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MICROBIOLOGIA

Prcticas de laboratorio

William Romn Cardona Rivera Cd.: 1105782169 Grupo: 201504_25 Tutor de practica: Dr. Jacqueline Lozano Tutor virtual: Ludy Yaneth Mendoza Correo: ludy.mendoza@unad.edu.co

ECAPMA Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD Ceres Mariquita Tolima

Practica No. 1-Normas Generales de Bioseguridad Introduccin Durante el trabajo del laboratorio de microbiologa, se dan situaciones de riesgo que varan segn el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las normas de bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulacin de material peligroso. El estudio de cualquier agente patgeno constituye un riesgo y los grupos de riesgo se establecen en base a los agentes infecciosos y el propsito del laboratorio. Objetivos Establecer normas y principios bsicos de comportamiento en el laboratorio Aprender y utilizar los mtodos de esterilizacin disponibles en el laboratorio Conocer los materiales y equipos utilizados en el laboratorio de microbiologa

Marco terico El trabajo en el laboratorio de microbiologa es un trabajo en grupo. La actitud ante las practicas seguras de cada uno de los integrantes del equipo, determinan su propia seguridad, as como la de sus compaeros y la de la colectividad del laboratorio. Las caractersticas especiales de trabajo en el laboratorio, hacen importante que todos los participantes conozcan y respeten las normas mnimas de bioseguridad. La primera actividad que se debe desarrollar antes de realizar el trabajo de laboratorio es la de conocer y aplicar los principios de bioseguridad para ser conscientes de los riesgos a los que se puede estar expuesto. Equipos e instrumentos cajas de Petri pipetas de diferentes volmenes pipetas de Pasteur autoclave microscopio asas microbiolgicas

Cuestionario 1. Qu es bioseguridad? Es el conjunto de medidas preventivas encaminadas a reducir el riesgo de transmisin de enfermedades infecciosas. Estas medidas preventivas son

una combinacin de sistemas y prcticas que en su lugar legitimo en los laboratorios de ciencias biolgicas para prevenir el uso de agentes patgenos peligrosos y toxinas para su uso malicioso. Los componentes de un programa de bioseguridad de laboratorio incluyen: Seguridad fsica Personal de seguridad Material de control y rendicin de cuentas La seguridad de transporte Seguridad de la informacin Programa de gestin

2. Cules son las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa? - Est prohibido comer, beber, masticar chicle, almacenar alimentos, fumar, aplicarse cosmticos y manipular lentes de contacto en el laboratorio. - El pelo largo debe llevarse recogido y las uas cortas y limpias.
El laboratorio debe mantenerse ordenado y limpio. En las superficies de trabajo debe minimizarse el material que no sea pertinente al mismo. No colocar sus pertenencias (bolsas, mochilas, etc.) sobre las mesas de trabajo. Deben lavarse las manos al inicio y al final del trabajo en el laboratorio, y cada vez que se sospeche contacto con material contaminado. Est terminantemente prohibido pipetear con la boca. En caso necesario, deben usar guantes. Usar protectores de cara, lentes de seguridad y/o mascarillas para proteger la cara o los ojos de salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV u otras radiaciones. Deben trabajar de manera tal de minimizar la creacin de aerosoles. Evitar agitaciones y pipeteos bruscos, as como la introduccin de asas de cultivo calientes dentro de medios de cultivo. Los punzocortantes y el material contaminado debern colocarse en los recipientes que para el efecto se proporcionan. Al finalizar la tarea, deben limpiar y descontaminar las superficies de trabajo. En caso de haber derramado material contaminado, debern proceder inmediatamente a descontaminar el rea afectada.

3. mencione las clases de esterilizacin, cuales son los agentes de

esterilizacin con ms uso en el laboratorio, en que consiste cada uno de ellos y para que materiales se utilizan? Agente de Temperatura Equipo Material que esterilizacin de uso utilizado se puede esterilizar por este mtodo o Esterilizacin Calor seco o 160-180 C Hornos Material de con calor aire caliente Pasteur vidrio(tubos, seco cajas de

Esterilizacin con calor hmedo

Calor hmedo o vapor de agua

121 C

autoclave

Radiaciones

Rayos ultravioleta Membranas filtrantes con poros

Hornos

Filtraciones

filtros

Petri, pipetas) Medios de cultivo preparados, escobillones, gasas entre otros Jeringas descartables, sondas, etc. Emulsiones oleosas o soluciones termolbiles

4. Establecer las diferencias entre esterilizacin y desinfeccin Esterilizacin - Su finalidad es la destruccin de toda forma de vida, aniquilando todos los microorganismos tanto patgenos como no patgenos - Se puede aplicar sobre objetos o material inanimado Se pueden utilizar : - Mtodos fsicos: calor hmedo o autoclave, calor seco u horno de Pasteur, irradiacin ionizante - Mtodos qumicos: xido de etileno, formaldehido, cido paractico, gasplasma a partir de perxido de hidrogeno Desinfeccin - Es el proceso que elimina todos o prcticamente todos los grmenes presentes en los objetos inanimados o sobre tejidos vivos. - Se aplica sobre objetos y tejidos vivos. Se realiza por: - Calor, radiaciones ultravioleta, ultrasonidos, filtracin de aire y flujo laminar, desinfeccin qumica

5. Qu es un medio de cultivo, de que estn compuestos principalmente, como se clasifican segn su proporcin de agar y segn su suministro de nutrientes? Medio de cultivo: es un mtodo de multiplicacin de microorganismos tales como bacterias, hongos y parsitos, y es empleado fundamentalmente para el estudio de las bacterias y otros microorganismos. Un microorganismo se puede sembrar en un medio liquido o en la superficie de un medio solido de agar, los cuales contienen distintos nutrientes que van desde azucares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Los medios liquidas no contienen agar. De acuerdo a la proporcin de agar se pueden clasificar en tres grupos. Medio solido: su proporcin de agar es siempre por encima de 15%

Medio semi-solidos: su proporcin de agar suele ser inferior al 5% pero siempre suele presentar cierta cantidad que le proporciona una consistencia semi-solidad. Medios lquidos o caldos: no contiene agar y su composicin adems de agua suele contener una fuente de carbono, sales minerales, y a veces segn las caractersticas del medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, aminocidos. Medio mnimo: cantidad mnima de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de microorganismos no tan exigentes. Medio complejo: contiene nutrientes de composicin qumica el cual permite el crecimiento de diversos microorganismos. Medio enriquecido: contiene adems de los nutrientes bsicos de un medio de cultivo, sustancias altamente nutritivas como son sueros y sangre. 6. Cul es la utilidad de los medios de cultivo y que diferencia un caldo de un medio solido? La utilidad de un medio de cultivo es la observacin del crecimiento de microorganismos en este ya que les proporciona sustancias alimenticias artificiales para su crecimiento. En un caldo las clulas se cultivan en suspensin por lo que es necesario mantenerlos en agitacin y no contiene agar, y en un medio solido se les agrega agar (u otro agente solidificante) en proporciones que varan dependiendo de qu tan solidos se requieren. 7. Cul es el fundamento de la coloracin de Gram? La tincin de Gram permite identificar la morfologa de las bacterias en cocos y bacilos, Gram positivas y negativas segn la estructura de su pared celular. Las bacterias Gram positivas se tien de color violeta y las bacterias Gram negativas se tien de color rosado. 8. Qu diferencias se encuentran entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas? Gram positivas Gram negativas La pared celular es gruesa y La pared celular est formada est formada por varias capas por una sola capa delgada de de peptidoglucano 80-90% peptidoglucano 20%. Poseen dos clases de cido Est rodeada por una teicoicos anclados en la cara membrana exterior interna de la pared compuesta de fosfolpidos, celular(lipoteicoico y mureira) lipopolisacaridos y lipoprotenas. No son susceptibles a la accin del solvente orgnico La membrana externa es

si no que este acta deshidratando los poros cerrndolos

soluble en solventes orgnicos. No es capaz de retener el complejo de cristal violeta/yodo

9. Indicar las principales caractersticas en hongos y levaduras Hongos Levaduras Son organismos eucarioticos Son hongos unicelulares pertenecientes a los Carecen de clorofila ascomicetos Pared celular de estructura Son ovales, esfricas o similar a la de las plantas cilndricas pero con quitina en lugar de celulosa La mayora son unicelulares pero algunas pueden formar La mayora son aerobios filamentos(cndida albicans) aunque algunos son anaerobios estrictos (rumen) Se dividen asexualmente por gemacin o fisin, y algunos Hbitat terrestre, algunos de gneros presentan un ciclo agua dulce o salada sexual mediante conjugacin Degradan materia orgnica (saccharomyces cerevisiae) La mayora son saprofitos Son tpicos de hbitat con que se nutren de absorcin azucares: frutos, flores, Son quimiorganotrofos corteza de rboles. Se reproducen sexual y Hay especies simbiontes con asexualmente animales y tambin Tienen importancia industrial patgenas para el hombre (hongos unicelulares y Algunas tienen gran filamentosos) importancia a nivel industrial en la obtencin de vinos, cerveza y alcohol. Resultados de la prctica

El agente ms utilizado en este laboratorio para la esterilizacin es el calor hmedo por medio del autoclave. La utilizacin de mecheros al momento de siembra de microorganismos o para esterilizar las asas microbiolgicas.

Conclusiones El trabajo con agentes patgenos puede causar enfermedades graves en el ser humano o en los animales y se transmiten fcilmente de un individuo a otro directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y teraputicas eficaces, lo que si podemos realizar siguiendo las normas de bioseguridad es reducir el riesgo.

Practica No. 2- Medios de Cultivo Introduccin Debemos reconocer que para el desarrollo microbiano se requieren diferentes condiciones, que loes brindan los medios de cultivo y que nos permite diferenciar y aislar los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado(es decir, se le aaden organismos) y a continuacin incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axnico o puro contiene un nico tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras. Objetivos Aprender la preparacin y manipulacin de los medios de cultivo Marco terico Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimentico en el que crecen los microorganismos es le medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Se han preparado ms de 10000 medios de cultivo diferentes. Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial este debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxigeno adecuada, as como un grado de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y peptona a la que se aadirn otros ingredientes. Equipo e instrumentos mecheros agitador

1 balanza Una probeta de 250 ml 4 cajas de Petri Papel kraf Erlenmeyer 500 ml Agar nutritivo

Cuestionario 1. en qu momento se esteriliza un medio de cultivo y por qu? Los medios de cultivo se esterilizan despus de su utilizacin y se esterilizan para evitar la competencia por los nutrientes y as permitir que los microorganismos especficos que se utilizan en un proceso de fermentacin den los rendimientos esperados. Resultados de la prctica Se procedi a preparar un medio de cultivo: 1. Agar nutritivo 20 gr por litro de agua

Se necesitan 4 gr de agar nutritivo para 200 ml de agua destilada

2. Se procedi adicionar los 4 gr de agar nutritivo en el Erlenmeyer con 200 ml de agua destilada estril y se mezcl con el agitador. 3. Luego se llev la preparacin a la estufa y se estuvo agitando constantemente hasta que la solucin quedo totalmente disuelta. 4. Despus se midi el pH y este no cambio de color esto quiere decir que le pH se encontraba entre 7,0 y 7,5. 5. Se tap la boca del Erlenmeyer con papel kraft y se sell con cinta de enmascarar. 6. Se llev el Erlenmeyer al autoclave por 15 minutos a una temperatura de 121oC. 7. Luego se sirvi en las cajas de Petri previamente esterilizadas en presencia del mechero. 8. Posteriormente se deben dejar a una temperatura de 37 oC por 12 o 24 horas. Esta prueba se realiza para mirar si posterior a la incubacin hay presencia o ausencia de microorganismos.

Conclusiones Los medios de cultivo son preparados y empleados para cultivar microorganismos. Segn la especie que se desee cultivar se emplea un tipo de cultivo especifico. Un medio de cultivo tiene todo lo que necesita un microorganismo para vivir.(una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales minerales, agar) El medio de cultivo se vierte liquido pero al enfriarse a temperatura ambiente, el agar se solidifica El medio de cultivo se debe dejar de 12 a 24 horas posterior a la incubacin para evaluar la ausencia o presencia de microorganismos.

Practica 3- siembra de microorganismos Introduccin En esta prctica lo primordial es conocer los mtodos bsicos de siembra de microorganismos. Todos los microorganismos viven y se multiplican gracias a substratos nutritivos que se encuentran en el medio ambiente de forma natural. Nosotros podemos reproducir dichas condiciones en el laboratorio, a fin de observar la presencia, ausencia o comportamiento de determinados microorganismos. Este mtodo se anlisis se llama "medios de cultivo" y es en estos medios donde se "siembran bacterias". Objetivos Determinar las condiciones necesarias para la realizar la siembra de microorganismos Reconocer las distintas siembras y su utilidad

Marco terico Sembrar es colocar una muestra de inoculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre la caja de Petri, que contiene un gel (agar) al que se han aadido las sustancias que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo, a veces se aade otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podran contaminar el cultivo. La siembra se puede realizar en otros tipos de medio de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con lquidos nutritivos para los microorganismos. A continuacin se procede a la incubacin del medio ya sembrado. En cada caso se hace en condiciones particulares de presin de oxgeno, temperatura, agitacin, duracin, etc. Muchas de las bacterias patgenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37oC habituales de nuestro organismo. Si el cultivo bacteriano tiene xito, crecern colonias de bacterias en el medio de cultivo. Estas colonias tienen caractersticas de color, forma, tamao, etc. Propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. Tambin se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioqumicas o de otro tipo para lograr su identificacin. Algunas bacterias son muy difciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han logrado cultivar.

Equipo e instrumentos Asas bacteriologas Papel absorbente Hisopos con cabo de palo Cajas de Petri con medio de cultivo elaborado Cinta de enmascarar Mechero de bunsen

Cuestionario 1. Cul es el medio de cultivo que se emplea para el aislamiento de hongos y levaduras? Medio sabouraud con cloranfenicol y gentamicina: es el medio SAB clsico con la incorporacin de los antibiticos gentamicina y cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayora de bacterias. Se utiliza en tubo o en placa. Resultados de la prctica 1. Se procedi a sembrar dos tipos de microorganismos 2. En una caja de Petri con medio de cultivo nutritivo preparado se realiz una siembra masiva de bacterias que se encuentran en las clulas epiteliales de la boca. con un hisopo previamente esterilizado 3. Luego en otra caja de Petri con medio de cultivo nutritivo preparado se realiz otra siembra masiva de microorganismos de la gripa. 4. Posteriormente se procedi a marcar cada una de las cajas de Petri con el nombre del cultivo, el tipo de siembra y la fecha de realizacin. 5. Los cultivos se deben dejar por lo menos 48 en proceso de incubacin a una temperatura de 37oC

Conclusiones Al reconocer los distintos sistemas de siembras de microorganismos podemos decidir qu tipo de siembra utilizar al momento de incubar determinado tipo de bacterias para obtener el mejor crecimiento de estos microorganismos para su posterior observacin al microscopio.

Practica No. 4- Observacin de Microorganismos y Tcnicas de Tincin Introduccin Por medio de esta prctica se pretende comprender el funcionamiento de los colorantes para la observacin y diferenciacin de microorganismos. Objetivos Conocer y estudiar la morfologa de las bacterias, mohos y levaduras Conocer y aplicar diferentes mtodos de tincin para la identificacin de los microorganismos Determinar las caractersticas morfolgicas microscpicas como forma y agrupacin Aprender a diferenciar los microorganismos Gram positivos de los Gram negativos

Marco terico El tamao de la mayora de todas las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre diferentes tipos de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, capsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehidos, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus este con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con

intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina acida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lpidos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de los grnulos o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorantes liposolubles es un negro Sudan. Algunos colorantes teirn mejor solo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Estas sustancias se denominan mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora si podr atacar el colorante. Equipo e instrumentos Cultivo de microorganismos Azul lactofenol Azul de metileno Colorantes Gram Laminas portaobjetos y cubreobjetos Mechero bunsen Alimento con hongos Asas bacteriolgicas Papel absorbente Frasco de boca ancha Solucin salina fisiolgica estril

Cuestionario 1. segn su morfologa, como se clasifican las bacterias? Las bacterias se pueden clasificar en varios tipos en funcin de varios criterios: Forma: presentan forma de bastn, esfera o espiral. Las que tienen forma de bastn se llaman bacilos, las esfricas se llaman cocos y las que presentan forma de espiral se denominan esperilos. Aerobias: necesitan oxgeno y viven en grietas de hidrotermales Anaerobias: no necesitan oxgeno y producen intoxicaciones

Auttrofas: producen su propio alimento y lo obtienen del dixido de carbono Hetertrofas: no producen su propio alimento y obtienen el carbono de nutrientes orgnicos como azcar. Gram positivas: retienen el tinte y se colorean de violeta Gram negativas: liberan el tinte y se tien de color rosado Saprofitas: se alimentan de sustancias en descomposicin Parasitas: viven a costa de otros organismos causando enfermedades Simbiticas: se asocian con otros organismos intercambiando funciones necesarias para la vida Fermentacin: transforman sustancias orgnicas por medio de un proceso llamado fermentacin 2. Cmo se diferencia una tincin simple de una tincin diferencial? Escribir algunos ejemplos de cada una de las tinciones. En la tincin simple se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad y en la tincin diferencial se utilizan varios colorantes combinados, las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que se fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica. Tincin simple: tinta china, azul de metileno, azul de lactofenol Tincin diferencial: tincin de Gram, coloracin de cido resistencia. 3. Cmo se realiza el frotis bacteriolgico y en que consiste el proceso de fijacin? Realizacin del frotis: - Colocar una gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Se puede usar el asa de siembra ya que el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua. - Flamear el asa siembra, tomar en condiciones aspticas una pequea cantidad del cultivo bacteriolgico en medio slido y transferirlo a la gota de agua, remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea, que quede extendida para facilitar su secado. - Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso se debe tener precaucin de no calentar demasiado el portaobjetos pues las clulas pueden deformarse o romperse. Proceso de fijacin: - Por calor: pasar tres veces el portaobjetos por la llama por unos segundos. Dejar enfriar el portaobjetos entre los pases.

Con metanol: (para bacterias procedentes de medios lquidos) aadir unas gotas de metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar que el metanol se evapore completamente. Una vez realizado el frotis y la fijadas las bacterias, pueden ser observadas al microscopio, aunque carecern de contraste, lo normal es continuar con el proceso de tincin.

Resultados de la prctica Preparacin de la muestra 1. Limpiar y desengrasar los portaobjetos. 2. Se coloca una pequea gota de agua en el portaobjetos. 3. Se realiza una extensin de las bacterias sobre la superficie del portaobjetos. (con el asa de siembra esterilizada pasndola por la llama del mechero). 4. Se deja secar al aire libre. 5. Se fijan las bacterias pasando la cara inferior del portaobjetos por la llama del mechero. Despus de este proceso quedan listas las bacterias para realizar la tincin Tincin Gram 1. Re realiza la coloracin con cristal violeta por dos minutos. 2. Verter el exceso de cristal violeta. 3. Se aade le lugol sobre la preparacin con restos de cristal violeta. Por dos minutos. 4. Decolorar con etanol y elimina el exceso de alcohol. El tiempo debe ser suficiente para que deje de desprenderse el cristal violeta. Sin decolorar totalmente. 5. Lavar con agua inmediatamente. 6. Se tie con safranina durante dos minutos. Despus que la preparacin este seca se puede observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

Observacin al microscopio

Color rosado: E. coli (bacilos) Bacterias Gram Negativas Color violeta: S. Eureus (cocos) Bacterias Gram Positivas

Conclusiones la decoloracin es el paso ms importante, pues debe dejarse un tiempo suficiente para que deje de desprenderse el cristal violeta sin a dejar decolorar completamente. Si se parte de cultivos en medio liquido la muestra se hace directamente Si se parte de cultivos en medio slido, una pequea cantidad de clulas sern suspendidas en una pequea gota de agua. una extensin de aprox. 1 cm2 no contendr demasiadas clulas. Para la fijacin es suficiente pasar el portaobjetos de dos a tres veces por el mechero.

Practica No. 5- Microorganismos del Ambiente Introduccin Entender que todos los microorganismos estn presentes en todos los ambientes y hacen parte de la cotidianidad. Objetivos Realizar la determinacin de la flora humana, ambiental y de superficies. Revisar el grado de contaminacin por bacterias, mohos y levaduras de las muestras de ambiente y superficies. Verificar la efectividad en el proceso de limpieza y desinfeccin

Marco terico Los microorganismos se encuentran en todas partes. Son llevados de un lugar a otro por diferentes mtodos entre los que estn las corrientes de agua, aire, insectos, etc. El aire no es un medio de reproduccin, en el y junto a las gotitas, se transportan gran cantidad de microorganismos.se encuentran en los sedimentos marinos, en la piel del hombre, en las escamas de los peces, en la superficie de las hojas de los vegetales, en los alimentos, en el conducto digestivo, nariz, boca, etc. Son de especial importancia en la fertilidad de los suelos, la transformacin de desechos o ciertos procesos agroindustriales en los que se involucra la fermentacin (cerveza, lcteos fermentados, productos de la soya fermentados, etc.). La piel y las mucosas sirven de albergue a un gran nmero de microorganismos que se pueden determinar cmo flora residente y flora transitoria, si estos son permanentes o se pueden controlar cuando cambian las condiciones para su desarrollo. Equipos e instrumentos Cajas de Petri con agar nutritivo Mechero bunsen Fsforos Microscopio Frasco de boca ancha Tubos con agua destilada estril Hisopos estriles Cinta de enmascarar

Cuestionario 1. Cules son las diferencias entre flora residente y flora transitoria? Flora residente Flora transitoria Est presente en la piel No residen habitualmente en la piel Cuando es introducida al cuerpo por una herida se produce la Es adquirida de una fuente contaminacin dando origen a la contaminada infeccin Son contaminantes recientes Se multiplica y sobrevive en la Su presencia no superan las 48 piel horas Puede ser replicada por cultivo No se multiplican Las manos actan como fuente Las manos solo sirven de de infeccin transporte El lavado o desinfectado solo Se adquieren por contacto con elimina el 80% de los grmenes otros pacientes infectados o Los grmenes ms comunes colonizados(equipos son: estafilococos coagulasa contaminados, medio ambiente) negativo, micrococos, bacilos El lavado o desinfectado es difteroides. suficiente, menos cuando la carga bacteriana es alta. Los grmenes ms comunes son: E. coli, pseudomona aeruquinosa, salmonella, shigella, estafilococos aereus. Resultado de la prctica

Se realiz una siembra de cultivo de los microorganismos del ambiente del laboratorio en un medio de cultivo de agar nutritivo y se puso a incubar Conclusiones Los microorganismos estn presentes en todas partes y el ambiente no es la excepcin. Las bacterias aceleran la descomposicin de los animales muertos Las bacterias que se encuentran en estos ambientes son transitorias, lo cual estas permanecen latentes en la superficie hasta la muerte.

Practica No. 6- observacin y recuento de colonias Introduccin En esta prctica se realiza una observacin y recuento de colonias en las cajas de agar nutritivo de la prctica de flora ambiental y flora humana y re realiza un recuento al microscopio Objetivos Diferenciar las normas de crecimiento bacteriano en los diferentes medios de cultivo utilizados. Realizar el recuento de diferentes colonias

Marco terico Para recuento de microorganismos presentes en una muestra de agua, suelo, aire, alimento, cultivos, entre otros, existen diferentes mtodos o tcnicas: algunas tcnicas son directas y permiten un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como las muertas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrnico, el recuento en placa, o el clculo de nmeros las probable (NMP). Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masa de las clulas como son la turbidez, el peso seco, o una actividad metablica. Equipos e instrumentos Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos Cuenta de colonias Cajas de Petri con cultivos Azul de lactofenol Aguja de diseccin

Cuestionario 1. identificar y describir las caractersticas de cada una de las fases de la curva de crecimiento de los microorganismos (latencia, logartmica, estacionaria y muerte). Fase de Adaptacin de los microorganismos. Latencia No se presenta cuando el inoculo es nuevo. Cuando el inoculo es viejo requiere de este periodo.

Fase logartmica

Fase estacionaria

Fase de muerte

Durante esta etapa la masa celular puede cambiar sin cambiar el nmero de clulas. Es un periodo de balance o de estado estacionario de crecimiento, durante el cual la velocidad especfica de crecimiento es constante. La composicin qumica del medio de cultivo est cambiando debido a que los nutrientes se estn consumiendo y productos metablicos son producidos. los nutrientes se agotan y los productos txicos se acumulan. La masa total puede permanecer constante pero el nmero de clulas puede descender. La tasa de crecimiento es igual a la tasa de muerte. la tasa de muerte es mayor a la tasa de crecimiento. Los nutrientes se agotan y se acumulan productos txicos.

Resultados de la prctica
Tcnica de aislamiento y recuento: Banco de diluciones

Esta tcnica nos permite un doble objetivo, el aislamiento de colonias y adems el recuento de los microorganismos que tenemos en el cultivo inicial. Se trabaja con cinco tubos con suero fisiolgico estril, uno de ellos con 10 ml y el resto con 9 ml, en el orden que se muestra en la figura. Mediante una pipeta estril tomar 1 ml del cultivo mixto y depositarlo en el primer tubo. Agitar hasta conseguir una suspensin homognea. Tomar otra pipeta estril y de este primer tubo transferir 0,1 ml al segundo tubo, agitar y repetir la operacin transfiriendo 1ml del segundo al tercer tubo, del tercero al cuarto y del cuarto al quinto. Una vez realizado el banco de diluciones procederemos a sembrar de los tres ltimos tubos (diluciones 10 , 10
4 5y 6

10 ) 0,1 ml en placas de agar nutritivo. Se depositan los 100 microlitros en la

superficie del agar y se debe extender la muestra en toda la superficie del mismo, utilizando para ello el asa de vidrio. Para esterilizar el asa de vidrio, en primer lugar se introduce en alcohol y se flamea encendindola con la llama del mechero bunsen. Dejar que se consuma la llama y abriendo la placa lo justo para introducir el asa, extender la muestra arrastrndola con la base del tringulo por toda la superficie del medio hasta que ste absorba toda el agua. Incubar a 37C durante 24 horas y realizar el recuento de las colonias calculando la concentracin de clulas en el tubo inicial mediante la frmula:

ufc / ml = N x D x 10

Dnde: ufc = unidades formadoras de colonias D = dilucin N = n de colonias

Recuento del nmero de colonias en las placas sembradas con las diluciones 104, 105 y 106 (para facilitar el recuento se utiliza un rotulador de vidrio punteando una a una cada colonia)

Conclusiones
el banco de diluciones Se realizan una serie de diluciones seriadas a partir del cultivo mixto Con esta tcnica conseguimos adems de aislar colonias, obtener un recuento del nmero de bacterias que tenemos en el cultivo.

Practica No. 7- efecto de los desinfectantes sobre los microorganismos Introduccin El esta prctica se pretende distinguir entre esterilizacin y desinfeccin adems de conocer y utilizar los desinfectantes para el control microbiano. Objetivos Evaluar la eficiencia de algunos desinfectantes sobre algunos microorganismos Marco terico Se define esterilidad a la condicin de ausencia de cualquier microorganismo. Significa destruccin de toda forma de vida microbiana incluyendo esporas. Los mtodos de esterilizacin ms usados en el laboratorio son el calor seco, calor hmedo, flameado, utilizacin de soluciones qumicas. La desinfeccin se refiere a la reduccin de organismos patgenos (organismos que ocasionan enfermedades). Los desinfectantes de acuerdo a su composicin qumica se clasifican en: fenoles, hipocloritos (cloro), yodoforos (yodo povidona), amonio cuaternario, formaldehidos, perxidos. Los desinfectantes pueden ser de bajo nivel, de nivel intermedio o de nivel alto. Los desinfectantes de bajo nivel (fenoles, amonio cuaternario) pueden destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, tanto Gram positivas como Gram negativas, algunos virus (virus con envoltura lipida) y hongos (levaduras), pero no Mycobacteriumspp, ni las esporas bacterianas. Los desinfectantes de nivel intermedio consiguen inactivar todas las formas bacterianas vegetativas, incluyendo Mycobacterium tuberculosis, la mayora de los virus (virus con o sin envoltura) y hongos filamentosos, pero no destruyen necesariamente las esporas bacterianas. En cambio los desinfectantes de alto nivel (formaldehidos, perxidos, hipocloritos) consiguen destruir todos los microorganismos, excepto algunas esporas bacterianas. Equipo e instrumentos Hisopos estriles Pinzas estriles Hipoclorito de sodio Cajas de Petri con agar nutritivo Creolina Frasco de boca ancha desinfectantes

Cuestionario 1. Cules agentes qumicos son ms efectivos en el control de microorganismos? Los hipocloritos: tienen un coeficiente de n=1 lo que se refleja en que pequeos cambios en la concentracin requieren pequeos cambios en el tiempo de aplicacin. Los fenoles: poseen un coeficiente de disolucin de n=5 o 6 lo que implica que aun pequeos cambios en la concentracin provocan cambios muy acentuados en el tiempo para lograr un mismo efecto, si reducimos la concentracin de fenol desde un valor dado a su mitad necesitamos emplear 64 veces ms de tiempo para conseguir matar una misma cantidad de bacterias. 2. Con que criterios se selecciona un agente qumico para desinfectar: superficies, ambientes, objetos contaminados, la piel? - Espectro de accin: viendo sobre que acta y como acta - Solubilidad en agua y otros disolventes: suelen usarse disueltos - Estabilidad: que se mantenga la actividad antimicrobiana - Homogeneidad: deben ser homogneos para que todas las dosis sean iguales - Inocuidad: que no sea toxico y que no dae los materiales ni produzca daos al medio ambiente - Efectividad: en las condiciones en las que se va a usar - Disponibilidad: en grandes cantidades 3. Qu pruebas se realizan para probar la efectividad de un desinfectante? - Tcnica de dilucin en tubo: se coge la sustancia de determinar y se hacen disoluciones que se hacen a distintos tubos de ensayo, se mete en el medio de cultivo adecuado y se inocula la misma cantidad de microorganismos en todos los tubos. Luego se mira si hay o no crecimiento por la turbidez, el ltimo tubo donde no hay crecimiento da la misma cantidad inhibidora. - Tcnica de difusin en placa: se inocula una placa con el microorganismo y luego se puede poner en papel de filtro con la solucin que queremos evaluar, o tambin se hace un pocillo al que aadimos una concentracin conocida de sustrato. - Tcnicas de coeficiente fenlico: compara el compuesto con la efectividad del fenol, es una tcnica oficial. Se usa siempre dos bacterias. se hacen disoluciones con el compuesto a evaluar al igual que con el fenol, se mete el medio de cultivo y se inocula, se incuba y se observa cual crece y cual no, se observa a que concentracin se produce la muerte de la bacteria y se compara con la concentracin de fenol que dio los mismos

resultados. (nos da el coeficiente fenlico, si el valor es superior a 1 el compuesto tiene ms efecto que el fenol, si el efecto es menor que 1 tendr menos efecto.) Resultados de la prctica 1. Tomar 2 cajas de Petri de agar nutritivo marcar con el nmero de grupo y la fecha en la tapa de la caja.

2. -

Asignar cdigo a los desinfectantes que se van a utilizar 01. Hipoclorito 02. Ct 500 manos 03. Ct 500 industrial 04. Creolina 05. Glutarandehido al 50%

3. marcar la caja de Petri con los cdigos de los desinfectantes

4. encender el mechero, humedecer un hisopo estril en el tubo que contiene microorganismos a sembrar.

5. sembrar masivamente las bacterias en la caja de agar nutritivo y descartar los hisopos en el tarro de boca ancha con solucin de hipoclorito

6. con las pinzas estriles tomar un disco de papel de filtro y sumergirlo en la solucin de desinfectante, colocar sobre el nmero que le corresponde segn la codificacin de la base de la caja.

7. hacer lo mismo con cada uno de los desinfectantes a utilizar y colocar las pinzas en el recipiente para descarte de material.

8. llevar las cajas a incubar a 370C por 24 horas

9. cumplido el tiempo de incubacin tomar las cajas y con ayuda del cuenta colonias observar los aros de inhibicin del crecimiento, zonas transparentes alrededor del crecimiento bacteriano

10. medir el tamao de los aros de inhibicin con la ayuda de la regla y segn las observaciones se indica cual es la sustancia que es mejor en el control de cada microorganismo.

Conclusiones Un desinfectante es una sustancia qumica que inhibe o destruye microorganismos al aplicarla sobre material inerte sin alterarlo significativamente.