2. 3. 4. 5. 6. Citoplasma: rosa Ncleos: azul Eritrocitos: rosa - naranja Grnulos de las clulas cebadas: prpura Bacterias: azul Parsitos: azul

Variantes Esta tcnica presenta multitud de variantes, pero las diferencias se basan en el empleo o no de diferenciador, el tiempo de permanencia del colorante, el uso de alcoholes en diferente graduacin, etc.

Tincin negativa
Tincin negativa es una tcnica de microscopa que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopa ptica) o a los electrones (microscopa electrnica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta tcnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.1 En caso de microscopa electrnica de transmisin, se emplean sustancias de alto nmero atmico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Tpicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al eletrnico, esta tcnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamao.