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manual
Procedimientos de Laboratorio

manual

Procedimientos de Laboratorio
LABORATORIOS LOCALES I
LABORATORIOS LOCALES II

Ministerio de Salud Instituto Nacional de Salud Proyecto Salud y Nutricin Bsica

Coordinadora del Equipo de Edicin: Supervisin tcnica:

Dra. Susana Zurita Macalup INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PROYECTO SALUD Y NUTRICIN BSICA Dr. Alvaro Gaillour Ferradas Dr. Carlos Bardlez del Aguila PROYECTO SALUD Y NUTRICIN BSICA Dra. Ariela Luna Flrez Lic. Ingrid Guzmn Sota

Edicin, diagramacin:

Editora Impresora Telfono: 330-4300 Ricardo Zegarra Prez

Amarilys

e.i.r.l.

Ilustraciones: Impresin:

Editora Impresora Amarilys e.i.r.l. Telefax: 431-7053

Per, diciembre de 1999 PROYECTO SALUD Y NUTRICIN BSICA Convenio PER - BIRF 3701.PE Av. Salaverry cuadra 8 s/n. Reservados todos los derechos Impreso en el Per Printed in Per 1000 ejemplares

Seor Doctor

ALEJANDRO AGUINAGA RECUENCO


Ministro de Salud

Seor Doctor

ALEJANDRO MESARINA GUTIRREZ


Vice Ministro de Salud

Seor Doctor

EDUARDO FALCON ROSADIO


Jefe del Instituto Nacional de Salud

Seor Doctor

ALVARO GAILLOUR FERRADAS


Gerente General del Proyecto Salud y Nutricin Bsica

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Introduccin

l Instituto Nacional de Salud, tiene como uno de sus fines el que la poblacin del pas cuente con diagnsticos de laboratorio de calidad. Una de las ms importantes estrategias para este fin es fortalecer la red de laboratorios.

Este fortalecimiento est dado en diferentes reas: el apoyo en el diseo y equipamiento de laboratorios de referencia regionales, la transferencia de tecnologas a travs de la capacitacin del personal de laboratorio de todos los niveles de atencin y la interrelacin entre ellos, as como su relacin con otros sectores comprometidos en la salud pblica. El presente texto complementa el trabajo que viene realizando uno de los rganos de lnea del Instituto Nacional de Salud que es el Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica que, conjuntamente con el Proyecto de Salud y Nutricin Bsica del Ministerio de Salud, har llegar a las unidades tomadoras de muestras y a los laboratorios del Primer Nivel de Atencin (Laboratorios Locales I y II), las tcnicas y procedimientos estandarizados que se viene utilizando para las diferentes pruebas de laboratorio que se realiza en ese nivel. Sin embargo, dejamos claro que las tcnicas y procedimientos se renuevan permanentemente, siendo nuestra responsabilidad alcanzar estos cambios en forma oportuna. Intentamos que este manual permita a profesionales, tcnicos y auxiliares de laboratorio, sistematizar sus conocimientos y probablemente en algunos casos acceder a nuevos. Constituye tambin el antecedente que garantice el desarrollo de trabajos de investigacin sobre bases confiables, con la garanta de un personal experto y competente. Junto con este documento, y tal como se desprende de la experiencia institucional, ser muy fcil realizar el sistema de supervisin y control de calidad de los procedimientos mediante preparaciones y patrones que permitan su valoracin. Los editores han tomado como base los manuales que el Instituto Nacional de Salud ha editado desde 1995. Estamos en espera de las sugerencias que los usuarios hagan y dispuestos a brindar la asesora tcnica que requieran sobre los temas aqu abordados.

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Presentacin

na de las caractersticas ms importantes del Proyecto Salud y Nutricin Bsica (PSNB), es la posibilidad de introducir estrategias comunicacionales innovativas, que permitan lograr un efectivo equilibrio de la percepcin individual y mdica sobre la demanda de servicios. Complementario y paralelamente a ello, el Proyecto busca, adems, adecuar los servicios de salud y sus mensajes a las necesidades reales, y mejorar la calidad de atencin de salud mediante una adecuada reorganizacin de los servicios. En la lnea del fortalecimiento de los servicios de salud y el mejoramiento de la calidad de atencin a la poblacin, la organizacin del conjunto de laboratorios de salud pblica en redes, resulta en una efectiva descentralizacin de los procedimientos estandarizados. A travs de la Red de Laboratorios, se establecen normas para la prestacin del servicio, la capacitacin, supervisin y el control de calidad. Asimismo, se coordinan y promueven las actividades de capacitacin y de transferencia tecnolgica necesarias en relacin con los diferentes niveles de complejidad. Un elemento importante para que la red de laboratorio sea funcionalmente eficiente, es la estandarizacin y difusin de los procedimientos de laboratorios bsicos, en un manual de procedimientos. El presente Manual de Procedimientos de Laboratorio, constituye un esfuerzo profesional multidisciplinario, que introduce contenidos tcnicos de manera gil y concreta, con una diagramacin atractiva para el usuario. La presentacin y sus contenidos, han sido validados con los mismos usuarios y, en diferentes niveles y mbitos. Estamos seguros que esfuerzos conjuntos y complementarios como el desarrollado por el Proyecto Salud y Nutricin Bsica y el Instituto Nacional de Salud del Ministerio de Salud, se constituyen en ejemplos claros a tomar en cuenta para potenciar las capacidades del sector en el cumplimiento de objetivos comunes. La colaboracin conjunta permite en este momento llenar un vaco, que permaneca no-cubierto, y de importancia relevante para el desarrollo funcional de las redes de laboratorio.

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CAPITULO I

PROCEDIMIENTOS GENERALES DE LABORATORIO


PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD .. 15 MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO ................................. 15 LABORATORIOS BSICOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1 y 2.................................. 18 Las reglas ms Importantes ................. 18 Medidas en caso de accidentes ........... 23 Material de bioseguridad recomendado 24 PROCEDIMIENTOS PARA LA ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN DE MATERIAL ................................................... 26 OBJETIVOS.................................................. 26 MTODOS DE ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN........................................... 27 Calor hmedo ....................................... 27 Calor seco ............................................ 29 Desinfeccin intensiva por inmersin en productos qumicos .............................. 31 Desinfeccin por frotacin con un producto qumico ....................................... 34 ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN DE MATERIAL ....................................................36 Esterilizacin .........................................36 Desinfeccin Intensiva ..........................36 DESECHO DE MUESTRAS Y MATERIALES INFECTADOS ...............................................37 MATERIAL CONTAMINADO PARA ELIMINACIN ...............................................37 Incineracin...........................................38 Entierro de desechos ............................39 MATERIAL CONTAMINADO PARA El TRATAMIENTO EN AUTOCLAVE Y REUTILlZACIN ...........................................40 Esterilizacin y limpieza de los recipientes no desechables .....................................40

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PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es un conjunto de procedimientos tcnicos que se debe practicar diariamente y que no debe olvidar el personal de laboratorio. Los procedimientos de bioseguridad tienen por finalidad: PROTEGER Al personal de laboratorio contra la exposicin innecesaria e injustificada a microorganismos infecciosos. EVITAR La contaminacin de las muestras que puede echar a perder el trabajo del laboratorista con resultados falsos. MANTENER Los microorganismos infecciosos dentro del ambiente del laboratorio.

MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO

Es importante conocer los tipos de microorganismos infectantes con los que trabajamos, para tomar las medidas de bioseguridad respectivas. Los microorganismo s infectantes se clasifican por grupos de riesgo, dependiendo de: La capacidad infectante del microorganismo. Los modos de transmisin (por ejemplo: aerosoles). Si son prevenibles por medio de inmunizacin (vacuna contra la hepatitis B, fiebre amarilla, etc.). Si se dispone de medidas eficaces para el tratamiento contra el microorganismo infectante (por ejemplo: uso de antibiticos).

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LABORATORIOS BSICOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1 y 2


El fundamento de una buena seguridad en el laboratorio es el desarrollo de tcnicas microbiolgicas apropiadas.

LAS REGLAS MS IMPORTANTES a. Del ambiente


Colocar un cartel que indique: "Riesgo biolgico" en las puertas de los ambientes en donde se manipulan microorganismos infectantes de Riesgo 2.

El laboratorio debe mantenerse limpio y aseado, retirando cualquier material que no tenga relacin con el trabajo. Los pisos deben limpiarse con soluciones desinfectantes. No se debe barrer el piso en seco, ni encerar.

La mesa de trabajo se descontaminar al terminar la jornada laboral y en caso de derramamiento de sustancias peligrosas.

El desempolvado debe ser hecho con una tela limpia, saturada con desinfectante y exprimida. No hacerlo con un plumero.

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Cuando no se disponga de ventilacin mecnica, las ventanas podrn abrirse y deben estar provistas de mosquiteros. Se deben eliminar tragaluces y claraboyas.

Deber haber un programa de lucha contra insectos y roedores.

Se debe colocar extinguidores, que deben ser recargados cada ao.

b. Del personal
En la zona de trabajo del laboratorio no se perntir al personal comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicarse cosmticos.

En el laboratorio se utilizarn batas, uniformes u otras prendas apropiadas. Esta ropa no se llevar fuera del laboratorio, es decir, no se llevar a las oficinas, bibliotecas, salas de personal, cafeteras, etc.

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La ropa protectora no se guardar en los mismos armarios que la ropa de calle.

Las personas que tengan cabello largo deben protegerse con gorro o mantenerlo amarrado hacia atrs. El cabello largo es peligroso cerca al fuego del mechero, incluso puede contaminarse con muestras clnicas y puede ser un riesgo cerca de los equipos. Asimismo, se deben quitar los brazaletes o collares largos antes de comenzar a trabajar.

Fuera de la zona de trabajo deben existir espacios para guardar la ropa de calle y los objetos personales, as como para comer y beber.

Todo personal del laboratorio debe recibir inmunizacin protectora, segn la naturaleza de sus funciones, contra ttanos, difteria, hepatitis viral B, rabia, etc.

c. Del ambiente

Se debe usar guantes en todos los trabajos con riesgo de contacto accidental directo con sangre, material infeccioso o animales infectados.

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No se debe utilizar pipetas para aspirar con la boca ("pipetear"), se deben usar propipetas, pipetas automticas u otro equipo adecuado.

No se debe pasar la lengua por las etiquetas, ni se deben colocar los materiales en la boca.

El personal del laboratorio se lavar las manos antes y despus de haber manipulado material o animales, as como al retirarse del laboratorio.

Es necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos de sustancias. Se debe usar gafas, viseras u otro elemento de seguridad.

Durante el trabajo se mantendrn cerradas las puertas del laboratorio, no se permitir la entrada de nios en las zonas de trabajo del laboratorio.

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Para manipular lquidos no se usarn jeringas ni agujas hipodrmicas. Se debe usar pipetas automticas, propipetas u otros.

Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados se descontaminarn antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a usar. Se introducirn en bolsas de plstico que se anudarn, para esterilizarse en autoclave o incinerarse fuera del laboratorio. Si es necesario desplazar las bolsas a otro lugar para proceder a la descontaminacin, se colocarn en recipientes de fondo slido, que se puedan cerrar antes de sacarlas del laboratorio.

Por el sistema de desage slo se deben eliminar los microorganismos infecciosos o reactivos qumicos previamente descontaminados, neutralizados o inactivados.

Limpiar. peridicamente los congeladores y las refrigeradoras en los cuales se almacenan los cultivos o los sueros y retirar los frascos y tubos rotos. Usar mascarilla y guantes de jebe durante su limpieza.

Todos los accidentes y exposiciones reales o potenciales a material infeccioso se notificarn inmediatamente al jefe del laboratorio. Se debe hacer un informe escrito de tales accidentes.

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MEDIDAS EN CASO DE ACCIDENTES

a. Inoculacin accidental, cortes o abrasiones, quemaduras pequeas


Se deber quitar la ropa protectora de la persona afectada.

Lavarse las manos y las lesionadas con agua y jabn.

partes

Aplicarse un desinfectante cutneo adecuado, dirigirse al mdico e informarle sobre la causa de la herida y sobre los microorganismos implicados.

b. Rotura o derramamiento de recipientes con cultivos


En caso de accidentes por derrame de una muestra en el piso o la mesa, cubrir con papel peridico. Empapar ste cuidadosamente con fenol al 5% y dejar que acte durante 30 minutos como mnimo antes de limpiar el rea.

En todo momento usar guantes.

c. Ingestin accidental de material posiblemente infeccioso.


Quitarse la ropa protectora, trasladarse al servicio mdico. Se informar al mdico sobre el material ingerido y se seguir sus consejos.

El accidente deber ser registrado.

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d. . Emisin de un aerosol posiblemente peligroso

Todas las personas debern evacuar inmediatamente la zona afectada. Se colocarn seales que indiquen: "Prohibida la entrada".

Al cabo de una hora podr efectuarse la descontaminacin, para ello se usar ropa protectora y proteccin para las vas respiratorias.

Las personas afectadas sern atendidas en el servicio mdico.

MATERIAL DE BIOSEGURIDAD RECOMENDADO

a. Dispositivos para sustituir el uso de la pipeta con la boca

El uso de tapn de algodn en la pipeta, no constituye un filtro bacteriano eficaz y puede permitir el paso de partculas durante la succin.

Cuando el tapn est muy ajustado puede requerirse una succin enrgica, con el riesgo de aspirar el algodn, un aerosol e incluso lquido.

El empleo de dispositivos especiales permite evitar la ingestin de agentes patgenos o de sustancias qumicas.

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b. Cmaras o cabinas de seguridad biolgica

Constituye el principal elemento que acta como barrera fsica para evitar el riesgo de infecciones transmitidas por el aire (aerosoles).

Impide la salida de estos aerosoles a la atmsfera del laboratorio y por lo tanto su inhalacin por el personal. No impiden las salpicaduras y no son eficaces contra los riesgos qumicos.

Estas cmaras de seguridad biolgica se utilizan en los siguientes casos:

En los procedimientos con grandes posibilidades de producir aerosoles, con riesgo de infeccin transmitida por el aire. Por ejemplo en: la trituracin, el mezclado, las agitaciones o mezclas enrgicas, la apertura de envases con material infeccioso.

Cuando se manejan concentraciones elevadas o grandes cantidades de material infeccioso.

c. Frascos y tubos con tapa rosca


Se usan para lograr una barrera fsica de las muestras y cultivos.

d. Autoclaves

Se usan para esterilizar el material contaminado.

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PROCEDIMIENTOS PARA LA ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN DE MATERIAL


Esterilizar

Significa eliminar de un objeto o de una sustancia todos los virus, bacterias y esporas. En consecuencia, el material de laboratorio que se ha esterilizado queda libre de microorganismos vivos.

Desinfeccin

Por productos qumicos que matan todos los virus y bacterias, pero no las esporas.

OBJETIVOS

Preparar los materiales para la recoleccin de muestras (deben estar estriles placas Petri, tubos, etc.).

Desinfectar los materiales contaminados.

Preparar los materiales que se emplean en los cultivos bacterianos (placas Petri, pipetas Pasteur, tubos, etc.).

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MTODOS DE ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN


En el laboratorio mdico, la esterilizacin y la desinfeccin se logra con los siguientes mtodos:

Calor hmedo.
Autoclave, olla de presin, ebullicin.

Calor seco.
Horno de aire caliente, flameado.

Desinfeccin intensiva por inmersin en productos qumicos.


Hipoclorito sdico, cloramina, etc.

Desinfeccin por frotacin con un producto qumico.

CALOR HMEDO
La esterilizacin por vapor (autoclave) es el procedimiento de eleccin para el instrumental mdico de uso repetido. Los autoclaves y las ollas a presin deben funcionar a 121C (250F) durante un mnimo de 20 minutos. Esta temperatura equivale a una presin de 1 atmsfera por encima de la presin atmosfrica (010,325 newtons/m2).

a. Olla de presin
Un tipo de autoclave barato es la olla a presin corriente, convenientemente modificada (OMSIUNICEF).

Las ollas de presin son cacerolas amplias, construidas paracocinaralimentos con gran rapidez empleando vapor a presin. En laboratorios pequeos se usan para esterilizar los utensilios con que se recolectan las muestras.

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PROCEDIMIENTO

1. Llenar con agua el fondo de la olla. 2. Colocar los materiales que se van a esterilizar en la canastilla, que se sostendr
arriba del nivel del agua por medio de un soporte.

b. Autoclave

PREPARACIN DE MATERIALES ESTERILIZACIN EN AUTOCLAVE

PARA

LA

MATERIAL DE VIDRIO Los tubos de muestras, las placas Petri, etc.; se envolvern en papel Kraft y se atarn con cordeles.

PIPETAS PASTEUR Se colocarn en tubos amplios y largos, que se taponarn inmediatamente despus. Tambin se pueden envolver con varias hojas de papel Kraft.

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c. Ebullicin
Este procedimiento slo se debe usar cuando no hay otra alternativa. Usar un recipiente especial para esterilizar por ebullicin, o si no una cacerola.

PROCEDIMIENTO 1.
Llenar con agua, desmineralizada. Calentar en la estufa. Colocar los utensilios de vidrio en el recipiente mientras el agua est an fra. Colocar los utensilios metlicos (pinzas, etc.) en el recipiente cuando el agua est hirviendo. Hervir durante 20 minutos los utensilios para colectar muestras. de preferencia

2. 3.

4.

5.

CALOR SECO a. Horno de aire caliente

La esterilizacin por el calor seco en horno elctrico slo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal (pipetas, etc.) que puedan soportar una temperatura de 170C (340F).

Los hornos domsticos corrientes constituyen un buen recurso para la esterilizacin por calor seco.

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PROCEDIMIENTO 1.
Preparar el material para esterilizar, del mismo modo que para el procedimiento de autoclave. Los tapones de algodn no debern ser demasiados gruesos, de modo que pueda entrar el aire. Levantar ligeramente las tapas de los estuches metlicos y. disponer de modo que miren a la parte posterior del horno. El tiempo de esterilizacin es de 2 horas a 170C (340F). Apagar el horno. Esperar a que la temperatura descienda hasta 40C. Abrir la puerta del horno. Cerrar las tapas de los estuches metlicos. Sacar los materiales estriles. El papel empleado para envolverlos deber haber tomado un color marrn oscuro. Si el color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado lo suficiente; si el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado.

2.

3. 4.

5.

b. Flameado
Este procedimiento slo se deber utilizar con utensilios metlicos como pinzas y bistures. No es conveniente para uso general.

PROCEDIMIENTO 1.
Colocar los utensilios en una bandeja metlica. Aadir unas 10 gotas de etanol y encender el fuego.

2.

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3.

Durante el flameado, inclinar bandeja de un lado a otro.

la

4.

Calentar las asas bacterianas en la llama de un mechero Bunsen o de alcohol, hasta que el asa se ponga al rojo vivo.

DESINFECCIN INTENSIVA POR INMERSIN EN PRODUCTOS QUMICOS

a. Desinfectantes qumicos
Las frmulas de los productos desinfectantes comerciales presentan grandes diferencias. Es esencial, por lo tanto, que las diluciones se hagan de acuerdo con lo recomendado por los fabricantes.

PRINCIPIOS GENERALES l.
La mayora de los desinfectantes qumicos tienen efectos txicos, por lo que se utilizarn guantes, delantal y proteccin ocular al diluir desinfectantes a granel. En la prctica los desinfectantes qumicos no son confiables porque pueden quedar inactivados por la sangre o por cualquier otra materia orgnica. Tambin pueden perder rpidamente potencia si se guardan en un sitio caluroso. En el caso de instrumentos punzantes o cortantes, slo debe utilizarse como ltimo recurso, cuando no se pueda recurrir a la esterilizacin, asegurando que se limpie minuciosamente el instrumental antes de sumergido en el desinfectante qumico.

2.

3.

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b. Desinfectantes qumicos eficaces para inactivar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)


Hipoclorito sdico Cloramina Etanol Alcohol isoproplico Yodopolividona Formaldehdo Glutaral (glutaraldehdo) Perxido de hidrgeno 0,1 - 0,5% de cloro disponible. 2% (tosilcloramida sdica) 70%. 70%. 2,5%. 4%. 2% 6%.

HIPOCLORITO LEJA, ETC.)


SDICO

(LQUIDOS

BLANQUEADORES,

Son baratos y fciles de adquirir. Matan bacterias y virus. Tienen dos inconvenientes importantes: Se deterioran Las soluciones deben estar preparadas recientemente, la descomposicin rpida puede ser un problema importante en las ciudades de clima clido. Son corrosivas Corroen el acero, que contiene nquel, cromo, hierro y otros materiales oxidables. Las soluciones no deben prepararse en recipientes metlicos, ya que stos se corroen rpidamente. El contacto no debe durar ms de 30 minutos e ir seguido de un enjuague y secado minucioso.

CLORAMINA (TOSILCLORAMIDA SDICA, CLORAMINA T)


Es ms estable que el hipoclorito sdico. Sin embargo, debe protegerse de la humedad, la luz y el calor excesivo. Puede obtenerse en forma de polvo o de tabletas.

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ALCOHOL ETLICO y ALCOHOL ISOPROPLICO


El alcohol etlico (etanol) y el alcohol isoproplico tienen propiedades desinfectantes semejantes. Son eficaces para formas vegetativas de bacterias, mycobacterias, hongos y virus, luego de algunos minutos de contacto. No son eficaces contra esporas bacterianas. Para conseguir la mxima eficacia, deben usarse en una concentracin de 70% (70 mI de alcohol absoluto y 30 mI de agua destilada). El etanol puede emplearse en su forma desnaturalizada, que puede ser ms barata.

YODOPOLIVIDONA
Es un compuesto que lleva yodo. No debe usarse sobre aluminio y cobre. Puede usarse diluida al 2,5% (una parte de solucin al 10% y 3 partes de agua hervida). La inmersin durante 15 minutos en una solucin al 2,5% permite hacer una desinfeccin intensiva del material limpio. Las soluciones diluidas (2,5%) para sumergir el instrumental deben renovarse todos los das.

FORMALDEHDO (FORMOL, FORMALINA)


Las preparaciones comerciales de formaldehdo (formol, formalina) contienen un 35% - 40% de formaldehdo, un 10% de metanol yagua. Deben usarse en dilucin 1: 10 (la solucin final contiene 3,5% - 4% de formaldehdo). Esta solucin diluida destruye las formas vegetativas de bacterias, los hongos y los virus en 30 minutos y las esporas bacterianas al cabo de 3 horas. Despus de la inmersin, enjuagar bien todo el material antes volver a utilizado. La solucin y los vapores que emite son txicos e irritante s lo que limita su uso como desinfectante.

GLUTARAL(GLUTARALDEHDO)
Se comercializa en forma de solucin acuosa al 2% que hay que "activar" antes de usar, aadiendo polvo o lquido de glutaral que se mezcla con la solucin acuosa y que la hacen alcalina. Una vez activada la solucin, no se debe guardar ms de 2 semanas. Si se enturbia, habr que desecharla.

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Como solucin activada, destruye las formas vegetativas de bacterias, los hongos y los virus en 30 minutos. Para destruir las esporas se precisa 10 horas de inmersin. El glutaral se considera actualmente un producto txico, irritante. Debe evitarse el contacto con la piel, los ojos y las vas respiratorias.

PERXIDO DE IDDRGENO (AGUA OXIGENADA)


La inmersin de material limpio en una solucin al 6% proporciona una desinfeccin intensiva en 30 minutos. Se prepara a partir de una solucin estabilizada al 30% (1 parte de solucin estabilizada al 30% Y 4 partes de agua hervida). El perxido de hidrgeno no debe usarse en un ambiente caluroso. Tiene poder corrosivo, no debe usarse con objetos de cobre, aluminio, zinc o latn.

DESINFECCIN POR FROTACIN CON UN PRODUCTO QUMICO

La frotacin con un desinfectante adecuado es un procedimiento aceptable en el caso de superficies (mesas, etc.) y de salpicaduras de sangre. Cuando stas son visibles, se empezar por derramar desinfectante sobre la superficie; luego se retirar la mezcla de sangre y desinfectante.

El hipoclorito sdico desinfectante ms indicado.

es

el

Si se usa alcohol hay que frotar la superficie varias veces porque el producto se evapora.

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(a) Situaciones "limpias":

por ejemplo: limpio.

instrumental

mdico

(b) Situaciones "sucias":

por ejemplo: salpicaduras de sangre, instrumental sucio.

La cantidad de cloro disponible que se precisa en las soluciones usadas para la desinfeccin intensiva depende de la cantidad de materia orgnica presente, ya que sta (por ejemplo: la sangre y la pus) inactiva el cloro.

Los lquidos blanqueadores de uso domstico suelen tener un 5% de cloro disponible.

La leja de sosa tiene cerca de un 5% de cloro disponible.

La leja concentrada tiene cerca de un 15% de cloro disponible.

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ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN DE MATERIAL


ESTERILIZACIN

Inactiva (mata) todos los virus, bacterias y esporas.

Esterilizacin por vapor a presin durante 20 minutos o ms: 121C (250F) a 1 atmsfera adicional. Esterilizacin por calor seco: 2 horas a 170C (340F).

@ @

En olla a presin o autoclave.

En horno elctrico.

DESINFECCIN INTENSIVA
Inactiva (mata) todos los virus y bacterias, pero no las esporas. Ebullicin durante 20 minutos

@ @

En cacerola Hipoclorito sdico al 0,5%. Cloramina al 2%. Alcohol etlico al 70%. Alcohol isoproplico al 70%. Yodopolividona al 2,5%. Formaldehdo al 5%. Glutaral al 2%. Perxido de hidrgeno al 6%.

Inmersin en desinfectantes durante 30 minutos

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DESECHO DE MUESTRAS Y MATERIALES INFECTADOS

Hay que establecer un sistema de identificacin y separacin de desechos de muestras y materiales infectados:

Material contaminado para eliminacin. Material contaminado para el tratamiento en autoclave y reutilizacin. Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura.

MATERIAL CONTAMINADO PARA ELIMINACIN

Las muestras examinadas en el laboratorio (heces, sangre, pus, esputo, orina, etc.) frecuentemente son infectantes. Despus de examinarlas se deben destruir para evitar todo riesgo de contaminacin. Estas muestras se pueden desechar en cajas de cartn o recipientes de material plstico que se pueden destruir, quemar (incinerar) o enterrar. La incineracin es el procedimiento ms fcil y efectivo.

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INCINERACIN

a. Fabricacin de un incinerador

1.

Disponer de un barril o latn metlico grande, usado. Fijar con firmeza una rejilla de metal resistente (R) aproximadamente a un tercio de la altura del barril. Cortar en el metal una abertura amplia o ventanilla (V) abajo del nivel que ocupa la rejilla. Conseguir una tapa suelta (T) para el barril.

2.

3.

4.

b. Procedimiento de incineracin

l.

Al terminar el trabajo de cada maana y cada tarde colocar en la rejilla del incinerador todas las cajas usadas con heces y esputo. El barril metlico deber estar firmemente cerrado (por medio de la tapa y la ventanilla) excepto durante la incineracin.

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2.

Incinerar una vez por semana o ms frecuentemente, si es necesario. Llenar el fondo del barril con papeles, palos, virutas, etc. Quitar la tapa. Encender el fuego y alimentarlo hasta que todos los materiales infectados se encuentren reducidos a cenizas.

3.

Estas cenizas no son peligrosas y se pueden arrojar al basurero.

ENTIERRO DE DESECHOS

1.

Abrir una fosa de 4 a 5 metros de profundidad y de 1 a 2 metros/ de ancho.

2.

Fabricar una tapa que se ajuste con firmeza a la boca de la fosa. Es conveniente reforzar el borde de la boca de la fosa con un revestimiento de ladrillos o piedras.

3.

Dos veces al da arrojar en la fosa las cajas usadas con heces, esputo u otras materias infectadas. Colocar inmediatamente la tapa en su lugar.

4.

Una vez por semana cubrir los desechos con una capa de hojas secas (de 10 centmetros de espesor, aproximadamente). Si es posible, en vez de hojas secas depositar una capa de cal viva por semana.

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MATERIAL CONTAMINADO PARA EL TRATAMIENTO EN AUTOCLAVE Y REUTILIZACIN


ESTERILIZACIN Y LIMPIEZA DE lOS RECIPIENTES NO DESECHABLES

Los frascos y matraces pueden contener: Materias sumamente cefalorraqudeo ).

infecciosas

(heces,

esputo,

pus,

lquido

Otras muestras (sangre, orina).

a. Recipientes con heces


Llenar los frascos que contengan heces con una solucin de fenol al 5% u otro desinfectante similar. Dejarlos en reposo por 24 horas. A continuacin, vaciarlos en el lavadero. Limpiar los frascos con detergente yagua.

b. Recipientes con cefalorraqudeo

esputo

tubos

con

pus

lquido

Existen varios procedimientos:

USO DEL AUTOCLAVE


Este es el conveniente. procedimiento ms

40

l.

Colocar los recipientes en el autoclave tal como se encuentran y esterilizarlos durante 30 minutos a 120C para destruir todos los microorganismos.

2.

Una vez que se hayan enfriado vaciarlos en el lavadero.

3.

Limpiarlos con agua y detergente.

EBULLICIN EN SOLUCIN DETERGENTE

l.

Se requiere un recipiente o cacerola amplia especial para este propsito.

2.

Hervir los recipientes de esputo, durante 30 minutos, en agua que contenga polvos para lavar en solucin fuerte (cristales de carbonato sdico), a razn de 60 ml por cada litro de agua.

EMPLEO DE SOLUCIN DE FORMALDEHDO O FENOL

l.

Colocar en cada recipiente de esputo: 10 ml de solucin de formaldehdo in diluir, o 5 ml de fenol al 5%.

Dejar en reposo durante 24 horas.

2.

Luego, enjuagar.

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c. Matraces con orina

l.

Vaciar los matraces en el lavadero.

2.

A continuacin, llenarlos con: Una solucin de leja comercial al 10%, o Una solucin de fenol al 2%.

3.

Dejarlos en reposo horas.Luego enjuagar.

durante

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d. Tubos con sangre

1.

Los tubos con sangre extrada el mismo da se debern: Enjuagar con agua fra corriente. Remojar en una solucin detergente.

2.

Los tubos. con sangre que han permanecido varios das a temperatura ambiente, donde los microorganismos se pueden multiplicar, se debern: Llenar con una solucin de leja comercial al 10%. Dejar en reposo durante 12 horas. Enjuagar y limpiar enseguida.

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CAPTULO II

USO, CUIDADOS Y MANTENIMIENTO PREVENTIVO DE EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIOS


EL MICROSCOPIO......................................47 COMPONENTES DEL MICROSCOPIO .......47 MEDIDAS GENERALES DE CONSERVACIN EL MICROSCOPIO......... 51 Materiales.............................................51 Limpieza de los objetivos .....................51 Limpieza de los oculares ......................52 Limpieza del condensador y el espejo..52 Limpieza del bastidor y la platina .........52 Precauciones adicionales.....................53 EL AUTOCLAVE .........................................55 TIPOS DE AUTOCLAVES ............................ 55 COMPONENTES DEL AUTOCLAVE ........... 55 CALENTAMIENTO DEL AUTOCLAVE......... 56 PROCEDIMIENTOS PARA LA ESTERILIZACIN ........................................ 57 BALANZAS .................................................60 TIPOS DE BALANZAS ................................. 60 PROCEDIMIENTO PARA PESAR................ 61 CENTRFUGAS ...........................................62 COMPONENTES DE UNA CENTRFUGA ... 62 TIPOS DE CENTRFUGAS .......................... 63 PROCEDIMIENTO PARA USAR LA CENTRIFUGA ELCTRICA ......................... 63 INCUBADORA ............................................ 65 POTENCIMETRO ..................................... 65 ESPECTROFOTMETRO .......................... 66 AGLUTINOSCOPIO .................................... 67 HEMOGLOBINMETRO DE SAL ............. 68 ROTADOR................................................... 68 MATERIAL DE VIDRIO ............................... 69 PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR MATERIAL DE VIDRIO SUCIO.....................69 PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR MATERIAL DE VIDRIO NUEVO ...................70 PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR LMINAS PORTAOBJETOS NUEVAS.........70 PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR LMINAS PORTAOBJETOS SUCIAS ..........71 PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR PIPETAS .......................................................71 PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR JERINGAS ....................................................72 PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR CUBREOBJETOS .........................................73

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EL MICROSCOPIO
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO
Se pueden agrupar en cuatro sistemas: a. b. c. d. El sistema de soporte. El sistema de aumento. El sistema de iluminacin. El sistema de ajuste.

a.

El sistema de soporte
Consiste en: El pie. El bastidor. El revlver (cambiador de objetivos). La platina. La platina mecnica, que imprime un movimiento lento y regulado al porta objeto.

b.

El sistema de aumento
LOS OBJETIVOS El poder de aumento de cada objetivo se indica por un nmero grabado en la manga de la lente: El objetivo l0x aumenta 10 veces. Su distancia de operacin es de 5 - 6 rnm. El objetivo 40x aumenta 40 veces. Su distancia de operacin es de 0,5 - 1,5 rnm. El objetivo 100x aumenta 100 veces. Su distancia de operacin es de 0,15 - 0,20 rnm.

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El objetivo de l00x generalmente se encuentra marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersin.

Cuanto mayor sea el poder de resolucin del objetivo, ms clara ser la Imagen.

EL OCULAR El poder de aumento se encuentra marcado en el ocular: Un ocular 4x aumenta 4 veces la imagen que produce el objetivo. U n ocular l0x aumenta la imagen 10 veces.

Para calcular el aumento total de la imagen del objeto que se observa, se multiplica el poder de aumento del objetivo por el del ocular. El poder de aumento de los microscopios, utilizados en los laboratorios mdicos oscila entre 50 y 1 000.

c. El sistema de iluminacin
LA FUENTE LUMINOSA Luz elctrica

Puede proporcionarla un foco contenido en el microscopio por debajo de la platina o mediante un foco exterior colocado frente al microscopio. Luz del da

El microscopio nunca se debe utilizar ni debe permanecer bajo la luz directa del sol. Deber estar bien iluminado, pero se usar una luz amortiguada. Si la luz del sol es excesivamente brillante, se colocar frente al microscopio una botella de vidrio claro, llena de agua, para reducir la intensidad de la luz.

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EL ESPEJO

El espejo refleja los rayos de la fuente luminosa sobre el objeto. Tiene una superficie plana y otra cncava. El lado cncavo constituye un condensador de escaso poder.

EL CONDENSADOR Lleva los rayos luminosos a un foco comn sobre el objeto que se habr de examinar.

Se encuentra colocado entre el espejo y la platina.

Se puede elevar (iluminacin mxima) y bajar (iluminacin llnima). Se debe centrar y ajustar adecuadamente.

EL DIAFRAGMA Se encuentra dentro del condensador, se utiliza .para reducir o ampliar el ngulo, y, por lo tanto, tambin la cantidad de luz que entra en el condensador.

FILTROS En algunos microscopios se ajustan filtros de colores (por ejemplo: azules) debajo del condensador.

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d. El sistema de ajuste

Este sistema comprende:

l. LA CREMALLERA DE AVANCE RPIDO Es el tornillo mayor. Se utiliza para lograr la aproximacin del enfoque.

2. EL TORNILLO MICROMTRICO DE AVANCE LENTO Hace que el objetivo se desplace ms lentamente. Se emplea para conseguir un enfoque perfecto del objeto.

3. EL TORNILLO DE AJUSTE DEL CONDENSADOR Se utiliza para elevar el condensador y aumentar la iluminacin o descenderlo y reducir la iluminacin.

4. LOS TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR Puede haber tres tornillos colocados alrededor del condensador. Se usan para centrar el condensador exactamente en relacin con el objetivo.

5. EL ELEVADOR DEL DIAFRAGMA IRIS Es un pequeo elevador que se encuentra fijo al condensador. Se puede mover para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando as el ngulo y la intensidad de la luz. REGULADORES MECNICA DE LA PLATINA

6.

Se usa para desplazar el portaobjeto sobre la platina. Un tornillo lo desplaza hacia atrs y hacia delante. Otro tornillo lo desplaza a la izquierda o la derecha.

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MEDIDAS GENERALES DE CONSERVACIN DEL MICROSCOPIO

La inspeccin del microscopio antes de su uso y la limpieza despus de su uso son hbitos que contribuyen a la buena conservacin de este equipo.

MATERIALES

Trapo de lino fino. Papel lente o papel absorbente tipo pauelo descartable. Tambin una piel de gamuza o trapo del tipo que no desprenda pelusa. Un frasco pequeo de xilol (o tolueno). Una pequea pera de goma o pincel fino.

LIMPIEZA DE LOS OBJETIVOS

OBJETIVOS SECOS
Limpiados con un trapo suave, moviendo el trapo de un lado a otro y no en crculos.

OBJETIVOS DE INMERSIN EN ACEITE


Deben limpiarse despus de su uso con papel especial para lentes o papel absorbente, humedecido con tolueno o xilol para .eliminar el aceite de inmersin. Por ningn motivo la lente de inmersin quedar sin limpiarse, en caso contrario el aceite se secara y ocasionara la inutilizacin del objetivo.

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Al terminar la jornada diaria de trabajo, antes de guardar el microscopio, quitar el polvo de los objetivos arrojndoles aire con la pera de goma. Si es necesario, limpiar el polvo remanente usando el pincel fino.

LIMPIEZA DE LOS OCULARES


Limpiar la superficie superior de la lente (en la que se aplica el ojo) con un trapo suave o papel de seda. Limpiar la superficie inferior de la lente (dentro del tubo del microscopio) con el pincel fino.

LIMPIEZA DEL CONDENSADOR Y EL ESPEJO


El condensador se limpia de la misma manera que los objetivos, con un trapo suave o papel de seda humedecido con xilol. El espejo se limpia con trapo suave humedecido con alcohol etlico de 95.

LIMPIEZA DEL BASTIDOR Y LA PLA TINA


Limpiar con una pieza de piel de gamuza o un trapo suave, que no desprenda pelusa.

Nunca se debe usar xilol ya que puede desprender la pintura negra del microscopio.

La platina se puede limpiar usando papel absorbente impregnado de vaselina.

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PRECAUCIONES ADICIONALES

EN CLIMAS CLIDOS Y SECOS


El problema principal es el polvo. Las partculas finas penetran en las roscas de los tornillos y debajo de las lentes. Se puede evitar tomando en cuenta lo siguiente: Mientras no se use, conservar el microscopio bajo una cubierta de material plstico a prueba de aue. Limpiar el microscopio con aplicaciones de aire de la pera de goma. Limpiar las lentes con una brocha especial o un pincel fino. .

EN LOS CLIMAS CLIDOS Y HMEDOS


EN LOS LABORATORIOS QUE CUENTAN CON ELECTRICIDAD

Guardar el microscopio en un armario templado, acondicionado mediante uno o dos focos de 50 vatios.

EN LOS LABORATORIOS QUE NO CUENTAN CON ELECTRICIDAD

Colocar junto al microscopio una bolsa de 15 - 20 cm de dimetro, con no menos de 250 g de gel de slice azul (que indica humedad al tomar un color rojizo). Cuando el silicagel se tome rosado se debe cambiar por otro o calentar hasta que se tome azul para su reutilizacin.

51

52

EL AUTOCLAVE
El vapor de agua a presin constituye el procedimiento ms eficaz de esterilizacin del material de laboratorio.

TIPOS DE AUTOCLAVES
Autoclave de desplazamiento por gravedad. Autoclave de vaco. Autoclave de olla a presin.

COMPONENTES DEL AUTOCLAVE

l. CALDERA

Consiste en un cilindro amplio y profundo en el que se colocan los utensilios para esterilizar.

2. CANASTA Es una canasta amplia de alambre donde se ponen los utensilios que se esterilizarn.

3. SOPORTE DE CANASTA Se encuentra en el fondo del autoclave y sostiene la canasta por encima del nivel del agua.

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4. DRENAJE Dispositivo colocado en la base de la caldera, por donde sale el exceso de agua.

5. TAPA La tapa cubre y cierra hermticamente la caldera; se ajusta mediante una arandela de goma.

6. SUJETADORES DE LA TAPA Estos sujetadores, junto con la arandela de goma, cierran hermticamente la tapa e impiden que escape el vapor.

7. VLVULA DE SALIDA DEL AIRE Esta vlvula, que se encuentra en la parte superior de la caldera o en la tapa, se emplea para dejar que salga el aire cuando empieza el agua a calentarse.

8. VLVULA DE SEGURIDAD Se halla en la parte superior de la caldera o en la tapa, y deja escapar el vapor cuando la presin se eleva demasiado, evitando as que ocurra una explosin.

9. INSTRUMENTOS INDICADORES DE LA TEMPERATURA O DE LA PRESIN Se encuentran en la parte superior de la caldera o en la tapa. La temperatura se indica en grados Celsius (OC).

CALENTAMIENTO DEL AUTOCLAVE


El sistema de calentamiento puede estar construido dentro del autoclave en forma de dispositivos elctricos o de gas.

De lo contrario, el autoclave se calentar sobre un quemador de gas butano o de gas de kerosene (primus).

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PROCEDIMIENTOS PARA LA ESTERILIZACIN

1.

Llenar con agua el fondo de la autoclave, hasta el soporte de la canasta.

2. Introducir en el autoclave la canasta


con los materiales que se van a esterilizar. El material y los objetos que se han de esterilizar deben agruparse sin apretarlos de modo que el vapor pueda circular sin dificultad y que pueda salir fcilmente. Las bolsas de plstico estarn abiertas para que el vapor penetre en su contenido.

3.

Cerrar la tapa del autoclave, cerciorndose que la arandela de goma se encuentre en su surco. Entornillar a niveles iguales los sujetadores de la tapa.

4.

Abrir la vlvula de salida del aire.

5.

Iniciar el calentamiento del autoclave.

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6.

Vigilar la vlvula de salida del aire hasta que aparezca un chorro de vapor, que se har uniforme y continuo en 3 4 minutos. Esto indicar que todo el aire se ha expulsado del autoclave.

7.

Cerrar a continuacin la vlvula de salida del aire.

8. Observar el indicador, cuando llegue


a 121C se deber regular el calor para conservarlo y empezar a medir un tiempo mnimo de 20 minutos para material de vidrio y un tiempo de 30 minutos para recipientes que contengan material infectado (esputo, pus, etc.).

9.

Reducir totalmente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.

10. Cuando la temperatura descienda a menos de 100C abrir la vlvula de salida


del aire para igualar las presiones dentro y fuera del autoclave.

11. Cuando cese el silbido aflojar los


sujetadores de la tapa y quitarla. Dejar enfriar el autoclave y, a continuacin, retirar la canasta con los materiales estriles.

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BALANZAS
La sensibilidad de una balanza es la masa ms pequea que esa balanza puede pesar con precisin.

TIPOS DE BALANZAS

a. Balanza abierta de dos platillos

Tiene dos platillos. Puede usar pesas separadas o tener una varilla graduada en la que se coloca una pesa corrediza. Se emplea para pesar cantidades grandes (hasta varios kilos). Su sensibilidad es de 0,5 g (500 mg).

b. Balanza analtica

Esta balanza consta de dos platillos suspendidos de una varilla dentro de un estuche de vidrio.

Pesa cantidades pequeas (20 200 g, dependiendo del modelo) o cuando se requiere gran precisin, por ejemplo: 3,88 g, 0,200 g.

Su sensibilidad es de 0,5 mg - 0,1 mg, dependiendo del modelo de la balanza.

Para usar correctamente la balanza analtica se deben seguir las siguientes instrucciones:

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l.

La varilla se debe encontrar inmvil antes de que se coloquen en los platillos las pesas y la sustancia que se va a pesar. Antes de retirar de los platillos las pesas y la sustancia que se ha pesado, la Ivarilla deber quedar nuevamente inmvil. Colocar la sustancia que se va a pesar sobre un papel doblado cuatro veces, o en un cristal cncavo o un platillo de porcelana. Asegurarse que los platillos de la balanza se encuentran equilibrados aflojando el tornillo liberador de la varilla despus de cerrar el estuche de vidrio.

2.

3.

4.

PROCEDIMIENTO PARA PESAR

Es importante seguir las siguientes instrucciones y as evitar confusiones.

l.

Colocar a la izquierda de la balanza el papel en que pesar la sustancia. En el platillo derecho colocar las pesas equivalentes al peso del papel ms el de la cantidad de sustancia que va a pesar. Leer la etiqueta de la sustancia: Antes de retirar el recipiente de la alacena. Mientras se pesa la sustancia. Despus de pesar la sustancia.

2.

3.

4.

Rotular la sustancia pesada

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CENTRIFUGAS
La fuerza centrfuga hace que un cuerpo se ponga en movimiento circular a gran velocidad, de este modo las partculas que hay en los lquidos se colocan en el fondo de los tubos de centrifugaci6n y se forman los sedimentos centrifugados.

Estos sedimentos pueden contener, segn el lquido centrifugado: clulas sanguneas, huevos de parsitos, clulas de los conductos urinarios, etc.

COMPONENTES DE UNA CENTRFUGA

I. EJE CENTRAL El cual gira a gran velocidad.

2. CABEZAL FIJO AL EJE Est provisto de cubetas para sostener los tubos de centrifugaci6n.

3. TUBOS DE CENTRIFUGACIN Contienen el lquido que se va a centrifugar. Se montan en el cabezal.

4. CRONMETRO Detiene la centrfuga automticamente cuando se cumple el tiempo.

5. CONTADOR DE REVOLUCIONES Tiene una aguja que indica la velocidad en revoluciones por minuto.

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TIPOS DE CENTRFUGAS

a. Centrfuga manual
Gira por medio de un manubrio. Contiene de 2 a 4 tubos. Se usa para examinar sedimentos en la orina y para concentrar ciertos parsitos en las heces.

b. Centrfugas elctricas
Las centrfugas elctricas se construyen con dos tipos de cabezal.

CABEZAL OSCILANTE Durante la centrifugacin los tubos se colocan en posicin horizontal.

CABEZAL OBLICUO Sostiene los tubos en un ngulo de 45, durante la centrifugacin. Es til en los ensayos de aglutinacin para determinar grupos sanguneos por el mtodo del tubo de ensayo.

PROCEDIMIENTO PARA USAR LA CENTRFUGA ELCTRICA

l.

Equilibrar las cubetas. Si estn numeradas, colocar el tubo 1 frente al tubo 2, el tubo 3 frente al tubo 4.

61

Equilibrar los tubos que se encuentren frente a frente pesndolos en sus cubetas en una balanza de dos platillos: Agregar al tubo de menor peso cierta cantidad del lquido que va a centrifugar, o Agregar agua en la cubeta que contenga el tubo de menor peso. Si slo se va a centrifugar un tubo que contenga lquido, equilibrarlo con un tubo idntico lleno de agua.

2.

Encender el motor y aumentar gradualmente la velocidad girando con lentitud la perilla hasta lograr la velocidad deseada. Detener la centrfuga gradualmente, algunos modelos tienen frenos. Retirar los tubos lentamente y con cuidado.

3. 4.

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INCUBADORA
Est provista de un calentador que nos permite obtener temperaturas entre 25 a 100C. Es controlada mediante un termmetro.

Para incubar bacterias y otros organismos, se usa una temperatura constante.

Para su buen uso se debe seguir las recomendaciones del fabricante.

POTENCIMETRO
Es un equipo que se usa para medir la diferencia de potencial entre dos puntos. Se utiliza en el laboratorio para medir el pH de las soluciones.

Consta de un conductor de seccin uniforme por el cual circula una corriente continua, la diferencia de potencial entre dos puntos cualesquiera es proporcional a la distancia entre ellos.

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ESPECTROFOTMETRO
La espectrofotometra, se basa en la propiedad de ciertas sustancias que tienen color propio, o pueden dar lugar a productos finales coloreados con ciertas reacciones qumicas. De esta manera, la intensidad del color puede utilizarse para medir la concentracin de dicha sustancia.

El espectrofotmetro consta de las siguientes partes:

FUENTE DE LUZ Cuando se trabaja con luz visible y ultravioleta, se emplea un foco con filamento de tungsteno. Habitualmente se trata de una lmpara de bajo voltaje constante o de una batera.

DISPOSITIVO DE MONOCROMIA Suelen emplearse filtros de luz de vidrio coloreado o de gelatina coloreada con sustancias adecuadas, entre dos placas de vidrio. Los filtros de vidrio o gelatina coloreada transmiten la luz entre lmites bastantes amplios de longitudes de onda. Este hecho hace que no pueda utilizarse cuando se requiere trabajar con longitudes de onda ms precisas.

PORT AMUESTRAS Pueden ser tubos de ensayo redondos o cubetas de paredes planas. Se emplea generalmente tubos redondos, por su menor costo.

CONTROL DE SENSIBILIDAD Se utiliza una hendidura variable o un diafragma iris para modificar la cantidad de luz que llega al elemento fotosensible.

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DETECTORES FOTOSENSI BLES Son fotoceldas de capa interpuesta, formadas por una placa metlica sobre la cual se deposita un semiconductor. El voltaje que produce la fotocelda de capa interpuesta es proporcional a la cantidad de luz que llega y se mide directamente.

UN APARATO DE LECTURA O REGISTRO, GALVANMETRO CALIBRADO EN UNIDADES DE ABSORBANCIA O GRAFICADOR Para los anlisis qumicos habituales, suelen preferirse los instrumentos basados en fotoceldas con capa interpuesta, pues su mantenimiento no es costoso. Para manejar adecuadamente la instalacin, contribuir al mantenimiento del sistema, se requiere seguir las instrucciones del fabricante. Es preciso, asimismo, conocimientos de qumica.

AGLUTINOSCOPIO
Se utiliza en la prueba sexolgica para el diagnstico de brucelosis.

Est compuesto de un estuche de madera de 48 x 33 x 12 cm. Lleva en su parte anterior un tubo fluorescente de 15 vatios o un foco de 25 vatios, que permite iluminar oblicuamente la mezcla de suero antgeno.

Tanto el interior como el exterior est pintado de color negro mate. Est provisto de una tapa de vidrio para evitar una evaporacin demasiada rpida de la mezcla de suero.

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HEMOGLOBINMETRO DE SAHLI
Es un equipo que mide la hemoglobina por comparacin visual, el principio que la sustenta es que la sangre se diluye en una solucin cida y la hemoglobina se transforma en hematina cida. El color de la solucin de ensayo se compara con el de un cristal de referencia.

Consta de un tubo especialmente calibrado que contiene solucin cida. La mezcla de la sangre y el cido producir un color castao pardusco. Este tubo calibrado se coloca en el hemoglobinmetro y se compara con el color del tubo patrn de referencia.

Es un instrumento de fcil manejo pero no es til para calcular C<:>ll precisin la hemoglobina, porque no todas las formas de la hemoglobina circulante se transforman en hematina cida y la comparacin de colores a simple vista no es exacta.

ROTADOR
Es un agitador rotatorio de 180 ciclos por minuto, que describe un crculo de 2 cm de dimetro en un plano horizontal. Se utiliza en la prueba de VDRL. Sobre la plataforma rotatoria se encuentran dos placas de vidrio con anillos de cermica que limitan superficies de 14 mm de dimetro. A la izquierda de la plataforma se ve un contador que registra el nmero de vueltas.

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MATERIAL DE VIDRIO

PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR MATERIAL DE VIDRIO SUCIO

l.

Colocar en un recipiente que contenga leja al 10%, los materiales sucios y dejar en reposo por 2 - 3 horas.

2.

Eliminar la leja lavando el material a chorro de agua, enseguida dejar en solucin saturada de detergente durante 30 minutos.

3.

Lavar con cepillo (cepillar 4 veces), enjuagar con agua de cao y luego con agua destilada.

4.

Escurra los materiales (vasos, matraces, probetas), con las bocas hacia abajo en una canastilla de alambre y cubrir con tela delgada.

5.

El material limpio y seco se deber guardar en una alacena para protegerlo del polvo. Es mejor taponar los utensilios de vidrio con algodn no absorbente, o cubrir la boca con pequeas tapas hechas de papel Kraft.

67

PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR MATERIAL DE VIDRIO NUEVO

Los materiales de vidrio nuevo que nunca se utilizaron son ligeramente alcalinos. Para neutralizarlos debe hacerse lo siguiente:

l.

Poner en un recipiente adecuado 3 litros de agua con 60 ml de cido clorhdrico (solucin al 2%).

2.

Sumergir los materiales de vidrio sin usar en esta solucin por 24 horas.

3.

Enjuagar dos veces con agua corriente y una vez con agua desmineralizada. Por ltimo, secarlos.

PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR LMINAS PORTAOBJETOS NUEVAS

l.

En un recipiente adecuado preparar agua con detergente, colocar las lminas una a una y dejarlas en remojo toda la noche. Enjuagar cada lmina con agua de cao. Limpiar una a una, con un trapo suave, que no desprenda pelusa. Colocarlas separadas, sobre una hoja de filtro de papel, una a una. Dejarlas secar. Luego, juntarlas en grupos de 10 20 y envolverlas con hojas de papel.

2.

3.

68

PROCEDIMIENT0S PARA LIMPIAR LMINAS PORTAOBJET0S SUCIAS l. 2.


Si presentan residuos de aceite de inmersin frotarlas con papel peridico. Preparar un recipiente con agua fra o tibia y detergente. Si las lminas se han usado con muestras infectadas (orina, heces, etc.) se deben colocar en solucin desinfectante. Dejarlas en remojo durante 24 horas. Enjuagarlas por separado bajo el chorro de agua y a continuacin ponerlas en remojo durante 30 minutos en un recipiente lleno de agua. Para la limpieza, secado y envoltura, seguir las mismas instrucciones que se han dado para los portaobjetos nuevos.

3.

4.

PROCEDIMIENT0S PARA LIMPIAR PIPETAS

l.

Tan pronto como se haya usado una pipeta colocarla en un recipiente que contenga leja al 10% o fenol al 5% por 2 - 3 horas. Enjuagar con agua de cao y lavar con solucin saturada de detergente.

2.

3.

Enjuagar cada una detenidamente con el chorro de agua del cao. Secar las pipetas de vidrio Pyrex en el horno de aire seco a 60C y las de vidrio ordinario en la incubadora a 37C o al aire.

69

PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR JERINGAS

Es recomendable el uso de jeringas y agujas descartables, de no contar con estas facilidades, se proceder de la siguiente manera:

l.

Inmediatamente despus de usar una jeringa quitar el mbolo, colocarla en un recipiente que contenga solucin de hipoc1orito sdico al1 % (leja) por 30 minutos.

2.

Enjuagar el mbolo y el cilindro. Llenar el cilindro con agua y colocar el mbolo en su lugar; impulsar con fuerza el agua a travs de la jeringa. Por ltimo, quitar la aguja y colocarla en su estuche y descartarla.

3.

Si la jeringa y el mbolo son difciles de separar, se puede aflojar de varias maneras: Poner en remojo la jeringa en agua caliente, durante 2 horas. Con una pipeta Pasteur delgada introducir solucin de cido actico al 50% por la boca de la jeringa, teniendo el mbolo hacia abajo durante 10 minutos. Poner la jeringa en remojo durante varias horas en un recipiente con perxido de hidrgeno a 10 vol.

70

PROCEDIMIENTOS PARA LIMPIAR CUBREOBJETOS


Despus de usar los cubreobjetos se pueden recuperar, limpiar y usar nuevamente.

Para limpiarlos:

l.

Remojarlos en una solucin de detergente ms un desinfectante: 3 mI de detergente de uso domstico en 200 mI de agua y 15 mI de leja. Dejarlos en remojo durante 2 - 3 horas, movindolos suavemente de vez en cuando. Enjuagar cuatro veces el recipiente donde estn los cubreobjetos con agua de cao, agitndolo suavemente. Lavar por ltimo con agua desmineralizada. Escurrir los cubreobjetos, colocndolos cuidadosamente de punta sobre una pieza de gasa doblada. Secarlos en el horno de aire caliente a 60C. Conservarlos en una placa Petri pequea. Utilizar una pinza para sacarlos.

2.

3. 4.

5. 6.

71

CAPTULOIII

SANGRE
RECIPIENTES PARA TOMA DE MUESTRAS..................................................77 Principios generales .............................77 FRASCOS Y TUBOS PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE SANGRE ...........................79 Para obtener sangre sin anticoagulante 79 Para obtener sangre con anticoagulante ......................................79 OBTENCIN DE SANGREVENOSA ...........80 Principios generales .............................80 Sangre coagulada ................................81 Sangre anticoagulada...........................81 Materiales .............................................82 Mtodo de obtencin ............................82 OBTENCIN DE GOTA GRUESA...............87 Materiales .............................................87 Mtodo de obtencin ............................87 OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR .........90 Mtodo de obtencin90 PREPARACIN DE EXTENSIONES DE SANGRE ......................................................91 Principios generales .............................91 Materiales .............................................91 Mtodo de obtencin ............................91 Preparacin de la extensin .................92 TINCIN DE EXTENSIONES DE SANGRE 96 Principios generales .............................96 Tincin de Leishman ............................96 Tincin de Giemsa................................98 Tincin de Wright................................ 100 Resultados ......................................... 101 LAS CLULAS SANGUNEAS ....................102 Tipos de clulas sanguneas ................102 ESTUDIO DE LAS CLULAS SANGUNEAS ..............................................103 HEMOGRAMA COMPLETO.........................103 Principios generales ............................. 103 Materiales ............................................. 104 Mtodo ................................................. 104 Resultados anormales.......................... 107 Examen de los leucocitos..................... 109 Descripcin de los tipos de leucocitos.. 111 Clulas anormales................................ 114 GLBULOS ROJOS O ERITROCITOS ANORMALES ...............................................117 Principios generales ............................. 117 Alteraciones estructurales en el Tamao ................................................ 118 Alteraciones estructurales en la forma . 119 Alteraciones cromticas ....................... 120 Inclusiones anormales.......................... 121 RECUENTO DEL NMERO DE LEUCOCITOS O GLBULOS BLANCOS ............................122 Principios generales ............................. 122 Materiales .............................................122 Mtodo ..................................................123 Mtodo de recuento ..............................125 RECUENTO DEL NMERO DE ERITROCITOS O GLBULOS ROJOS................................. 126 Principios generales..............................126 Materiales .............................................127 Mtodo ..................................................127 Procedimiento de recuento ...................129 HEMATOCRITO........................................... 131 Principios generales..............................131 Mtodo de mlcroescala .........................131 HEMOGLOBINA: CLCULO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA............... 136 MTODO FOTOMTRICO .......................... 136 Principios generales..............................136 Materiales .............................................136 Calibracin del colorrmetro ...................137 Mtodo fotomtrico de la cianometahemoglobina .........................139 TIEMPO DE SANGRA ................................ 142 MTODO DE DUKE..................................... 142 Principios generales..............................142 Materiales .............................................142 Mtodo ..................................................142 Resultados ............................................144 TIEMPO DE COAGULACIN DE LA SANGRE COMPLETA ................................................. 145 MTODO DE LEE Y WHITE ........................ 145 Principios generales..............................145 Materiales .............................................145 Mtodo ..................................................146 Resultados ............................................147 TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS y RH ................................................................ 148 Principios generales..............................148 CLASIFICACIN DE LOS GRUPOS A, B, y O POR MEDIO DE ANTISUEROS................... 149 Principios generales..............................149 Mtodo del portaobjetos........................150 Mtodo del tubo de ensayo ...................154 CLASIFICACIN DEL GRUPO RHESUS (Rh)158 Principios generales..............................158 Mtodo del portaobjetos........................158 Mtodo del tubo de ensayo ...................162 COMPATIBILIDAD SANGUNEA ................ 164 Principios generales..............................164 Materiales .............................................164 Mtodo ..................................................164 Resultados ............................................166 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN LOS ERITROCITOS ............................................. 167 Principios generales..............................167 Mtodos ................................................168 Mtodo de Westergren..........................168 Mtodo de Wintrobe..............................170

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RECIPIENTES PARA TOMA DE MUESTRAS


PRINCIPIOS GENERALES

Los recipientes para las muestras pueden ser de vidrio o de plstico.

Los recipientes deben ser fuertes y no permitir fugas cuando la tapa o el tapn estn correctamente aplicados.

En el exterior del recipiente no debe quedar ningn material de la muestra.

Deben estar correctamente rotulados para facilitar la identificacin en el laboratorio. Rotular el frasco o el tubo con el nombre o cdigo que identifique al paciente, as como la fecha de la toma de muestra. No debe rotularse la tapa.

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Los formularios de peticin de examen de la muestra no se envolvern alrededor de los recipientes sino que se colocarn por separado, de preferencia en sobres plsticos.

En las muestras que se sospeche la presencia de microorganismos infectantes, por ejemplo, el virus de hepatitis B o el virus de inmunodeticiencia humana (VIH) deben estar identificados en el recipiente y en el formulario de examen con una etiqueta especial "Peligro de infeccin".

Para evitar fugas o derramamientos accidentales se debe usar recipientes secundarios como bandejas, o cajas, equipados con gradillas de modo que estn en. posicin vertical los recipientes que contienen las muestras.

Los recipientes secundarios pueden ser de metal o de plstico. Se deben descontaminar con regularidad, por autoclave o con desinfectantes qumicos.

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FRASCOS Y TUBOS PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE SANGRE

PARA OBTENER SANGRE SIN ANTICOAGULANTE

Usar tubos limpios y secos con capacidad para 5 - 20 mI.

El mejor tipo de tubo es aquel que se puede centrifugar, evitando as la manipulacin excesiva de las muestras.

PARA OBTENER SANGRE CON ANTICOAGULANTE

Usar frascos o tubos graduados limpios, secos antes de aadir el anticoagulante.

Colocar etiquetas en los tubos de modo que el borde superior de stas quede al nivel de la sangre que se requiere (2mI, 5mI, etc.) y guardarlos en un lugar seco.

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OBTENCIN DE SANGRE VENOSA

PRINCIPIOS GENERALES

Un adulto que pesa 60 kilos tiene aproximadamente 4,5 litros de sangre. Por lo tanto, no existe peligro si se llenan dos o ms tubos de ensayo de 10 mI para el estudio de su sangre. Se debe explicar esto a los pacientes que muestren temor al extraer sangre venosa.

La sangre venosa se extrae de una vena del brazo por medio de una aguja y una jeringa.

Es importante considerar toda muestra como sospechosa de VIH u otra enfermedad que puede ser transmitida por la sangre.

Usar guantes durante la obtencin y procesamiento de la muestra.

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SANGRE COAGULADA

Cuando la sangre se coloca en un tubo de vidrio se solidifica en 5 - 10 minutos formando un cogulo. Se separa en dos componentes:

El suero, un lquido amarillo. El cogulo, una masa slida de color rojo.

SANGRE ANTICOAGULADA

Si se aade a la sangre un anticoagulante especial tan pronto como se extraiga, se evitar que se coagule y seguir siendo lquida. La sangre tratada con un anticoagulante se separa en dos componentes:

El plasma, un lquido amarillo. Las clulas sanguneas, que se sedimentan y forman: una capa delgada de leucocitos y un precipitado de eritrocitos.

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MATERIALES

Etanol al 70% para desinfectar la piel. Algodn. Una ligadura hecha con un tubo de goma de 2 - 5 mm de calibre. Agujas estriles con calibre de 20, 19, 18. En nios menores de cinco aos se usan agujas de calibre 23 25. Jeringas estriles con capacidad para 2,5, 10 20 mI de acuerdo con el examen solicitado. Verificar que la desembocadura de cada jeringa se ajuste adecuadamente a la entrada de las agujas.

Tambin se pueden utilizar jeringas descartables con sus respectivas agujas, provenientes de sus envases originales. Frascos y tubos para recolectar muestras de sangre. Rtulos para los frascos o tubos. Preparar y rotular el frasco o el tubo adecuado, que usar para el examen correspondiente. Un depsito de metal que contenga leja u otro desinfectante para colocar el material utilizado.

MTODO DE OBTENCIN

Leer con cuidado la orden de examen del paciente y decidir la cantidad de sangre que se necesitar.

POSICIN DEL PACIENTE l.


Si el paciente se encuentra en el laboratorio, hacer que se siente. Poner el brazo del paciente sobre la mesa de trabajo apoyndolo en un pequeo cojn bajo el codo, con la palma de la mano hacia arriba.

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2.

Si el paciente se encuentra en cama, extender el brazo del paciente en una posicin descansada.

PUNTO PARA LA EXTRACCIN DE SANGRE

3. El sitio ms adecuado es la vena que


se encuentra en el pliegue anterior del codo, en el punto donde es ms gruesa y visible.

USO DE LA JERINGA

4.

Colocar la aguja en la jeringa, tocando slo la base de la aguja. Asegurarse que la aguja y la jeringa no estn obstruidas.

APLICAR LA LIGADURA

5. Aplicar la ligadura por encima del


punto ubicado para la extraccin de la sangre.

6. Con la mano derecha colocar,


firmemente, la ligadura alrededor del brazo del paciente, y sujetar los extremos.

79

7.

Con la mano izquierda tirar de un extremo cruzndolo y a continuacin introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura.

Se deber ajustar, slo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar la vena, sin apretarla tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias.

8. Pedir al paciente que abra y cierre la


mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas.

9. Con el dedo ndice de la mano


izquierda palpar la vena en que se introducir la aguja.

80

10. Desinfectar la piel con una pieza de


algodn embebido en etanol al 70%.

11. Tomar la jeringa con la mano


derecha, colocando la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja.

12. Colocar la aguja sobre la vena, con el


bisel hacia arriba.

Introducir la aguja en el centro de la vena, sin dudar. Nunca intentar punzar una vena por un lado. Se sentir que la aguja atraviesa la piel.

13. Introducir la aguja 1 - 1,5 cm a lo


largo de la vena.

14. Con la mano izquierda tirar hacia


atrs el mbolo de la jeringa muy lentamente. Deber entrar sangre en la jeringa. Llenar la jeringa con la cantidad de sangre que necesite.

81

15. Retirar la ligadura tirando del


extremo doblado.

16. Aplicar un pedazo de algodn seco


sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Sacar la aguja con un movimiento rpido.

17. Pedir al paciente que presione


firmemente el algodn durante 3 minutos, con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el

brazo a causa del riesgo que se forme.

18. Luego de extrada la sangre venosa,


retirar la aguja de la jeringa con el mximo cuidado y depositar la aguja en el recipiente de metal con desinfectante.

19. Llenar los frascos o tubos rotulados con la muestra de sangre. Si estos
recipientes contienen anticoagulante, mover varias veces con suavidad y uniformidad el recipiente. No agitar el contenido.

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OBTENCIN DE GOTA GRUESA


El propsito es la deteccin de parsitos en la sangre.

MATERIALES
Etanol al 70% para desinfectar la piel. Algodn. Lminas portaobjetos limpios. Una lanceta estril.

MTODO DE OBTENCIN

a. Puncin del dedo

l.

Ubicar el dedo anular de la mano izquierda. En el lado externo del dedo, donde la sensibilidad es menor que en la punta.

No extraer sangre de: El dedo ndice o el pulgar. Un dedo infectado.

83

2.

En los nios menores de 6 meses, ubicar el taln o el dedo gordo del pie.

3. Limpiar el sitio escogido: usar un


pedazo de algodn humedecido en etanol, despus pasar un pedazo de algodn seco para retirar los residuos de etanol.

4.

Punzar el dedo con la lanceta estril con firmeza y rapidez.

5. Limpiar la primera gota de sangre


con un pedazo de algodn seco.

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6.

Con la mano derecha tomar un portaobjetos sostenindolo por los bordes. Con la mano izquierda oprimir el dedo para extraer una gota de sangre, que debe caer en el centro del portaobjeto sostenido con la mano derecha.

7. Extender la sangre hasta lograr un


crculo de aproximadamente 1cm de dimetro y haga que el espesor de la capa sea uniforme, para eso, usar la esquina de un portaobjeto limpio.

8.

Las gotas de sangre demasiado gruesas o demasiado delgadas no toman bien la tincin.

85

OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR


Se usa para realizar los siguientes exmenes de laboratorio:

Concentraciones eritrocitos.

del

nmero

de

Fracciones de volumen de eritrocitos. Clculo de la cantidad de hemoglobina. Deteccin de parsitos.

MTODO DE OBTENCIN
En relacin con la obtencin de sangre capilar ver: "Obtencin de gota gruesa de sangre" (pgina 87) hasta el paso 6. Luego proceder a preparar la extensin de sangre.

86

PREPARACIN DE EXTENSIONES DE SANGRE

PRINCIPIOS GENERALES
La extensin se prepara repartiendo uniformemente una gota pequea de sangre sobre un portaobjeto de manera que slo se deposite una capa de clulas.

Despus de teir, las extensiones se usan para: Determinar los porcentajes de las distintas clases de leucocitos. Detectar glbulos rojos o blancos anormales. Identificar ciertos parsitos.

MATERIALES
Alcohol. Algodn. Una lanceta estril. Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados.

MTODO DE OBTENCIN
Obtener sangre capilar o venosa. Dejar que la sangre salga libremente. Recoger primero las muestras en que se determinarn las concentraciones de nmero de las clulas sanguneas, si se han solicitado.

87

PREPARACIN DE LA EXTENSIN

a. Lmina extensora

l.

Lavar minuciosamente y limpiar con una pieza de tela suave embebida en una mezcla de etanol y ter.

2.

Elegir un portaobjeto cuyos bordes estn completamente lisos.

3.

Con una sierra pequea marcar diagonalmente hasta cierta profundidad dos esquinas de uno de los extremos del portaobjeto.

4.

Cortar estas dos esquinas.

b. La extensin

l.

Recoger una gota de sangre tocndola ligeramente con una cara del portaobjeto cerca del extremo de ste.

88

2.

Sostener el portaobjeto con una mano. Con la otra mano colocar el borde del portaobjeto que se ha recortado exactamente frente a la gota de la sangre.

3. Desplazar el portaobjeto recortado


hacia atrs, hasta que toque la gota de sangre.

4.

Dejar que la gota de sangre se extienda por el borde del portaobjeto recortado.

5. Deslizar el portaobjeto recortado


hacia el extremo opuesto del portaobjeto que contiene la gota de sangre con un movimiento suave (extender toda la gota de sangre antes de llegar al extremo del portaobjeto).

89

C. Una buena extensin

Lograr una buena extensin es sumamente importante.

l.

Una extensin mal preparada producir errores en la proporcin o en el porcentaje de los tipos de leucocitos y har imposible que se reconozca la morfologa de los glbulos rojos: no deber haber lneas a lo ancho ni a lo largo de la extensin. (La extensin debe tener tres partes: cabeza, cuerpo y cola.)

2. El extremo de la extensin deber


terminar suave y gradualmente, sin interrupciones.

3.

La extensin no deber ser demasiado larga ni gruesa.

4.

La extensin no deber tener espacios vacos, esto se produce cuando se usa portaobjeto con grasa.

5.

Marcar la extensin ya seca con el nombre o cdigo del paciente. Escribir stos con un lpiz de grafito en un extremo del portaobjetos cerca a la porcin gruesa de la extensin sangunea.

90

d. Secado de la extensin

l.

Secar la extensin con movimientos en vaivn.

rpidos

Es importante que la extensin se seque de manera adecuada para conservar su calidad, en especial en climas hmedos.

e. Fijacin de la extensin

Fijar las extensiones con metanol para su conservacin. Envulvanse por separado una vez que estn secas, con hojas de papel blanco.

91

TINCIN DE EXTENSIONES DE SANGRE


PRINCIPIOS GENERALES
Las extensiones de sangre se colorean con las tinciones de Romanowski, que contienen azul de metileno y eosina. Entre las tinciones ms usadas tenemos la: Tincin de Wright. Tincin de Giemsa. Tincin de Leishman.

TINCIN DE LEISHMAN
Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de microorganismos en sangre y tejidos, tales como: bartonella, leptospira, etc.

MATERIALES
Dos varillas de vidrio colocadas a travs del fregadero o sobre una cubeta para tincin. Solucin amortiguada tamponada (ver pgina 486). Colorante de Leishman (ver pgina 471). Una gradilla para secar los portaobjetos. Un cronmetro.

92

PROCEDIMIENTO

l.

Fijar la extensin de sangre con metanol durante 2 - 3 minutos.

2. Cubrir la extensin de sangre con el


colorante Leishman por 1 - 2 minutos.

3.

Sin eliminar el colorante, aadir solucin amortiguada tamponada y mezclar.

4. Dejar actuar en reposo por 8 - 10


minutos.

93

5.

Lavar con agua corriente. Dejar caer el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de la lmina inclinada.

6. Secar a temperatura ambiente.

7.

Observar en el microscopio con objetivo de menor aumento y luego cor objetivo de inmersin.

TINCIN DE GIEMSA

MATERIALES
Metanol absoluto. Colorante Giemsa.

PROCEDIMIENTO l.
Fijar la extensin de sangre con metanol durante 2 - 3 minutos.

94

2.

Cubrir la extensin de sangre con colorante Giemsa diluido: 1 mI de solucin stock de Giemsa en 9 mI de agua destilada o buffer fosfato (PBS) (ver pgina 471).

3.

Dejar actuar en reposo por 30 minutos.

4. Lavar con agua corriente. Dejar caer


el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de la lmina inclinada.

5.

Dejar secar a temperatura ambiente.

6.

Observar en el microscopio con objetivo de menor aumento (40x) y luego con objetivo de inmersin (l00x).

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TINCIN DE WRIGHT

MATERIALES
Colorante de Wright (ver pgina 488) en un frasco gotero o un cuentagotas. Solucin amortiguada tamponada (ver pgina 486).

PROCEDIMIENTO l.
Cubrir la extensin de sangre con unas gotas de colorante Wright. Contar las gotas. Dejar actuar en reposo durante 1 2 minutos. Agregar sobre el colorante el mismo nmero de gotas de solucin amortiguada tamponada y mezclar rpidamente, que puede ser hecho soplando suavemente (debe formarse una capa plateada). Dejar reposar la mezcla por 10 minutos. Lavar con agua corriente. Dejar caer el chorro de agua en forma suave, empezando por el borde de la lmina inclinada. Dejar secar a temperatura ambiente. Observar en el microscopio con objetivo de menor aumento (40x) y luego con objetivo de inmersin (l00x).

2.

3.

4.

5.

6. 7.

96

RESULTADOS
Cuando el mtodo ha sido aplicado correctamente, se obtienen resultados similares: Los eritrocitos se observan de color: Los ncleos se observan de color: Los grnulos basfilos de color: Los grnulos neutrfilos de color: Los grnulos eosinfilos de color: naranja. prpura. prpura azulado. rojo lila. rojo naranja.

97

LAS CELULAS SANGUNEAS


La hematologa es el estudio de la sangre, que comprende las clulas sanguneas y el lquido que las rodea. Las clulas sanguneas se pueden examinar con el microscopio.

TIPOS DE CLULAS SANGUNEAS

a. Glbulos rojos o eritrocitos


Aspecto: Tamao: Concentracin en nmero: Funcin: Clulas redondas, asemejan discos bicncavos llenos de hemoglobina. No poseen ncleo. 7,5 m. Aproximadamente 5 x 1012 por litro de sangre (5000000 por mm 3 de sangre). Los eritrocitos transportan la hemoglobina, sta a su vez se combina con el oxigeno y lo lleva desde los pulmones hasta los tejidos. Llevan el bixido carbnico de los tejidos a los pulmones.

b. Glbulos blancos o leucocitos


Aspecto: Tamao: Concentracin en nmero: Funcin: Redondos, contienen un ncleo y algunos grnulos. 9 - 20 m. Aproximadamente 8 x 109 por litro de sangre. (8 000 por mm 3 de sangre). Defensa del organismo contra las infecciones.

c. Plaquetas
Aspecto: Tamao: Concentracin en nmero: Funcin: Fragmentos de clulas de formas variadas (triangulares, estrelladas, ovales), con grnulos. 2 - 5 m. Aproximadamente 300 x 109 por litro de sangre (300 000 por mm3 de sangre). Son importantes para la coagulacin de la sangre.

98

ESTUDIO DE LAS CLULAS SANGUNEAS

HEMOGRAMA COMPLETO

PRINCIPIOS GENERALES
No todos los leucocitos (glbulos blancos) que circulan en la sangre son idnticos. Hay cinco tipos principales que se diferencian por el tamao, la forma del ncleo y el color de los grnulos del citoplasma. La proporcin o porcentaje de cada tipo de leucocitos es importante para el diagnstico. Esta proporcin o porcentaje se denomina: Frmula leucocitaria. Para trabajar esta frmula se cuentan 100 leucocitos y se anota el nmero que se ha encontrado de cada tipo de ellos. Los valores normales de los distintos leucocitos en su proporcin relativa (Frmula leucocitaria porcentual) y en cifras absolutas por mm3, son:

99

MATERIALES
Un microscopio con objetivo 40x y un objetivo de l00x. Aceite de inmersin. Una extensin de sangre, coloreada con Giemsa. Un contador especial provisto de teclas, o uno que se haga por medio de Frijoles o granos de maz.

MTODO

a. Examen de la extensin

l.

Examinar la extensin de sangre coloreada con el objetivo de 40x para comprobar si los elementos celulares estn bien distribudos y la tincin es adecuada.

2. Verificar que los glbulos blancos


se encuentran uniformemente distribuidos en la extensin: si est mal distribuida es posible que los neutrfilos se hallen agrupados.

3.

Verificar que la extensin no sea demasiado gruesa.

4.

Si la lmina coloreada, est en buenas condiciones, colocar una gota de aceite de inmersin en la lmina y observar con el objetivo de l00x e iniciar el recuento de leucocitos.

100

b. Recuento de leucocitos

l.

Iniciar el recuento en la ltima porcin de la extensin, es decir, donde se observe que los eritrocitos comienzan a agruparse y sobreponerse.

2.

Examinar una porcin rectangular de la extensin mediante un movimiento ordenado, de un campo a otro, como se indica en la figura.

3.

Tomar nota del tipo de leucocito que se observe en cada campo.

4.

Contar un total de 100 leucocitos.

c. Procedimientos de recuento

MQUINA CON TECLADO

Es una mquina contadora, con teclado.

Cada tecla corresponde a un tipo de leucocitos. El nmero de cada tipo de leucocito se registra automticamente.

Es de costo elevado.

101

CON LPIZ Y PAPEL

Trazar un cuadro con: Cinco columnas verticales. N = Neutfilos E = Eosinfilos. B = Basfilos. L = Linfocitos. M = Monocitos.

Diez lneas horizontales.

A continuaci6n, marcar un palote en el cuadro correspondiente segn el tipo de leucocito.

Los totales de las columnas correspondern al porcentaje de cada tipo de leucocitos. Ejemplo: 58 ser 58% 5 ser 5%, etc.

Estas cifras constituyen los resultados que se deben comunicar.

102

RESULTADOS ANORMALES

NEUTROFILIA
Es el aumento de la proporcin de neutrrIlos (ms de 7 000) en sus formas inmaduras (abastonados, mielocitos, metamielocitos).

LEUCOCITOSIS
Es el aumento de la cifra total de los leucocitos con cifras superiores a 10 000 12 000. Se presenta en infecciones agudas graves.

"DESVIACIN A LA IZQUIERDA"
Es el aumento de la proporcin de neutrfilos en sus formas inmaduras (abastonados, mielocitos, metamielocitos). Se presenta en infecciones agudas graves.

EOSINOFILIA
Es el aumento de la proporcin de eosinfilos (ms de 400). Ocurre en casos de parasitosis, asma o alergias.

LINFOCITOSIS
Es el aumento de la proporcin de linfocitos (ms de 3 000). Ocurre en casos de infecciones virales (sarampin, etc.) y en ciertas infecciones crnicas (tuberculosis, etc.).

MONOCITOSIS
Es el aumento de la proporcin de monocitos (ms de 800). Se puede observar en casos de infecciones bacterianas.

103

NEUTROPENIA
Es la disminucin del nmero de neutrfilos. Puede ocurrir en enfermedades infecciosas graves.

PREDOMINIO DE LINFOCITOS
En lactantes y nios menores de 10 aos.

PREDOMINIO DE NEUTRFILOS
En adultos, nios mayores de 10 aos y recin nacidos.

104

EXAMEN DE LOS LEUCOCITOS

a. Se debe diferenciar y tomar nota

Forma y tamao de los leucocitos en comparacin con los glbulos rojos (R). Forma y tamao del ncleo en relacin con el rea total de la clula de los diferentes leucocitos:

105

Del citoplasma del os diferentes leucocitos:

Las vacuolas y nuclolos constituyen reas ovales o redondas, que no se tien o lo hacen dbilmente. Las vacuolas (V) se encuentran en el citoplasma. Los nuclolos (N) se encuentran en el ncleo.

EJEMPLO:
Los neutrfilos polimorfonucleares (P) tienen un ncleo con varios lbulos y grnulos en el citoplasma (de all que tambin se les llama granulocitos). Los linfocitos (L) y los monocitos (M) tienen un ncleo compacto y citoplasma con grnulos o sin ellos.

106

DESCRIPCIN DE LOS TIPOS DE LEUCOCITOS

a. Neutrfilos polimorfonucleares o granulocitos

Tamao: Forma: Citoplasma: Grnulos:

12 - 15 m. Redonda, bien definida. Abundante, rosceo. De color malva, muy pequeos, numerosos pero separados.

Ncleo:

Varios lbulos (de 2 a 5), unidos por puentes de cromatina, que tiene el aspecto de una masa uniforme de color morado oscuro. envejece aumenta el A medida el nmero que de leucocito

lbulos del ncleo.

b. Abastonados o neutrfilos polimorfonucleares inmaduros

Llamados tambin "en banda" o "en cayado". A diferencia de las anteriores es que el ncleo tiene forma de "S". Si se observa este tipo de leucocitos notifquese su porcentaje del mismo modo que las de otros tipos de leucocitos.

107

c. Eosinfilos polimorfonucleares
Tamao: Grnulos: 12 - 15 m. Voluminosos, redondos, de color rojo y anaranjado, agrupados consta que se de abundantes Ncleo:

estrechamente. Generalmente se los observa grnulos dos lbulos. Algunas veces estos hallan leucocitos se han daado y diseminados en el exterior.

d. Basfilos polimorfonucleares
Tamao: Forma: Grnulos: 11 - 13 m. Redonda. Muy voluminosos, redondos, de color morado oscuro, abundantes pero menos estrechamente agrupados que los grnulos de los eosinfilos. Ncleo: Difcil de observar, pues se halla Vacuolas: En cubierto el por los se y grnulos. citoplasma incoloras encuentran vacuolas pequeas. escasas

e. Linfocitos pequeos
Tamao: 7 - 10 m.

108

Forma: Ncleo:

Redonda. Voluminoso, cromatina es ocupa de la color es mayor parte de la clula; la morado oscuro, y densa.

Citoplasma:

La

cantidad

visible

reducida, de color azul y sin grnulos.

f. Linfocitos grandes
Tamao: Forma: Grnulos: Ncleo: Citoplasma: 10 - 15 m. Redonda o irregular. Escasos, voluminosos y de color rojo oscuro. Oval o redondo puede ocupar un lado de la clula. Abundante, de color plido.

g. Monocitos
Tamao: Forma: Grnulos: 15 - 25 m; son los leucocitos ms grandes. Irregular. Sumamente pequeos; parecen partculas de polvo; generalmente rojizos. Ncleo: Variable, en forma de rin; la cromatina se dispone en cordones irregulares de color malva plido. Vacuolas: Casi siempre hay vacuolas en el citoplasma.

109

CLULAS ANORMALES a. Clulas plasmticas


Producen anticuerpos. Se observa en casos de sarampin, tuberculosis, otras virosis, infecciones bacterianas y mieloma mltiple. Tamao: Forma: Ncleo: 12 - 15 m. Redonda. Redondo, excntrico, con la cromatina Citoplasma: aglutinada semejante a una rueda. De color azul oscuro, con una tincin dbil alrededor del ncleo (halo perinuclear caracterstico). Vacuolas: Numerosas, pequeas visibles con dificultad.

b. Glbulos rojos nucleados (normoblastos)


Los normoblastos son glbulos rojos inmaduros y nucleados que normalmente se hallan en la mdula sea. Se observa en casos de anemia. Tamao: Forma: Ncleo: 8 - 10 m. Redonda. Redondo, a menudo excntrico, con cromatina aglutinada y densa, se tie de color oscuro. Citoplasma: De color azul grisceo o rosa, sin grnulos.

110

c. Granulocitos inmaduros (mielocitos y metamielocitos)


Durante las enfermedades bacterianas graves los granulocitos polimorfonucleares inmaduro s salen de la mdula sea a la sangre. Tamao: Ncleo: 12 - 18 m. Un solo ncleo sin lbulos, con cromatina que vara entre el rojo oscuro y el morado. Citoplasma: Grnulos: De color azul plido o rosceo. Abundantes, voluminosos, de color malva o rojo oscuro. A veces se observa granulaciones txicas con grnulos voluminosos que se tien de color oscuro.

d. Neutrfilos polimorfonucleares hipersegmentados


Son neutrfilos polimorfonucleares "viejos", cuyos ncleos presentan de 5 - 10 lbulos y con frecuencia son voluminosos. Se presentan en pacientes que sufren anemia macroctica causada por deficiencias de cidoflico o vitamina B-12.

e. Linfocitos atpicos
Se encuentran en infecciones por virus, por ejemplo sarampin, tos ferina. Tambin en casos de tuberculosis y paludismo grave.

111

Tamao: Forma: Ncleo: Citoplasma:

12 - 18~. Irregular. Redondo, excntrico, con nuclolos visibles. De color ms oscuro que el de los linfocitos grandes; se oscurece a medida que se acerca a la pared de la clula.

f. Mieloblastos
Es el tipo ms joven e inmaduro de todos las clulas de la serie granuloctica. Se observan en pacientes con leucemia. Tamao: Ncleo: 15 - 25 m Grande, redondo, de color malva, cromatina - 5 nuclolos. Citoplasma: De color azul oscuro, con un rea clara que no se tie, situada alrededor del ncleo. laxa finamente distribuida, plido, presenta de 1

g. Megacariocitos
Son los precursores de las plaquetas de la mdula sea. Tamao: Ncleo: Citoplasma: 60 - 100 m. Irregular, denso y con abundantes lbulos. Lleno de grnulos pequeos y de plaquetas. La pared celular no est bien definida.

112

GLBULOS ROJOS O ERITROCITOS ANORMALES

PRINCIPIOS GENERALES
En algunas enfermedades, principalmente anemias, los glbulos rojos o eritrocito s pueden sufrir anormalidades: Alteraciones estructurales: En la forma (poiquilocitos) en el tamao (anisocitosis). Alteraciones cromticas: En la concentracin de hemoglobina: (hipercroma, hipocroma, etc.). Inclusiones anormales.

Examen de la extensin Los eritrocitos se deben observar antes del extremo donde termina la extensin de sangre (en la parte fmal del cuerpo y comienzos de la cola), en esta porcin se hallan separados unos de otros y si se tocan no se sobreponen.

Glbulos rojos o eritrocitos normales 7 - 8 m. Redonda irregular o ligeramente

Tamao: Forma: Color:

La periferia se tie de color rosa intenso; el centro lo hace de color rosa plido, o bien es casi incoloro.

113

ALTERACIONES ESTRUCTURALES EN EL TAMAO

a. Microcitos (m)
Se observan en la anemia ferropnica. Tamao: Son eritrocitos pequeos, de aproximadamente 5 m.

b. Macrocitos (M)
Se observan en anemia macrocticas debido a deficiencia de cido f6lico o vitamina B 12 Y en ciertos padecimientos hepticos. Tamao: Son eritrocitos grandes, de aproximadamente 9 - 10 m.

c. Anisocitosis Se observan en anemias de diferentes causas.


Tamao: Son eritrocitos de

diferentes tamaos que se encuentran en la misma sangre; hay eritrocitos de 9 m mezclados con eritrocito s de 6 m.

114

ALTERACIONES ESTRUCTURALES EN LA FORMA a. Poiquilocitos


Se observan en anemias de diferentes causas. Formas: Son eritrocitos de

diferentes formas que se encuentran en la misma sangre; hay eritrocitos de clulas redondas, ovales, triangulares, piriformes y dentadas.

b. Esferocitos
Se observan en anemia hemoltica. Tamao: Forma: Color: Pequeo (6 m.). Completamente redonda. Uniforme. eritrocito intensamente. Todo se el tie

c. Eritrocitos anillados
Se observan en anemia drepanoctica, talasemia y otras anemias debido a hemoglobina anmala. Tamao: Forma: Color: 6 - 8 m. Redonda irregular. El centro y la orilla se tien intensamente, pero entre ambos se observa un anillo incoloro. o ligeramente

115

d. Eritrocitos nucleados (normoblastos)


Se observan en las anemias graves y en las leucemias. Tamao: Forma: Ncleo: 8 - 10 m Redonda o irregular. Pequeo, de color morado oscuro, Citoplasma: De excntrico rosa o con azul cromatinas densas. color grisceo.

e. Eritrocitos falciformes
Se observan en las anemias falciformes o drepanoctica y la talasemia falciforme. Forma: Alargada y estrecha con uno o ambos extremos curvos.

ALTERACIONES CROMTICAS

a. Eritrocitos hipocrmicos
Se observan en anemia ferropnica. Tamao: Color: Normal o un poco menor que el normal. Slo se tie la periferia a causa de la falta de hierro en el eritrocito.

116

INCLUSIONES ANORMALES

a. Eritrocitos que contienen grnulos basfilos


Grnulos: En estos eritrocito s hay un nmero de grnulos pequeos de color azul violceo. No confundir con depsitos de los colorantes.

b. Eritrocitos que contienen cuerpos de Howell y Jolly


Grnulos: En estos eritrocitos hay cierto nmero de grnulos voluminosos de color morado (restos de ncleo). No confundir con las plaquetas que se suelen adherir a la superficie de los eritrocitos.

c.

Eritrocitos que contienen cuerpos anulares de Cabot

En estos eritrocitos se observa lneas delgadas que adoptan la forma de "8". Siempre que se encuentre con eritrocito s anormales y difciles de identificar enve el frotis al laboratorio de referencia.

117

RECUENTO DEL NMERO DE LEUCOCITOS O GLBULOS BLANCOS

PRINCIPIOS GENERALES
El recuento del nmero de leucocitos o glbulos blancos se expresa por mm3 (milmetro cbico). La sangre se deposita en un lquido para diluir leucocitos, dejndolos intactos. En cambio los eritrocitos son destruidos por este lquido. Luego, se cuentan los leucocitos en una cmara de recuento, por medio del microscopio, y se calcula el nmero que existe por milmetro cbico de sangre. Es importante conocer el nmero de leucocitos, pues ste se altera en casos de enfermedades infecciosas.

MATERIALES
Una pipeta para sangre, graduada hasta 50 l (0,05 ml 50 mm3) con tubo de goma y boquilla. Una pipeta de 1 ml, graduada. Una cmara de de recuento de con Neubauer, preferencia

"lnea brillante". Tapar la cmara con la laminilla de vidrio especial que la acompaa. Lquido para dilucin: solucin de Turk Un contador manual, para recuento.

118

MTODO

1.

Trasladar 0,95 ml del lquido para dilucin de leucocitos en un frasco pequeo con la pipeta de 1 ml.

2.

Con la pipeta para sangre aspirar sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,05 ml. Si la sangre es venosa asegurarse que se mezcle completamente invirtiendo el frasco que contiene la sangre y el anticoagulante varias veces durante un minuto, luego aspirar con la pipeta.

3.

Limpiar el exterior de la pipeta que contiene la sangre, con papel absorbente. Asegurarse que la sangre contine en el mismo nivel.

4. Depositar la sangre en el frasco que


contiene el lquido para dilucin. La dilucin de esta sangre ser de 1 x 20.

119

5.

Enjuagar la pipeta aspirando y expulsando este lquido 3 veces en el mismo frasco.

6.

Rotular el frasco con el nombre o cdigo del paciente.

7.

Montar la laminilla de vidrio en la cmara para recuento, presionndola cuidadosamente para colocarla en su sitio. Si se ha montado adecuadamente, entre las dos superficies de vidrio se observan unas bandas de color, llamadas "anillos de Newton".

8. Con una pipeta Pasteur llenar la


cmara de recuento, slo el rea cuadriculada.

9.

Si el lquido se derrama en el canal que se encuentra entre las dos cmaras, la operacin se debe repetir: retirar y limpiar la laminilla de vidrio; limpiar tambin la cmara para recuento y llenarla con otra gota.

10. Dejar reposar la cmara por 3 minutos, para que las clulas se asienten.

11. Colocar la cmara en la platina del


microscopio. Con el objetivo de 10x enfocar el rea cuadriculada de la cmara y con el objetivo de 40x contar los leucocitos.

120

MTODO DE RECUENTO

a. Uso de la cmara de Neubauer

rea de la cmara: 9 mm2. Profundidad de la cmara: 0,1 mm.

Contar los leucocitos en un rea de 4 mm2 utilizando los cuadros numerados 1, 3, 7 Y 9, se debe incluir en el recuento los leucocitos que se observan sobre las lneas de cada cuadro revisado.

b. Clculo del nmero de leucocitos en un mm3 de sangre

l.

Usar la siguiente frmula: Leucocitos / mm 3 = leucocitos contados x 10 x 20 4 Leucocitos / mm 3 = leucocitos contados x 50

2.

Notificar el resultado como el nmero de leucocitos que hay en 1 rnm3 de sangre sin diluir. Ejemplo: En los cuatro cuadros se cuentan 188 clulas. Leucocitos por mm3 = 188 x 50 Resultado que se notifica: 9 400 leucocitos/mm3 de sangre.

121

RECUENTO DEL NMERO DE ERITROCITOS O GLBULOS ROJOS

PRINCIPIOS GENERALES

El recuento del nmero de eritrocitos o glbulos rojos se expresa por mm3 (milmetro cbico).

La sangre se deposita en un lquido para diluir eritrocitos.

Luego, se cuentan los eritrocitos en una cmara de recuento, por medio del microscopio, y se calcula el nmero que existe por mm 3 de sangre.

Es importante conocer el nmero de eritrocito s o glbulos rojos. Se halla concentraciones bajas: en pacientes con anemia causada por prdida de eritrocito s o hemlisis. Y concentraciones elevadas: en pacientes con deshidratacin o con policitemia, etc.

122

MATERIALES

Una pipeta para sangre, graduada hasta 0,02 ml (20 nun3 20 m) con tubo de goma y boquilla.

Una pipeta de 5 ml, graduada. Una cmara de recuento de Neubauer. Liquido para dilucin: solucin de citrato y formaldehdo (ver pgina 486).

Un

contador

manual,

para

recuento.

MTODO

l.

Trasladar 4,0 ml del lquido para dilucin de eritrocito s en un frasco pequeo con la pipeta de 5 ml.

2. Con la pipeta para sangre aspirar


sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml. Si la sangre es venosa asegurarse que se mezcle completamente invirtiendo el frasco que contiene la sangre y el anticoagulante varias veces durante un minuto, luego aspirar con la pipeta.

123

3.

Limpiar el exterior de la pipeta que contiene la sangre, con papel absorbente. Asegurarse que la sangre contine en el mismo nivel.

4. Depositar la sangre en el frasco que


contiene el lquido para dilucin. La dilucin de esta sangre ser de 1 x 200.

5.

Enjuagar la pipeta aspirando y expulsando este lquido 3 veces en el mismo frasco.

6.

Rotular el frasco con el nombre o cdigo del paciente.

7.

Montar la laminilla de vidrio en la cmara para recuento, presionndola cuidadosamente para colocarla en su sitio. Si se ha montado adecuadamente, entre las dos superficies de vidrio se observan unas bandas de color, llamadas "anillos de Newton".

124

8.

Con una pipeta Pasteur llenar slo el rea cuadriculada de la cmara de recuento.

9.

Si el lquido se derrama en el canal que se encuentra entre las dos cmaras, la operacin se debe repetir: retirar y limpiar la laminilla de vidrio; limpiar tambin la cmara para recuento y llenarla con otra gota.

10. Dejar reposar la cmara por 3 minutos, para que las clulas se asienten.

11. Colocar la cmara en la platina del


microscopio. Con el objetivo de l0x enfocar el rea cuadriculada de la cmara y enseguida cambiar al objetivo 40x para contar los eritrocitos.

PROCEDIMIENTO DE RECUENTO

a. Uso de la cmara de Neubauer


rea de la cmara: 9mm2. Profundidad de la cmara: 0,1 mm.

l.

Contar los eritrocitos en un rea de 0,2 rnm2 utilizando los cuadros A, B, C, D y E, se debe incluir en el recuento las clulas que se observan sobre las lneas de cada cuadro revisado.

125

b. Clculo del nmero de eritrocitos

l.

Clculo de eritrocitos por mm3: Eritrocitos / mm 3 = clulas contadas x 200 x 50

Eritrocitos / mm 3 = clulas contadas x 10 000

2.

Notificar el resultado como el nmero de eritrocitos que hay por milmetro cbico de sangre sin diluir.

Ejemplo: En los primeros cinco cuadros se cuentan 390 clulas. Clulas por milmetro cbico: Resultado que se notifica: 390 x 10 000. 3,9 millones de eritrocitos/mm3.

126

HEMATOCRITO

PRINCIPIOS GENERALES
Se llama hematocrito (Hcto) al volumen total que ocupan los eritrocitos, dividido entre el volumen de sangre.

Ejemplo: Si el volumen de los eritrocitos en llitro (1 000 ml) de sangre es de 450 ml, el hematocrito ser: 450 ml / 1 000 ml. Este resultado se notifica como un porcentaje de 45%.

Se tiene el mtodo de microescala, la sangre se deposita en un tubo capilar largo y se centrifuga empleando un "cabezal para microhematocrito". Luego se mide el nivel de la columna de eritrocitos por medio de una escala especial. Es el mtodo ms rpido y se emplea sangre extrada de un dedo.

MTODO DE MICROESCALA

MATERIALES

Una centrfuga para "microhematocrito". Una escala para medir los resultados.

127

Tubos capilares con heparina (heparina seca como anticoagulante) de 7S mm de longitud y 1,5 mm de dimetro interior. Si la sangre venosa est mezclada con bipotsica de EDT A no ser necesario que los tubos contengan heparina.

Cera blanda o arcilla. Lanceta para extraccin de sangre capilar (ver pgina 91).

PROCEDIMIENTO

l.

Obtener sangre capilar (ver pgina 90). La sangre deber salir libremente o despus de exprimir muy suavemente el rea.

2.

Recoger la primera gota de sangre con un filtro de papel.

3. Aplicar

el extremo delgado (marcado con un crculo rojo) del tubo capilar con heparina sobre la gota de sangre. La sangre ingresar en el tubo por capilaridad. Llenar los 3/4 del tubo.

4.

Taponar el extremo contrario del tubo, que no ha estado en contacto con la sangre, con la cera blanda o arcilla. Asegurarse que el taponamiento sea hermtico y que la cera llegue a unos 2 mm de profundidad dentro del tubo.

128

Si no tiene cera o arcilla, cerrar el extremo del tubo calentndolo cuidadosamente sobre la llama de una lmpara de alcohol. Dejar enfriar en posicin horizontal.

5. Disponer de una gradilla numerada


en que haya colocado arcilla. As el tubo de cada paciente se puede fijar en posicin vertical junto al nmero que le corresponde.

6.

Colocar los tubos en las ranuras del cabezal de la centrfuga, el extremo del tubo que se ha taponado con cera deber apuntar hacia fuera, lejos del centro. Verificar que el nmero de la ranura corresponda al nmero de la muestra.

7.

Centrifugar a alta velocidad.

8.

Al finalizar la centrifugacin cada uno de los tubos tendr en su interior tres capas: En la parte superior, una

columna de plasma (P). A la mitad, una capa delgada de glbulos blancos (GB). En la parte inferior y hasta el fondo, una columna de glbulos rojos (GR). Se deber trabajar al nivel del tope de la columna de glbulos rojos.

129

a. Uso de la escala

l.

Sostener el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de los glbulos rojos quede exactamente al mismo nivel que la lnea horizontal correspondiente al 0.

2.

Desplazar el tubo a travs de la escala hasta que la lnea marcada con el nmero 1,0 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigilar que el fondo de la columna de los glbulos rojos contine sobre la lnea O; tambin asegurarse que el tubo se encuentre en posicin completamente vertical.

3.

Leer la lnea que pase al nivel del tope de la columna de glbulos rojos, que indicar el hematocrito de stos: En la figura es 0,4 que se notifica como porcentaje igual a 40% (ver figura).

Las lneas finas no remarcadas de la escala corresponden a intervalos de 0,05.

b. Clculo del hematocrito sin usar escala

l.

Medir en mm la longitud de toda la columna, desde el tope del plasma hasta la base de la columna.

2.

Medir en mm la longitud de la columna de eritrocitos.

3.

Usar la siguiente frmula: Hcto = Longitud de la columna de eritrocitos Longitud de toda la columna

130

4.

Multiplicar el resultado por 100 para expresarlo en porcentaje.

131

HEMOGLOBINA: CLCULO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA


MTODO FOTOMTRICO
PRINCIPIOS GENERALES
La hemoglobina (Hb) es el pigmento rojo que se encuentra en los eritrocitos. Se compone de hierro. Transporta oxgeno a las clulas de los tejidos del organismo. Su valor se expresa en gramos/l00 ml. La sangre se diluye en lquido de Drabkin, que destruye los eritrocitos y convierte la hemoglobina en cianometahemoglobina. Este resultado se examina por medio de un espectrofotmetro o un colormetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre. El mtodo fotomtrico de la cianometahemoglobina permite hacer clculos ms precisos de la cantidad de hemoglobina existente.

MATERIALES
Un espectrofotmetro o colormetro fotoelctrico calibrado. Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) de 0,02 ml (20 mm3 o 20 /lm) con tubo de goma y boquilla. Una pipeta graduada de 5 ml. Tubos de ensayo. Lquido de Drabkin pata dilucin (ver pgina 469). Solucin estandarizada para cianometahemoglobina.

132

CALIBRACIN DEL COLORMETRO

l. 2.

Elaborar una curva de calibracin, antes de usar el colormetro. Ajustar la concentracin de la solucin de referencia a la dilucin utilizada en este mtodo (250 es el factor de dilucin cuando, 0,02 mI de sangre se diluyen con 5 mI del lquido de Drabkin). Por lo que se aplicar la siguiente frmula: Concentracin de la solucin de referencia mg/l00mlx2,5 = Concentracin ajustada g/l000ml

Ejemplo: Concentracin de la solucin de referencia = 60 mg / l00 ml Entonces el valor de la concentracin ajustada en g /1 000 mi, ser: 60 x 2,5 = 150g / 1000ml. Convertido en gramos / 100mI= 15,0g / 100ml.

3.

Preparar diluciones sucesivas de la solucin estandarizada en cuatro tubos, numerarlos del 1 al 4.

En cada tubo depositar lo siguiente:

133

4.

Mezclar cada tubo y dejar reposar 5 minutos.

5.

Leer las diluciones en el colormetro: Colocar en el colormetro un filtro verde o poner la longitud de onda en 540 nanmetro (nm). Llenar un tubo de ensayo al mismo nivel con lquido de Drabkin y colocarlo en el aparato. Poner la aguja del colormetro en cero. Leer en el tablero el contenido de los tubos 1, 2, 3 Y 4 usando un tubo de ensayo.

6.

Preparar un grfico trazando las lneas de las soluciones estandarizadas diluidas perpendicularmente a la de sus concentraciones. Se dio como ejemplo la concentracin de la solucin de referencia calculada en 15 g/l00 ml, se tiene entonces:

134

MTODO FOTOMTRICO DE LA CIANOMETAHEMOGLOBINA

l.

Depositar 5 ml de lquido de Drabkin con una pipeta para dilucin en un tubo de ensayo.

2.

Aspirar sangre venosa o capilar hasta la marca de 0,02 ml de una pipeta de sangre. Si se usa sangre venosa asegurarse que se mezcle adecuadamente con el anticoagulante.

3. Limpiar el exterior de la pipeta y


verificar que la sangre contine en el mismo nivel.

4.

Depositar la sangre en el lquido de Drabkin y enjuagar la pipeta varias veces aspirando y expulsando varias veces el lquido en el mismo tubo.

135

5.

Mezclar el contenido del tubo y dejarlo reposar por 5 a 10 minutos para que se produzca la hemlisis.

6. Poner el colormetro en cero con


lquido de Drabkin. Leer en el tablero del colormetro la absorbancia de la sangre diluida del paciente usando el tubo de ensayo.

7.

Anotar la cantidad de gramos/l00 ml de hemoglobina en el cuadro preparado con la curva de calibracin.

8.

Si se forma turbidez en la sangre diluida, centrifugar el lquido antes de hacer la lectura en el tablero del colormetro.

136

En poblaciones de altura, la hemoglobina se incrementa debido a la hipoxia, por tal razn debe corregirse.

De acuerdo con la altitud, sumar el factor de correccin que se muestra en la tabla siguiente.

Hb0 + Factor de correccin

Ejemplo: Hbo Altura = = 11 g/l00ml 2000 metros sobre el nivel del mar.

De acuerdo con la tabla. 11 + 0,8 = 11,8 g/l00ml

137

TIEMPO DE SANGRA
MTODO DE DUKE
PRINCIPIOS GENERALES
Con una lanceta hacer un corte pequeo en el lbulo de la oreja. La sangre sale por este corte y se mide el tiempo que transcurre hasta que se detiene el sangrado. El corte no debe ser hecho sobre venas visibles, ni en lesiones de piel.

Este examen se usa para los siguientes casos:

Para diagnosticar enfermedades hemorrgicas. Antes de realizar operaciones quirrgicas. Antes de realizar una puncin en el hgado o el bazo.

MATERIALES

Una lanceta estril. Alcohol al 70%. Filtro de papel o papel secante. Un reloj con segundero o un cronmetro.

MTODO

l.

Limpiar con suavidad el lbulo de la oreja utilizando una pieza de algodn con alcohol al 70%. No frotar. Dejar secar.

138

2. Hacer un pequeo corte de 3 mm de


profundidad con la lanceta, en el borde inferior del lbulo de la oreja. A la vez, poner a funcionar su reloj con segundero o cronmetro.

3. Dejar que la sangre salga libremente. No exprimir el lbulo de la oreja.

4. Recoger la primera gota en una


esquina del papel del filtro o papel secante. No tocar la piel con el papel.

5. Esperar 30 segundos y recoger la


segunda gota de sangre en el papel secante, pero un poco ms adelante de la primera gota.

6. Recoger las siguientes gotas de


sangre una cada 30 segundos. Las gotas sern cada vez ms pequeas. Cuando las gotas dejen de salir y el papel secante ya no absorba sangre, detener el funcionamiento del reloj o del cronmetro.

139

7. Anotar el tiempo transcurrido, segn


el reloj o el cronmetro.

Otro mtodo consiste en contar el nmero de gotas recogidas en el papel secante y multiplicarla por 30 segundos.

Ejemplo:

Si se han recogido 7 gotas. El tiempo de sangrado es 7 x 30 segundos = 210 segundos, convertidos en minutos es 3 Y2 minutos.

RESULTADOS
El tiempo de sangra normal aplicando el mtodo de Duke es de 1 - 5 minutos. Comunicar el resultado indicando el valor normal que corresponde al mtodo usado (mtodo de Duke). Si el tiempo se prolonga el paciente requiere un estudio de plaquetas.

140

TIEMPO DE COAGULACIN DE LA SANGRE COMPLETA

MTODO DE LEE Y WHITE

PRINCIPIOS GENERALES

Este examen es til para evaluar la eficacia del mecanismo de coagulacin.

Su utilidad es limitada, pues detecta deficiencias graves de la coagulacin y no detecta las deficiencias leves de la coagulacin.

Se requiere de sangre venosa en un tubo de ensayo. Se toma nota del tiempo que requiere la sangre para coagularse. El cogulo formado es una masa slida de color sangre.

MATERIALES

Dos tubos de ensayo de 75 x 10 mm marcados para el nivel de 1 ml.

Un cronmetro. Un bao mara a 37C. Material para la obtencin de sangre venosa (ver pgina 82). Algodn no absorbente.

141

MTODO

l.

Obtener sangre venosa por puncin.

2. Poner a funcionar el cronmetro tan


pronto como la sangre empiece a entrar en la jeringa. Extraer 2,5 ml.

3.

Llenar con esta sangre cada uno de los dos tubos de ensayo hasta la marca de 1 ml. Taponar ambos tubos con algodn no absorbente.

4.

Colocar los tubos en bao mara a 37C.

5. Despus de 3 minutos sacar el


primer tubo del bao mara. Inclinar el tubo hasta un plano de 45 o para observar si la sangre se ha coagulado. Repetir el paso 5 para el segundo tubo.

142

6.

Si la sangre no ha coagulado, colocar los tubos otra vez en el bao mara y examinarlos cada 30 segundos hasta que se observe la formacin del cogulo. La formacin del cogulo corresponde al momento en que resulta posible invertir cada tubo sin que se derrame su contenido.

RESULTADOS

El resultado definitivo del tiempo de coagulacin es el promedio de los dos resultados.

Ejemplo: El primer tubo necesit 5 minutos, el segundo tubo necesit 7 minutos. El resultado final es el promedio de ambos resultados: (5 + 7) / 2 = 6 minutos

Las cifras normales para el mtodo de Lee y White son de 5 - 12 minutos.

143

TIPIFICACIN DE GRUPOS SANGUNEOS Y RH

PRINCIPIOS GENERALES

Los grupos sanguneos se heredan segn las leyes genticas. Son 4 tipos y reciben el nombre de: sistema de grupos sanguneos ABO.

En toda transfusin sangunea se deber determinar con mucho cuidado los grupos sanguneos de cada donador y cada receptor. El paciente slo recibir sangre de su propio grupo.

La tipificacin de los grupos sanguneos se realiza:

Probando los glbulos rojos (para reconocer sus antgenos) con sueros clasificadores conocidos, anti A, anti B, y anti AB. Probando el suero (para identificar sus anticuerpos) con glbulos rojos de ensayo conocido, perteneciente a los grupos A, B y O.

En los hospitales pequeos y en caso de urgencia, puede ser que el paciente deba recibir sangre de un grupo distinto al suyo, segn las siguientes reglas:

El paciente que tenga:

Grupo sanguneo A:

Deber recibir sangre del grupo A; si no se dispone de ella, usar sangre del grupo O.

Grupo sanguneo B:

Deber recibir sangre del grupo B; si no se dispone de ella, usar sangre del grupo O.

144

Grupo sanguneo AB:

Deber recibir sangre del grupo AB; si no se dispone de ella, usar sangre del grupo A, del grupo B o del grupo O (en este orden).

Grupo sanguneo O:

Slo podr recibir del grupo O.

CLASIFICACIN DE LOS GRUPOS A. B. Y O POR MEDIO DE ANTISUEROS

PRINCIPIOS GENERALES

Los eritrocitos del paciente se enfrentan con 3 antisueros: anti A, anti B y anti AB. Los antisueros se conservarn segn las instrucciones del fabricante. No es conveniente usar un antisuero si se nota turbio, es probable que se encuentre contaminado por bacterias, no se deber usar. El estudio se puede efectuar en un portaobjetos, o bien en un tubo e ensayo (especialmente en los casos dudosos).

145

MTODO DEL PORTAOBJETOS

MATERIALES
Una pipeta gotera, calibrada para suministrar 20 gotas por ml. Pipetas Pasteur con perillas de goma (chupn). Una centrfuga. Solucin de cloruro de sodio (ver pgina 486). Tubos de ensayo de 50 x 11 mm, para el lavado de los eritrocitos. Eritrocitos testigos de los grupos A, B, Y O. Antisueros: anti A, anti b y anti AB. Sangre capilar o venosa anticoagulada o coagulada (ver pgina 80).

PROCESAMIENTO DE LA SANGRE OBTENIDA


SANGRE VENOSA ANTICOAGULADA CON EDT A (Ver pgina 465)

l.

Centrifugar la sangre por 5 minutos a 2500 RPM. Aspirar el plasma con una pipeta Pasteur. Conservar este plasma para clasificar grupos sanguneos por medio de eritrocito s estandarizados.

2.

SANGRE VENOSA COAGULADA

l.

Obtener 5 - 10 ml de sangre en no tubo de ensayo. Dejar coagular y centrifugarla durante 5 minutos a 2 500 RPM.

2.

146

3.

Aspirar el suero con una pipeta Pasteur. Conservar el suero para hacer clasificaciones de grupos sanguneos por medio de eritrocito s estandarizados.

SANGRE CAPILAR Este mtodo es til en nios.

l.

Depositar 3 gotas de solucin de citrato trisdico en concentracin de 38 g/l (ver pgina 486).

2.

Colocar en el mismo tubo, inmediatamente 10 gotas de sangre. Esta sangre no se coagular.

LAVADO DEL SEDIMENTO DE ERITROCITOS: SUSPENSIN DE GLBULOS ROJOS AL 10%

l.

Mezclar 5 gotas del sedimento de eritrocito s y 2 ml de solucin de cloruro de sodio. Centrifugar. Aspirar y eliminar el lquido sobrenadante. Aadir nuevamente 2 ml de solucin de cloruro de sodio. Agitar el tubo suavemente. De este modo se ha obtenido una suspensin de glbulos rojos al 10%.

2.

3.

4.

147

PROCEDIMIENTO

1.

Preparar y numerar 3 portaobjetos: Portaobjetos 1: Agregar 1 gota de anti A. Portaobjetos 2: Agregar 1 gota de anti B. Portaobjetos 3: Agregar 1 gota 4de anti AB.

2. Agregar a cada portaobjetos 1 gota


de la suspensin preparada de glbulos rojos al 10%.

3.

Mezclar la preparacin de cada portaobjetos con un aplicador de madera (o un palito de dientes). Usar un aplicador nuevo en cada portaobjetos.

4. Hacer oscilar el portaobjetos hacia


delante y hacia atrs para terminar de hacer la mezcla.

148

LECTURA

La lectura se debe realizar antes de que transcurran 2 minutos, para evitar una falsa aglutinacin.

Aglutinacin positiva (+) Se forman pequeos conglomerados de glbulos rojos que flotan en un lquido claro. Esta aglutinacin deber ocurrir en menos de 2 minutos.

Reaccin negativa (-) Los glbulos aglutinan. rojos no se

RESULTADOS

El resultado final se identifica haciendo la lectura de los 3 potaobjetos.

149

MTODO DEL TUBO DE ENSAYO


Se emplea el mtodo del tubo de ensayo en todos los casos dudosos de identificacin del grupo sanguneo, cuando se ha usado el mtodo del portaobjetos.

MATERIALES

Una pipeta gotera, calibrada para suministrar 20 gotas por ml. Pipetas Pasteur con perillas de goma (chupn). Una centrfuga. Solucin de cloruro de sodio (ver pgina 486). Tubos de ensayo de 50 x 11 rom, para el lavado de los eritrocitos. Eritrocitos testigos de los grupos A, B, Y O. Antisueros: anti A, anti B y anti AB. Tubos de ensayo pequeos, con una gradilla.

LAVADO DEL SEDIMENTO DE ERITROCITOS: SUSPENSIN DE GLBULOS ROJOS AL 2%

l.

Mezclar 2 gotas del sedimento de eritrocitos ms 4 ml de la solucin de cloruro de sodio. Centrifugar. Aspirar y eliminar el lquido sobrenadante. Agregar 4 ml de solucin de cloruro de sodio. Agitar el tubo suavemente. El resultado es una suspensin de eritrocitos al 2%.

2.

3.

4.

150

PROCEDIMIENTO

1.

Preparar y numerar 3 tubos de ensayo: Tubo 1: Agregar 1 gota de anri A. Tubo 2: Agregar 1 gota de anri B. Tubo 3: Agregar 1 gota de anri AB.

2. Agregar a cada tubo 1 gota de la


suspensin de eritrocito s al 2% ya preparada.

3.

Si no cuenta con una centrfuga, dejar reposar los tubos durante 1 hora a temperatura ambiente.

4. Si se cuenta con una centrfuga,


dejar reposar los tubos por 15 minutos a temperatura ambiente. Luego centrifugar, por 1 minuto a baja velocidad.

151

LECTURA

l.

Sacudir ligeramente el fondo del tubo de ensayo y luego examinar el sedimento de glbulos rojos.

2.

Usar para la observacin de los resultados el espejo cncavo del microscopio:

Aglutinacin positiva (+) Los glbulos rojos forman uno o ms conglomerados y se observa un lquido sobrenadante claro.

Reaccin negativa (-) Los glbulos rojos vuelven a formar una suspensin fcilmente, sin aglutinacin visible.

3.

Se puede usar tambin, para la observacin de los resultados, el microscopio:

Si ocurre una aglutinacin dbil colocar una gota de suero de los eritrocitos y examinar con el microscopio, usando el objetivo l0x.

152

Aglutinacin evidente Se observa grandes conglomerados de glbulos rojos sobre un fondo claro.

Aglutinacin dbil Se observan conglomerados pequeos de glbulos rojos y algunos glbulos rojos sueltos en el campo microscpico.

No ocurre aglutinacin Todos los glbulos rojos se encuentran sueltos.

4. Si los glbulos rojos no aglutinan y


forman "columnas de moneda", aadir 2 gotas de solucin de cloruro de sodio a la gota de la mezcla de glbulos rojos que se encuentra en el portaobjetos. Examinar con el microscopio si existe aglutinacin positiva los conglomerados de glbulos blancos conservar su forma y si es negativa, la "columna de monedas" se dispersar.

153

CLASIFICACIN DEL GRUPO RHESUS (Rh)

PRINCIPIOS GENERALES
Para la determinacin del grupo Rhesus (Rh), se hace una prueba que permite detectar el antgeno D, empleando el suero anti D.

Se dice que los individuos son Rh positivos, cuando son portadores del antgeno D.

Son Rh negativos, los individuos que carecen del antgeno D.

MTODO DEL PORTAOBJETOS

MATERIALES
Un portaobjetos. Una pipeta Pasteur. Un calentador elctrico o mechero de alcohol. Suero anti D (si es comercial, seguir las instrucciones que indique el fabricante). Muestra de sangre a examinar. Muestra testigo de sangre Rh positivo. Muestra testigo de sangre Rh negativo.

PROCESAMIENTO DE LA SANGRE OBTENIDA


Preparar una suspensin de eritrocitos al 50% en su propio suero o plasma, de la siguiente manera:

154

SANGRE CON ANTICOAGULANTE (EDT A)

l.

Centrifugar 2,5 ml de sangre durante 5 minutos a alta velocidad.

2.

Verificar que el volumen del sedimento de eritrocitos sea igual al volumen del plasma sobrenadante. Si el plasma es mayor aspirar el excedente con la pipeta hasta que ambos volmenes sean iguales.

3.

Mezclar el plasma y los eritrocitos con suavidad.

SANGRE COAGULADA

l.

Romper el cogulo con una pipeta para dispersar los eritrocitos.

2.

Trasladar una porcin de eritrocitos sueltos, acompaados de suero, a un tubo de centrifugacin.

3.

Centrifugar por 5 minutos a alta velocidad.

4.

Aspirar con una pipeta el exceso de suero hasta que el volumen de ste y el de los eritrocitos sean iguales.

5.

Mezclar el suero y los eritrocitos con suavidad.

155

6.

Verificar la presencia de eritrocitos sueltos, para lo cual se extiende una gota de la suspensin mezclada en un portaobjetos limpio y se examina con el microscopio a 10x.

Si contiene conglomerados de eritrocito s desechar esta suspensin y preparar otra, fresca.

MTODO

1.

Encender el calentador elctrico, cuya temperatura deber ser de 40 o C en la superficie. Colocar los portaobjetos numerados sobre el calentador y dejarlos por 5 minutos.

2. Si no se dispone de un calentador
elctrico calentar los portaobjetos sobre la llama de un mechero de alcohol antes de iniciar la prueba. Probar la temperatura sobre el dorso de la mano; el calor deber ser soportable.

3.

Depositar en el portaobjetos 1 gota de la mezcla de eritrocitos y del suero que se va a examinar ms 1 gota de suero anti D.

156

4.

Mezclar empleando un aplicador, un palito de dientes o el extremo redondo de un tubo de ensayo pequeo.

5. Continuar

la mezcla haciendo oscilar el calentador hacia delante y hacia atrs.

RESULTADOS

Rh positivo En el centro y la periferia de la mezcla se observa claramente un gran nmero de pequeas aglutinaciones de eritrocitos. Estas aglutinaciones se debern formar en menos de 3 minutos.

Rh negativo No se observa aglutinaciones.

157

MTODO DEL TUBO DE ENSAYO

MTODO

l.

Preparar una suspensin de eritrocitos al 2% en su propio suero o plasma (ver pgina 154). Ajustarlo para 2%.

2. Colocar en un tubo de ensayo 1 gota


de la suspensin de eritrocito s al 2 % ms 1 gota de suero anti D.

3.

Colocar el tubo a 37C en un bao mara o una incubadora durante 60 minutos.

RESULTADOS

Examinar el lquido que se encuentra en el fondo del tubo de ensayo, colocando el tubo en posicin casi horizontal, sobre una superficie iluminada.

Rh positivo Se observa pequeas aglutinaciones de eritrocitos en un lquido claro.

158

Rh negativo Los eritrocitos suspendidos y no aglutinaciones. permanecen observan

se

159

COMPATIBIUDAD SANGUNEA

PRINCIPIOS GENERALES
Esta prueba llamada tambin "Prueba cruzada". Consiste, en determinar si el suero del paciente contiene anticuerpos que aglutinen los eritrocitos del donador.

MATERIALES

Suero del paciente. Suspensin al 5% de eritrocitos Lavados del donador. Albmina bovina al 20%. Bao mara o incubadora a 37C. Una centrfuga. Pipetas Pasteur.

MTODO

1. Preparar una suspensin a15% de


eritrocito s lavados del donador.

2. Numerar 2 tubos de ensayo: tubo 1 y


tubo 2.

160

3. Colocar en cada tubo numerado 2


gotas de suero fresco del receptor y 2 gotas de la suspensin al 5% de eritrocitos lavados del donador.

4. Mezclar los eritrocitos y el suero con suavidad, golpeando el fondo de cada


tubo.

5. Colocar los tubos en un bao mara o


una incubadora a 37C durante 90 minutos. En caso de urgencia es probable que no se pueda incubar los tubos durante el tiempo necesario. Si se cuenta con menos de 45 minutos, examinar el tubo 1:

Centrifugar el tubo 1 a baja velocidad. Examinar con el microscopio empleando el objetivo de l0x el sedimento de los eritrocitos.

Si no existe aglutinacin se puede aceptar la sangre para el paciente, pero se debe escribir la siguiente nota en la etiqueta de la bolsa de sangre "Sangre compatible segn estudio urgente".

6. Aadir 2 gotas de albmina bovina al


2% al tubo 2. No mezclar, incubar durante otros 20 - 30 minutos.

161

RESULTADOS

Observar con el microscopio el sedimento de eritrocitos de cada tubo; para lo cual:

Aspirar con una pipeta Pasteur el sedimento de eritrocitos. Evitar agitarlo demasiado.

Extender

el

sedimento

en

portaobjetos limpios. Examinar con el microscopio empleando el objetivo 10x, para determinar si existe aglutinacin. Si no hay aglutinacin: La sangre es compatible y se puede administrar sin riesgos al paciente. Si hay aglutinacin: La sangre es incompatible y no se debe administrar.

162

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN DE LOS ERITROCITOS


PRINCIPIOS GENERALES
La prueba de velocidad de sedimentacin de los eritrocitos (VSE) se basa en el principio que en la sangre, a la que se ha aadido un anticoagulante, los eritrocitos (glbulos rojos) sedimentan hasta formar una columna compacta en la parte inferior del tubo o recipiente que se mantiene en posicin vertical.

La velocidad de este proceso depende de varios factores, siendo los principales: La concentracin del fibringeno en el plasma. La concentracin de globulina alfa y beta en el plasma. La diferencia entre la densidad del plasma y la masa de glbulos.

Se han descrito un gran nmero de mtodos para su determinacin. Estos mtodos se diferencian por el anticoagulante empleado, las dimensiones del tubo, el volumen de sangre y el tiempo utilizado.

Esta prueba es ampliamente utilizada en el diagnstico y pronstico de diversos estados patolgicos como: Lupus eritematoso. Artritis reumatoide. Espondilitis anquilosante, etc.

La medicin de VSE se deber efectuar en menos de dos horas despus de que se haya obtenido la sangre.

La VSE aumenta con la temperatura, a partir de los 23C. En climas clidos se debe vigilar que los tubos empleados para VSE no se coloquen en un lugar caluroso del laboratorio.

163

MTODOS

MTODO DE WESTERGREN

MATERIALES
Un tubo de Westergren de 300 mm de longitud y 2,5 mm de dimetro interior. Graduado de O a 200 mm. Anticoagulante: citrato trisdico en proporcin de 38g/l (3,8%). Una jeringa de 5 ml. Un cronmetro o reloj.

MTODO

l.

Depositar en un tubo o frasco 0,4 ml de solucin de citrato trisdico.

2.

Extraer 2 ml de sangre venosa.

164

3.

Depositar 1,6 ml de la sangre venosa en el frasco que contiene la solucin de citrato trisdico.

4. Agitar con suavidad. 5. Aspirar la sangre del frasco, y


depositarla en el tubo de Westergren hasta la lnea 0. Evitar la formacin de burbujas en el interior del tubo.

6.

Colocar el tubo en la gradilla de Westergren, en posicin completamente vertical.

7. Esperar durante 1 hora exacta (usar


su cronmetro o reloj) ya continuacin, medir la altura de la columna del plasma segn la graduacin en mm (milmetros) del tubo a partir de la lnea 0, del extremo superior.

165

RESULTADOS
Se expresa en VSEmm de altura. Los valores normales de Westergren son:

Ventajas del mtodo Este mtodo es el ms sensible de la VSE para el estudio de enfermedades crnicas.

Desventajas del mtodo Requiere mayor cantidad de sangre que otros mtodos.

MTODO DE WINTROBE

MATERIALES
Un tubo de hematocrito Wintrobe. Anticoagulante para 5 ml de sangre venosa. Una jeringa. Un cronmetro o reloj.

MTODO l.
Preparar el anticoagulante; mezclando 6 mg de oxalato de amonio ms 4 mg de oxalato de potasio.

2. Colocar 1 ml de sangre venosa en un tubo o frasco conteniendo slo 2 mg del


anticoagulante.

166

3. Mezclar bien por inversin suave. 4. Aspirar la sangre del tubo o frasco y depositarla en el tubo de Wintrobe. Evitar
la formacin de burbujas en el interior del tubo.

5. Colocar el tubo en la gradilla de Wintrobe, en posicin completamente vertical. 6. Esperar durante una hora exacta (usar su cronmetro o reloj). A continuacin,
medir la altura de la columna del plasma segn la graduacin en milmetros (rnm) del tubo a partir del extremo superior.

RESULTADOS
Se expresan en VSEmm de altura.

Los valores normales de Wintrobe son:

Ventajas del mtodo Es sencillo, requiere pequea cantidad de sangre. Con la misma preparacin, una vez que se ha determinado la VSE, puede calcularse el valor del hematocrito y pueden hacerse frotis de la capa de clulas blancas.

Desventajas del mtodo El exceso de mezcla de oxalato en el mtodo de Wintrobe puede hacer que la lectura de VSE aparezca baja, debido a que el oxalato retarda la sedimentacin.

167

CAPITULO IV

ESPUTO
OBTENCIN DE ESPUTO...........................175 Principios generales .............................175 RECIPIENTES PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE ESPUTO ............................175 PROCEDIMIENTO DE OBTENCIN ...........176 Expectoracin espontnea ...................176 Expectoracin inducida ........................177 EXAMEN DIRECTO DEL BACILO DE LA TUBERCULOSIS .........................................178 BACILOSCOPA ...........................................178 Principios generales .............................178 Preparacin del extendido....................178 Coloracin del extendido: Tcnica de Ziehl Neelsen .....................182 Observacin microscpica de la muestra Coloreada.............................................185 Mtodo de lectura.................................186 Informe de resultados de baciloscopla .186 Registro diario de baciloscopla.............187 CULTIVO DE BK.......................................... 188 Principios generales............................. 188 Materiales ............................................ 189 Mtodos ............................................... 190 Mtodo para muestras obtenidas aspticamente...................................... 190 Mtodo para muestras contaminadas .. 191 Lectura ................................................. 195 Informe de resultados del cultivo ......... 196 Preparacin de medios de cultivo ........ 196 PRUEBA DE SENSIBILIDAD DE M.tuberculosis A LOS MEDICAMENTOS ANTITUBERCULOSOS ............................... 201 Principios generales............................. 201

168

OBTENCIN DE ESPUTO
PRINCIPIOS GENERALES
Una buena muestra: Es aquella que proviene del rbol bronquial, y se obtiene despus de un esfuerzo de tos. Sin embargo, una muestra con apariencia de saliva puede ser positiva. Muestra suficiente: Es aquella con un volumen aproximado a 5 a 10 ml. La hora de obtencin puede ser a cualquier hora del da, de preferencia ser el primer esputo de la maana y siempre antes del desayuno. El ambiente donde se obtiene la muestra debe tener buena ventilacin y debe prohibirse la presencia de otras personas, al momento de la obtencin de la muestra.

RECIPIENTES PARA RECOLECTAR MUESTRAS DE ESPUTO

Se puede utilizar: Frascos de vidrio con tapa rosca. Envases desechables de material plstico con tapa. Pequeas cajas de cartn con tapa.

En general, debern ser de boca ancha (aproximadamente 5 cm de dimetro) y 5 cm de altura. As, el paciente puede expectorar con facilidad dentro del recipiente y el laboratorista al momento de efectuar el examen directo puede elegir la mejor parte.

169

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIN

EXPECTORACIN ESPONTNEA

1.

Indicar al paciente que se ponga de pie.

2.

Solicitar que haga un movimiento inspiratorio profundo, llenando de aire los pulmones.

3. Indicar al paciente que vacie los


pulmones con una sola espiracin, tosiendo al mismo tiempo tan fuerte y profundamente como pueda.

4.

Solicitar que escupa en el interior del recipiente rotulado.

5. Tapar el recipiente y en una bolsa


plstica llevarla inmediatamente. al laboratorio

170

EXPECTORACIN INDUCIDA
Cuando el paciente no logra expectorar y es necesario el examen de esputo, se puede inducir la obtencin de la muestra de la siguiente manera:

1.

Acostar al paciente boca abajo sobre una camilla o cama, haciendo que su cabeza rebase el borde.

2. Colocar una almohada doblada


debajo del trax para lograr un plano inclinado, de modo que la base del trax quede ms alto que la boca, asimismo pedir que deje caer ambos brazos y la cabeza hacia el piso.

3.

Indicar al paciente que inspire, retenga el aire y luego lo expulse con fuerza hasta obtener la expectoracin.

4. Escupir en el recipiente rotulado


que deber estar sobre un papel peridico en el piso.

171

EXAMEN DIRECTO DEL BACILO DE LA TUBERCULOSIS

BACIL0SCOPA

PRINCIPIOS GENERALES
La baciloscopa es la tcnica fundamental para el diagnstico de la tuberculosis.

Debe emplearse en toda muestra tanto pulmonar como extrapulmonar y para el control mensual del tratamiento y retratamiento por TBC.

Siempre deben aplicarse las normas de bioseguridad para el manejo de muestras infectantes.

PREPARACIN DEL EXTENDIDO

172

MATERIALES

Materiales para la obtencin de muestra. Lminas portaobjetos, que no estn rayadas. Aplicadores o palitos de madera (bajalenguas). Mechero de alcohol. Lpiz graso o para marcar vidrio. Papel peridico. Bandeja de acero inoxidable o fierro enlozado para recepcin de muestras (dimensiones recomendadas: 60 x 40 x 10 cm).

Fenol al 5% (ver pgina 469). Soporte de madera para lminas portaobjetos.

PROCEDIMIENTO

l.

Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel peridico o la bandeja de fierro con papel peridico, humedecido con fenol al 5%.

2.

Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo previamente rotuladas sobre la mesa de trabajo.

173

3.

Colocar las lminas portaobjetos sobre el soporte de madera.

4.

Numerar los envases y las lminas portaobjetos con el lpiz graso en forma correlativa. Trazar una lnea en el tercio inferior de cada lmina portaobjetos en la cara opuesta del extendido empleando el lpiz graso, la que dividir la superficie de la lmina en una tercera parte destinada a la numeracin y dos terceras partes para hacer el extendido.

5. Destapar cuidadosamente el envase


de la muestra, manteniendo la boca del envase cerca del mechero encendido.

6.

Dividir el aplicador de madera (bajalengua) en dos o tres partes y agarrarlo entre el pulgar y el ndice de la mano, para luego seleccionar y extraer la porcin muco-purulenta de color amarillo verdoso del esputo, enrollndola en el aplicador.

174

7.

Colocar la porcin elegida sobre el portaobjetos y extenderla, haciendo movimientos en vaivn, hasta lograr que el extendido sea uniforme (ni muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lmina, para evitar que el laboratorista se contamine al manipularla.

8. Pasar por la llama del mechero los


bordes de la lmina extendida, colocar sobre el soporte de madera y dejar secar a temperatura ambiente.

9.

Fijar cada lmina, una vez seca, mediante dos o tres pasajes rpidos sobre la llama del mechero con el extendido hacia arriba.

10. Terminado el extendido, descartar los


aplicadores en el recipiente de incineracin y cerrar el envase que contiene la muestra.

175

COLORACIN DEL EXTENDIDO: TCNICA DE ZIEHL NEELSEN

El bacilo de la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis, es resistente a los cidos, es decir, una vez teidos de rojo con fucsina bsica fenicada, no se pueden decolorar por medio de cidos o etanol.

Antes de su uso, todos los colorantes y soluciones a emplearse deben ser previamente filtrados.

MATERIALES
Una serie de lminas portaobjetos con extendidos fijados. Dos varillas de vidrio unidas por sus extremos, por un tubo de goma. Reactivos para coloracin: Fucsina bsica fenicada, azul de metileno, fenol de cristales, cido clorhdrico, alcohol de 95 yagua destilada (ver pgina 474). Un microscopio binocular, con objetivo de l00x. Aceite de inmersin. Un mechero de alcohol. Un soporte de madera para lminas portaobjetos.

MTODO

l.

Colocar sobre los bordes del lavadero las 2 varillas de vidrio unidas por sus extremos, por un tubo de goma.

176

2.

Colocar sobre este soporte de varilla, la serie de lminas fijadas con el extendido hacia arriba, el nmero hacia el lado del laboratorista.

3.

Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con el colorante fucsina bsica fenicada. No olvidar filtrar el colorante antes de efectuar la tincin.

4. Calentar suavemente con la llama


del mechero de alcohol, por debajo de cada lmina portaobjetos, hasta la emisin de vapores, repetir el proceso tres veces. No debe hervir la preparacin. Si el volumen del colorante disminuye por evaporacin, agregar ms colorante hasta cubrir el extendido y dejar enfriar. El tiempo mnimo de coloracin con fucsina es de 5 minutos.

5.

Eliminar la fucsina tomando la lmina por el extremo numerado, entre el dedo pulgar y el ndice o con una pinza, inc1inndola hacia delante y dejando caer agua corriente a baja presin sobre la parte que no tiene el extendido.

177

6.

Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la solucin de alcohol cido, durante 2 minutos, hasta obtener una coloracin rosa plido. De ser necesario, decolorar nuevamente y dejar reposar 1 minuto.

7. Eliminar el alcohol cido, lavar


nuevamente las lminas con agua corriente a baja presin, cuidando de no desprender la pelcula que form el extendido.

8.

Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno, durante 30 segundos a 1 minuto. Eliminar el azul de metileno y lavar cada lmina con agua a baja presin, por ambas caras de la lmina portaobjetos.

9. Colocar las lminas coloreadas en


orden numrico sobre el soporte de madera y dejar secar al medio ambiente.

178

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LA MUESTRA COLOREADA


La observacin microscpica tiene por objetivo: Determinar si en el extendido hay bacilos alcohol cido resistentes (BAAR). Establecer el nmero de estos BAAR.

Se usa un microscopio con objetivo de l00x de aumento. Antes de usarlo, se debe colocar una gota de aceite de inmersin sobre el extendido. En la observacin microscpica los BAAR presentan las siguientes caractersticas: Son de color rojo fuerte: destacan sobre un fondo azul. Tienen curvos. Son muy pequeos (1 - 4 11m). Son frecuentemente granulosos. Se disponen en grupos de 3 - 10 bacilos que asemejan trozos de hilo o parecen formas de letras torcidas fibrina). (con frecuencia se encuentran cerca de los hilos de forma recta o como bastoncitos delgados, ligeramente

En la observacin microscpica los BAAR se pueden confundir con: Levaduras, que se tien ms o menos de rojo. Al calentarlas se rompen y forman grupos de grnulos voluminosos de color rojo. Manchas de colorante, cuando el portaobjetos no se ha decolorado adecuadamente. No olvidar que otro bacilo patgeno resistente a los cidos es el bacilo de la lepra.

179

MTODO DE LECTURA
Es importante tener en cuenta que se considera como campo microscpico til, aquel en el cual se observa elementos celulares de origen bronquial, es decir, leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas. Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben considerarse en la lectura. Una vez identificados los campos proceder de la siguiente manera:

l.

Observar un mnimo de 100 campos tiles. Hacer un examen completo del primer portaobjetos empleando el objetivo de 100x, avanzando de izquierda a derecha, con iluminacin mxima y sin filtro de color. Apuntar el nmero de bacilos observados y el nmero de campos microscpicos tiles a observarse, que variar segn la cantidad de bacilos que contenga la muestra.

2.

INFORME DE RESULTADOS DE BACILOSCOPA


Se informa con la siguiente escala semicuantitativa:

180

En caso de encontrar de 1 a 9 BAAR en 100 campos microscpicos observados, se proceder a:

1.

Leer 100 campos ms, contabilizando slo campos microscpicos tiles, en busca de positividad. Si persiste el resultado (1 a 9 BAAR) realizar otro extendido de una porcin ms representativa de la misma muestra, en bsqueda de positividad y reportar el nmero de BAAR observado. Derivar la muestra problema a cultivo para su confirmacin bacteriolgica. Indicar en el formato de resultados, en "observaciones" (ver pgina 494), que se est derivando la muestra a cultivo y sugerir el envo de ms muestras.

2.

3. 4.

REGISTRO DIARIO DE BACILOSCOPA


Los registros son medios prcticos para obtener informacin que ayudan en las actividades de vigilancia, supervisin y evaluacin del Programa Nacional de Control de Tuberculosis. Ofrece informacin necesaria para preparar los informes mensuales y trimestrales sobre deteccin y control de casos de tuberculosis. El personal que realiza las baciloscopas estar obligado, bajo responsabilidad, a llevar el registro diario de las baciloscopas efectuadas y velar por la integridad y puesta al da de la informacin. Para ello se requiere un libro donde se consigna una numeracin correlativa anual. Se empezar anualmente el 2 de enero y terminar el 31 de diciembre del mismo ao, desde el nmero 1 hasta el ltimo correspondiente. Para el consolidado mensual y trimestral deber llenarse una hoja ad hoc (ver pgina 495), conforme lo establece la "Doctrina de Normas y Procedimientos para el Control de la Tuberculosis en el Per. 1995". Una referencia concreta de la informacin mnima a registrarse se muestra en los anexos.

181

CULTIVO DE BK

PRINCIPIOS GENERALES

Se indica cultivo para M.tuberculosis, en los siguientes casos:

Sintomtico respiratorio en seguimiento diagnstico, con dos BK negativos y cuadro clnico-radiolgico sugestivo de tuberculosis. Paciente con sospecha de fracaso al Esquema Uno de tratamiento, por persistencia o reaparicin de baciloscopa directa positiva al quinto o sexto mes de tratamiento. Paciente con sospecha de fracaso al Esquema Dos de tratamiento, por persistencia o reaparicin de baciloscopa directa positiva al stimo u octavo mes de tratamiento. Muestra paucibacilar de BK (1 a 9 BAAR en 100 campos). Muestras extrapulmonares. En el caso de VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) positivos y sospecha de TBC, se cultivar toda muestra pulmonar o extrapulmonar. Muestras de pacientes multitratados (ms de dos tratamientos) y con persistencia de positividad al BK directo. Muestras negativas al BK directo en menores de 15 aos.

182

Materiales

Materiales para la obtencin de muestras (ver pgina 175). Una centrfuga. Estufa o bao mara. Mortero de porcelana estril. Mascarilla protectora. Agua destilada estril. Hidrxido de sodio (NaOH) al 4%. Rojo de fenol. cido sulfrico. Tubos estriles con tapa rosca. Mechero de Bunsen o de alcohol. Pipeta Pasteur con chupn. Bandeja de madera de fondo inclinado. Gradilla. Tubos con medio de Ogawa acidificada. Tubos con medio de Lowenstein Jensen.

183

MTODOS

MTODO PARA MUESTRAS OBTENIDAS ASPTICAMENTE


Las muestras obtenidas aspticamente son recolectadas en un recipiente estril, y se cultivan sin realizar un proceso de descontaminacin previo.

Las muestras recolectadas aspticamente son: Muestras obtenidas por puncin: Lquido cefalorraqudeo, pleural, peritoneal y articular. Muestras obtenidas por biopsia (tejido): Pulmonar, hgado, ganglio.

MUESTRAS OBTENIDAS POR PUNCIN


Si se obtiene volmenes suficientes deben ser centrifugados y el sedimento se sembrar en varios tubos de cultivo. Si la cantidad de la muestra es pequea, se sembrar toda la muestra.

MUESTRAS OBTENIDAS POR BIOPSIA (TEJIDO)


En estos casos el laboratorista debe trabajar en una cabina de bioseguridad (aislamiento) y protegido con una mascarilla. Primero debe proceder a triturar la muestra obtenida en un mortero de porcelana previamente esterilizado. De ser necesario, agregar agua destilada estril, hasta obtener una suspensin que puede ser inoculada directamente en el medio de cultivo.

184

MTODO PARA MUESTRAS CONTAMINADAS

Las muestras contaminadas tales como: esputo, orina, contenido gstrico, etc. deben ser descontaminadas antes del cultivo.

La descontaminacin tiene por objeto: Eliminar la flora asociada a M.tuberculosis, cuyos grmenes se multiplican ms rpido que el bacilo. Homogeneizar (uniformizar) la muestra, especialmente el esputo, a fin de liberar al bacilo M.tuberculosis del.mucus, material celular y tejidos.

Se procede de la siguiente manera: Centrifugar las muestras de orina y contenido gstrico debern a 3 000 3 500 RPM (revoluciones por minuto) durante 20 a 30 minutos. Eliminar el sobrenadante. Descontaminar y sembrar el sedimento.

l.

2. 3.

a. Descontaminacin con centrifugacin (Mtodo de Petroff) y uso del medio de Lowenstein Jensen

l.

Trabajar frente a la llama del mechero. Cada operador debe procesar en series de 12 muestras por vez. Es conveniente trabajar utilizando tubos con tapa rosca; si no se cuenta con ellos, usar tubos con tapn de algodn bien ajustado.

185

2.

En un tubo, mezclar 2 ml de la muestra con 4 mI de solucin estril de hidrxido de sodio al 4%. Ajustar firmemente la tapa del tubo, para impedir que al agitarlo se diseminen aerosoles que son peligrosos para el operador.

3. Agitar vigorosamente. Incubar a


37C durante 20 minutos, agitando cada 5 minutos.

4.

Centrifugar durante 20 minutos a 2000 - 3 000 RPM Y desechar el sobrenadante.

5. Agregar al sedimento 1 - 2 gotas de


solucin de rojo fenol (indicador de pH) y 1 - 2 gotas de solucin de cido sulfrico al 10 15% para producir el viraje del indicador, desde rojo violceo al amarillo anaranjado.

186

6.

Efectuar un lavado para eliminar los restos de cido sulfrico: Agregar aproximadamente 3 ml de agua destilada estril, agitar, centrifugar durante 10 minutos y se desecha el sobrenadante.

7. Inocular el sedimento al medio de


cultivo Lowenstein- Jensen. La cantidad inoculada a cada tubo de medio de cultivo es de 4 - 5 gotas. Durante el sembrado de la muestra descontaminada, los tubos con el medio de cultivo deben mantenerse en posicin inclinada cerca de la llama.

8.

Tomar con una pipeta Pasteur 1 ml de muestra descontaminada y sembrar 4 5 gotas en cada tubo de medio de cultivo, dejando escurrir la muestra sobre la superficie del medio, sin tocarla con la pipeta.

9. Una vez sembrados los tubos con


medio de cultivo, colocarlos sobre una bandeja de fondo inclinado, para que el lquido sembrado cubra toda la superficie del medio. Llevarlos a la estufa a una temperatura entre 35 y 37C, dejando floja la tapa de cada tubo para que pueda evaporarse la parte lquida de la siembra.

187

10. Despus de 48 horas, revisar los tubos y, si se ha evaporado el lquido, ajustar


la tapa rosca. Si se usan tapn de algodn, flamearlo e introducido con una pinza y cerrar con un tapn de jebe estril.

b. Descontaminacin sin centrifugacin y uso del medio Ogawa acidificado

l.

Sobre la mesa de trabajo colocar las muestras numeradas y en una gradilla colocar tubos estriles numerados con la misma secuencia de las muestras. Colocar 1 mi de muestra (esputo. sedimento de muestra centrifugada, etc.) en cada tubo estril de acuerdo con la numeracin correspondiente. Agregar 4 mI de solucin estril de hidrxido de sodio (NaOH) al 4%. Dejar a 37C por 20 minutos en estufa o en bao mara.

2.

3.

4. Retirar los tubos de la estufa o bao


mara, homogenizar (mezclar) el contenido de cada tubo con una pipeta e inocular 0,1 mI (por tubo) en dos 2 tubos de medio Ogawa, y baar toda la superficie del medio.

5.

Colocar los tubos en una bandeja de madera de fondo inclinado, e incubar en estufa a 37C.

188

LECTURA

El desarrollo de M.tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas.

Las observaciones de los cultivos se hacen despus de 48 horas de incubacin de la muestra, para descartar contaminacin: Alcalinizado: Color blanco amarillo. Acidificado: Color azul oscuro, por mala descontaminacin (neutralizacin) de la muestra. El desarrollo de colonias antes de las 48 horas es indicativo de contaminacin, algunas veces el medio se lica por accin de grmenes proteolticos.

Las revisiones posteriores se realizarn durante la incubacin a los 7, 30 Y 60 das.

Si no se observan colonias en el tiempo mencionado, se deja los cultivos hasta las 8 semanas antes de proceder a informar el resultado como negativo.

Las colonias tpicas son de color crema, rugosas, con aspecto de coliflor y de borde irregular. Se desarrollan en la superficie del medio y el sitio en que se implantan no cambia de color.

De las colonias que no tienen una morfologa tpica, se debe hacer un extendido y colorearlo por Ziehl Neelsen para examinarlo. Si son bacilos cido - alcohol resistente (BAAR), se debe enviar el cultivo al laboratorio de referencia para su identificacin.

189

INFORME DE RESULTADOS DEL CULTIVO


Se recomienda usar la escala semicuantitativa.

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

MATERIALES
Todo el material de vidrio debe esterilizarse en bao mara o en autoclave. Un frasco fraccionador de 2 000 ml, provisto de cao de goma o ltex. Pinza de Mohr. Accesorio en forma de campana para verter. Un embudo grande cubierto con dos capas de gasa, sujetadas al pico del embudo y protegidas por envoltura de papel grueso. Probeta de 1 litro. Batidora o licuadora de tipo casero con vaso de vidrio y tapa, que puede ser esterilizada, de ms de 1 litro de capacidad. Tubos de ensayo con tapa rosca o algodn 16 x 160 mm. Un coagulador a gas o elctrico, regulable a 80 - 85C, con bandeja de fondo inclinado.

190

a. Preparacin del medio de Lowenstein-Jensen

CONSTITUYENTES
Solucin de sales: Fosfato monopotsico (P04H2K) Sulfato de magnesio (S04Mg7H20) Citrato de magnesio L-asparagina Glicerina bidestilada Agua destilada Suspensin de huevos enteros

2,4 ,24 0,6 3,6 12 600 1 000

g. g. g. g. ml. ml. ml.

Solucin acuosa de verde de malaquita al 2%, recin preparada: 20 ml.

MTODO l.
Disolver las tres primeras sales y la asparagina en 200 - 300 mI de agua destilada. Calentar en bao mara hasta disolucin de la asparagina.

2.

Pasar la solucin del paso 1 a un frasco de 2 000 mI de capacidad, agregar agua destilada hasta completar 600 mI Y 12 mI de glicerina.

3.

Esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a 121C. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

4.

Los huevos deben ser frescos. Limpiarlos con agua y detergente, enjuagar con agua corriente y dejar secar. Luego, lavarlos con alcohol de 70.

5.

Con las manos cuidadosamente lavadas, quebrar los huevos uno por uno en el borde de una probeta de 1 litro y observar la yema de cada uno, que debe ser firme y conservar la forma redonda, sin aplastarse ni romperse.

191

6.

Vaciar los huevos de la probeta en el vaso de la licuadora y mezclarlos a baja velocidad durante algunos segundos cuidando de no causar exceso de burbujas.

7.

Vaciar los huevos homogenizados (mezclados) en el frasco que contiene la solucin de sales, asparagina y glicerina.

8.

Agregar la solucin de verde de malaquita.

9.

Agitar el frasco en forma circular.

10. Filtrar el contenido por el embudo cubierto de gasa, recibir el filtrado en el


frasco fraccionador cuidando de cerrar con pinza de Mohr el cao de salida.

11. Distribuir el medio hacindolo escurrir por la pared del tubo, flameando la
boca del tubo al sacarle y ponerle la tapa.

12. El

coagulador, debe haberse encendido previamente hasta lograr una temperatura de 85C.

13. Asegurarse que cada tubo y el ngulo


de la bandeja del coagulador, donde se colocan los tubos, sean adecuados como para que el medio forme en el tubo un plano inclinado, quedando por lo menos 3 cm entre la boca del tubo y el extremo del plano inclinado.

192

14. No deben transcurrir ms de 15 a 20 minutos desde el momento del llenado del


tubo hasta la colocacin en el coagulador.

15. Colocar los tubos en el coagulador durante 30 minutos a la temperatura


descrita.

16. Terminada la coagulacin, llevar los tubos a una estufa a 37C, dejndolos con
las tapas ligeramente flojas durante 48 horas para controlar su esterilidad y permitir que se elimine el agua de condensacin.

17. Transcurridas las 48 horas, ajustar bien las tapas para evitar la desecacin y
guardar los tubos en refrigeracin. Si se usan tubos con tapn de algodn, se guardarn en bolsas de plstico cerradas hermticamente, a fin de mantener la humedad.

b. Preparacin del medio de Ogawa

CONSTITUYENTES
Fosfato monopotsico (KH2P04) Glutamato de sodio Agua destilada Glicerol Verde de malaquita al 2% . Huevo homogenizado. 3 g. 1 g. 1 g. 6 ml 6 ml 200 ml.

193

MTODO l.
PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE SALES Disolver en 100 mI de agua destilada, el fosfato monopotsico y el glutamato de sodio y colocar en bao mara a 100C o en autoclave a 121C por 15 minutos. Luego, enfriarla a temperatura ambiente.

2.

PREPARACIN DE HUEVO HOMOGENIZADO Lavar los huevos con detergente y enjuagar con agua de cao, dejar secar en una canastilla de alambre. Limpiar los huevos con algodn embebido en alcohol al 70% Y dejar secar. Romper los huevos uno por uno y verter en un vaso pequeo, para comprobar si estn en buenas condiciones, de lo contrario descartar y cambiar de vaso. Vaciar los huevos en un beaker y mezclar con una bagueta o palillos estriles. Filtrar utilizando cuatro capas de gasa estril.

3.

Agregar 6 ml de glicerol y 6 ml de verde de malaquita al 2% a la solucin de sales y mezclar bien.

4.

Agregar el huevo homogeneizado lentamente a la solucin del paso 3, evitando la formacin de burbujas.

5.

Mezclar suavemente y dejar reposar por 30 minutos.

6.

Distribuir el medio en tubos de 20 x 125 mm, en una proporcin de 6 mI por tubo, evitando la formacin de burbujas.

7.

Colocar los tubos inclinados en el coagulador y dejar a 90C por una hora.

8.

Despus de la coagulacin, sacar los tubos y dejarlos enfriar. Luego, guardarlos en bolsas de plstico y cerrarlas hermticamente, anotando la fecha de preparacin. Pueden guardarse en el refrigerador hasta por un mes.

194

PRUEBA DE SENSIBIUDAD DE M. tuberculosis A LOS MEDICAMENTOS ANTITUBERCULOSOS

PRINCIPIOS GENERALES

Estos estudios de sensibilidad se indican en los siguientes casos:

Cepa del cultivo positivo que sirvi para el diagnstico de fracaso a los esquemas Uno o Dos.

Cepa de uno de los cultivos positivos al dcimo, onceavo y doceavo mes de re tratamiento en pacientes que hubiesen fracasado al esquema.

Cepa del cultivo positivo de pacientes multitratados al momento del diagnstico.

Cepas de cultivos positivos de pacientes con los virus de inmunodeficiencia humana (VIH) positivos o SIDA/TBC.

Cuando est en ejecucin por parte del Laboratorio de Referencia Nacional de Estudios de Resistencia Inicial o Secundaria.

Para otros estudios de investigacin operacional de la Red Nacional de Laboratorios en coordinacin con el Programa de Control de Tuberculosis.

195

CAPITULO III

ORINA
OBTENCIN DE ORINA.............................. 205 Principios generales ............................. 205 RECIPIENTES PARA ORINA....................... 207 Materiales............................................. 207 Mtodos de obtencin .......................... 207 EXAMEN DIRECTO DE FROTlS DE ORINA .................................................... 209 Principios generales ............................. 209 Materiales............................................. 209 Mtodo ................................................. 210 Lectura e informe.................................. 211 SEDIMENTOS URINARIOS ......................... 212 PRUEBA DEL EMBARAZO .........................234 Principios generales ............................. 212 Elementos microscpicos de los sedimentos urinarios ............................ 213 Preparacin del sedimento urinario ...... 224 GRAVEDAD ESPECFlCA Y PH DE LA ORINA .............................................. 226 MEDICIN DE LA GRAVEDAD ESPECIFICA ................................................ 226 Principios generales..............................234 Materiales .............................................234 Mtodos ................................................235 Mtodo del tubo de ensayo...................235 Mtodo del portaobjetos........................235 Principios generales..............................226 Materiales .............................................226 Mtodo ..................................................227 Lectura y resultados..............................227 MEDICIN DEL pH .......................................229 Principios generales..............................229 Materiales .............................................229 Mtodo ..................................................229 Resultados ............................................230 USO DE TABLETAS Y TIRAS REACTlVAS EN LOS EXMENES DE ORINA .......................231 Principios generales..............................231 Tabletas y tiras reactivas ......................232

196

OBTENCIN DE ORINA

PRINCIPIOS GENERALES
La cantidad apropiada _de orina que se debe recoger es de aproximadamente 50rnl.

Es importante la higiene personal previa a la obtencin de la orina. La contaminacin de la orina es frecuente por bacterias localizadas debajo del prepucio, en secreciones vaginales, en uretra distal, bacterias de la mano, de la piel y de ropas.

La higiene personal previa a la obtencin de la orina es necesaria hacerla en el momento de tomar las muestras y no antes.

MUJERES
Debern lavar el rea genital en todos los casos. Evitar recolectar muestras durante los periodos menstruales. Utilizar compresas de gasa estril, en una solucin de jabn antisptico, y limpiar alrededor del meato urinario, separando los labios vaginales. Enjuagar bien con agua estril mientras se mantienen separados los labios vaginales. Secar con gasa estril.

197

HOMBRES

Debern lavar el rea genital en todos los casos. Utilizar varias compresas de gasa estril, en una solucin de jabn antisptico para limpiar el glande. Si no est circuncidado, retraer el prepucio o piel que cubre el glande y mantenerlo retrado hasta que termine la limpieza. Enjuagar con agua estril. Secar con gasa estril.

HORAS MS APROPIADAS PARA OBTENER LAS MUESTRAS

En pacientes hospitalizados Lo ms conveniente es obtenerla a primera hora de la maana, la orina se encuentra concentrada.

En el laboratorio Si es posible, que el paciente produzca la muestra en el propio laboratorio.

198

RECIPIENTES PARA ORINA

Para exmenes bacteriolgicos

Usar frasco de vidrio de boca ancha, con tapa, estril.

Para otros exmenes

Cualquier recipiente o frasco de vidrio, limpios.

En caso de nios

Usar una bolsa de material plstico con boca adhesiva, que se fija alrededor de los genitales.

MATERIALES

Recipientes indicados: estril o limpio segn sea el examen solicitado. Jabn antisptico. Gasa estril.

MTODOS DE OBTENCIN

Recoger la muestra a la mitad de la miccin. Eliminar la primera parte de la miccin y desecharla. La orina que emite a continuacin se recoge directamente en el recipiente. Tapar el recipiente y terminar de orinar libremente.

199

Las muestras obtenidas con sonda, deben ser efectuadas por un mdico o un personal de salud capacitado. Se indica en situaciones especiales que determina el mdico.

En nios la orina se puede recoger en una bolsa de material plstico con boca adhesiva, que se fija alrededor de los rganos genitales del nio durante 1 - 3 horas, dependiendo del examen solicitado.

Muestras de 24 horas

El paciente deber orinar en la maana, al levantarse; esta orina no se recoge. Posteriormente, toda la orina que se produzca durante el resto del da se reunir en el frasco, as como toda la orina que se produzca en el curso de la noche. Al da siguiente, cuando el paciente se levante deber depositar en el frasco la primera orina de la maana. El frasco se llevar inmediatamente al laboratorio.

200

EXAMEN DIRECTO DE FROTIS DE ORINA

PRINCIPIOS GENERALES
El sedimento urinario se usa para preparar frotis. El examen microscpico directo de frotis teidos constituye una manera eficiente para estudiar la presencia de bacterias y otras veces, para establecer el diagnstico de una enfermedad (por ejemplo: tuberculosis, etc.). Es importante que se anote una descripcin detallada de los microorganismos que se observan y de los dems elementos encontrados (leucocitos, eritrocitos, clulas epiteliales, etc.).

MATERIALES

Un recipiente estril, para la obtencin de la muestra (ver pgina 207). Una centrfuga. Tubos cnicos para centrifugacin, estriles, con tapa rosca o tapn. Un portaobjetos. Un asa de siembra. Un mechero Bunsen. Reactivos para las tinciones de Gram y Ziehl Neelsen (ver pginas 473 y 474). Aceite de inmersin. Un microscopio.

201

MTODO

l.

Verter 10 ml de la orina obtenida en el tubo cnico para centrifugacin, estril, de preferencia con tapa rosca o taponado con un taco de algodn estril que se fijar en la boca del tubo con gasa y un hilo.

2.

Centrifugar a 2 500 RPM (revoluciones por minuto) durante 10 minutos.

3.

Eliminar el sobrenadante de la orina centrifugada.

4. Mezclar el sedimento, que queda en


el fondo del tubo, usando un asa de siembra estril (flameado) hasta que se forme una suspensin homognea (uniforme).

5.

Hacer 2 frotis de esta suspensin (ver pgina 318).

6.

Teir el frotis del portaobjetos 1 con tincin Gram y el portaobjetos 2 con tincin Ziehl Neelsen (ver pgina 473 y 474).

202

LECTURA E INFORME

a. Frotis con tincin Gram

l.

Examinar el frotis en el microscopio usando el objetivo 100x (antes, aplicar una gota de aceite de inmersin sobre el portaobjetos). Buscar pus, es decir, numerosos leucocitos teidos de rojo.

2.

4.

Para informar sobre los resultados, indicar si se ha observado leucocitos o pus, microorganismos, etc., haciendo una descripcin precisa. Ejemplo: Abundantes leucocitos. Escasos eritrocitos. Escasas clulas epiteliales. Abundantes cocos grampositivos en racimos.

b. Frotis con tincin Ziehl Neelsen

Los bacilos se tien de rojo oscuro. Se agrupan formando hileras. Para informar resultado ver pgina 186.

203

SEDIMENTOS URINARIOS

PRINCIPIOS GENERALES
En las personas sanas la orina casi no contiene microorganismos.

La orina contiene elementos microscpicos en suspensin: clulas, cristales, etc.

Como todos estos elementos en suspensin se sedimentan en la orina, si sta se deja en reposo durante algunas horas, se les llama sedimentos urinarios.

En ciertas enfermedades del aparato urinario se pueden encontrar bacterias: Cuando existe una infeccin en el conducto inferior, uretritis; en la vejiga, cistitis; en los riones, nefritis. Cuando se excretan en la orina bacterias de una infeccin que afecta otra parte del organismo.

Cuando existen las condiciones mencionadas en el tem anterior, los sedimentos se alteran y se pueden encontrar los siguientes elementos: Pus. Nmero anormal de glbulos rojos o eritrocitos. Cristales anormales.

204

ELEMENTOS MICROSCPICOS DE LOS SEDIMENTOS URINARIOS

a. Glbulos rojos o eritrocitos


Normalmente no hay eritrocitos en la orina. Sin embargo, se pueden encontrar eritrocitos en la orina de mujeres si las muestras se obtienen durante el periodo menstrual.

Los eritrocitos pueden estar: Intactos (a) Pequeos discos amarillentos, de 8 f-Im. Festoneados (b) Con bordes espinosos y dimetro reducido, de 5 - 6 f-Im. Hinchados (c) Crculos de poco grosor y dimetro aumentado, de 9 - 10 f-Im.

Para expresar la cantidad de eritrocitos es importante usar un solo mtodo, para lo cual se recomienda usar:

Una gota de sedimento urinario con pipeta Pasteur calibrada (50 gotas por cada ml). Un cubreobjetos de 20 x 20 mm. Examinar con el microscopio usando el objetivo de 40x.

La lectura e informe teniendo en consideracin lo anterior ser el siguiente: De 0 . 10 eritrocitos por campo = Escasos eritrocitos. De 10 . 30 eritrocitos por campo = Cantidad moderada de eritrocitos. Ms de 30 eritrocitos por campo = Abundantes eritrocitos.

205

b. Glbulos blancos o leucocitos

La presencia de abundantes leucocitos, especialmente en racimos, significa infeccin de los conductos urinarios.

Se pueden hallar leucocitos de las siguientes formas: Intactos: Discos claros y granulosos de 10 - 15 11m. Los ncleos se pueden ver (a). Degenerados: Deformes, encogidos, menos granulosos (b). Pus: Leucocitos degenerados numerosos, en racimos (c).

Para expresar la cantidad de leucocitos se emplea el mismo mtodo usado para los eritrocitos.

La lectura e informe respecto a la cantidad de leucocitos es el siguiente:

De 0 - 10 leucocitos por campo = Escasos leucocitos. De 10 - 20 leucocitos por campo = Cantidad moderada de leucocitos. De 20 - 30 leucocitos por campo = Abundantes leucocitos. Racimos de ms de 20 leucocitos degenerados = Se observan numerosos leucocitos en racimos.

Racimos de leucocitos y numerosos leucocitos degenerados = Campo lleno de leucocitos.

206

Levaduras
No se deben confundir con eritrocitos. Se observan ocasionalmente en muestras de orina que contienen glucosa. Se debe verificar que la orina sea fresca (antes de que transcurran 2 horas desde la miccin). Se observan con las siguientes caractersticas: Tamao: 5 - 12 m. Forma: Cuerpos redondeados de varios tamaos, a veces se les observa en gemacin (brote).

d. Trichomonas
De gran movilidad en la orina fresca. Se observa: Tamao: 15 m. Forma: Redonda, globular. Membrana ondulante: Lateral. Flagelos: 4 flagelos.

e. Espermatozoides
Se encuentran ocasionalmente en la orina de los hombres. Se observa: Cabeza: Muy pequea, 5 m Flagelo: Largo y flexible, 50 m. Movilidad: Mviles en la orina muy fresca.

207

f.

Clulas epiteliales

CLULAS ESCAMOSAS

EPITELIALES

Provienen de la descamacin, es decir, del desprendimiento de clulas del epitelio de los conductos y rganos urinarios. Se originan en el urter o en la vejiga. Son grandes y de formas rectangulares.

CLULAS DE URINARIA

LA

VEJIGA

Voluminosas, de forma de rombo y su ncleo se observa ntido.

CLULAS RENAL

DE

LA

PELVIS

De tamao mediano, granulosas, terminan en una prolongacin que asemeja una cola corta.

208

CLULAS DEL PELVIS RENAL

URTER

Son ovales, de tamao mediano, con ncleos visibles. Si son abundantes y se encuentran junto con leucocitos y filamentos, es probable que provengan del urter. Si son escasas y no se acompaan de leucocitos pueden ser clulas de la pelvis renal.

CLULAS RENALES
Son pequeas, granulosas y de ncleo visible. Casi siempre se encuentran junto con las protenas urinarias.

g. Cilindros
Tienen aspecto de cilindro y son alargados. Cruzan casi todo el campo microscpico cuando se examinan con el objetivo de 40x. Se forman durante las enfermedades de los tbulos renales, que se pueden llenar de sangre, de otras clulas y de depsitos de sustancias qumicas. Existen difrentes tipos de cilindros:

CILINDROS HIALINOS
Se encuentran en individuos sanos despus de esfuerzos musculares intensos. Son transparentes y refractan la luz. Sus extremos son redondeados o delgados.

209

CILINDROS GRANULOSOS
Provienen de clulas epiteliales degeneradas de los tbulos renales. Estos cilindros son cortos, llenos de grnulos voluminosos, de color amarillo y extremos redondeados.

CILINDROS FINOS

DE

GRNULOS

Sus grnulos son ms pequeos y no llenan completamente el cilindro. No se debe confundir con los hialinos (H) que se hallan parcialmente cubiertos por cristales amorfos de fosfatos.

CILINDROS SANGUNEOS
Los cilindros se encuentran llenos de eritrocito s ms o menos degenerados, de color castao.

CILINDROS DE (LEUCOCITARIO)

PUS

Los verdaderos cilindros de pus se llenan completamente de leucocitos (a). Los cilindros hialino s pueden contener algunos leucocitos (b).

210

CILINDROS DE EPITELIALES

CLULAS

Los cilindros se encuentran llenos de clulas epiteliales de color amarillo plido.

CILINDROS (GRASOS)

GRASOSOS

Son raros de encontrar, se observan en caso de enfermedades renales graves. De color amarillento, bordes festoneados, extremos redondeados.

h. Cristales

Los cristales pueden tener las siguientes formas: Formas geomtricas uniformes (a). Formas amorfas, que consisten en acumulaciones de grnulos pequeos sin forma definida (b).

211

SEDIMENTOS NORMALES DE CRISTALES

OXALATO CIDA)

CLCICO

(EN

ORINA

Asemejan sobres de correo o de man. Tamao: 10 - 20 m o 50 m.

CIDO RICO (EN ORINA CIDA) Asemejan formas de cuadros, rombos, cubos o "rosas". Tamao: 30 - 150 m. Color: Amarillo o rojo pardo.

FOSFATOS

TRIPLES

(EN

ORINA

NEUTRA O ALCALlNA) De forma rectangular o semejante a hojas de helecho o estrella. Tamao: 30 - 150 m. Color: Incoloro, refractan la luz.

URATOS (EN ORINA ALCALlNA) Asemejan cactus o grupos de agujas, frecuentemente se encuentran junto con los fosfatos. Tamao: 20 m. Color: Amarillo, refractan la luz.

212

BILIRRUBINA Es muy raro de hallarla Forma: Muy pequeos, de forma cuadrada, esfricos o en agujas. Tamao: 5m. Color: Castao.

SULFONAMIDAS (EN ORINA NEUTRA O CIDA) Se observa en pacientes que estn siendo tratados con sulfonamidas. Se debe notificar la existencia de estos cristales, ya que pueden causar lesiones renales. Forma: De formas variadas (ruedas o agujas).

i.

Sustancias extraas
Sustancias extraas que se encuentran en el sedimento cuando: Se usan recipientes o portaobjetos sucios. Las muestras de orina se dejan expuestas al aire.

Entre dichas sustancias tenemos: Gotas pequeas de aceite (refractan la luz) (a). Grnulos de almidn (se tien de negro azulado) (b). Granos de polen (c). Pelos (d). Fibras de algodn (e). Burbujas (f).

213

MATERIALES

Una centrfuga elctrica o manual. Un tubo cnico de 15 ml para centrifugacin. Una pipeta Pasteur, calibrada para que suministre 50 gotas por cada ml. Un portaobjetos y cubreobjetos 20 x 20 mm.

PROCEDIMIENTO

l.

Mezclar la orina.

2. Verter la orina en un tubo para


centrifugar hasta llenar 3/4 partes de su capacidad.

3.

Centrifugar a 2 500 RPM (revoluciones por minuto) durante 5 minutos.

214

CRISTALES FRECUENTES

MENOS

Fosfato clcico (en orina neutra o alcalina) De forma estrellada. Tamao: 30 - 40 m. Color: Incoloro.

Carbonato clcico (en orina neutra o alcalina) Agrupados en pares, asemejan granos de maz Tamao: Pequeos. Color: Incoloro.

Sulfato clcico (en orina cida) Forma de prismas alargados separados o formando haces. Tamao: 50 - 100 m.

CRISTALES AMORFOS

FOSFATOS AMORFOS (EN ORINA ALCALlNA)

Grnulos pequeos, Blanquecinos.

dispersos.

215

URATOS AMORFOS (EN ORINA CIDA)

Grnulos muy pequeos, de color amarillento, agrupados en racimos compactos. En la orina que se ha conservado en el frigorfico se suelen encontrar gruesos precipitados de uratos.

OTROS SEDIMENTOS CRISTALES

DE

CISTINA (EN ORINA CIDA)

Se encuentran en la (enfermedad hereditaria). Tamao: 30 - 60 m. Color: Incoloras.

cistinuria

Forma: Laminillas hexagonales.

COLESTEROL (EN ORINA CIDA) Forma: Laminillas cuadradas con

escotaduras en un lado. Tamao: 50 - 100 m. Color: Incoloras.

216

4.

Verter el sobrenadante de la orina centrifugada, invirtiendo el tubo en un vaso para anlisis (no sacudir el tubo).

5.

Agitar el tubo para que el sedimento forme nuevamente suspensin. Extraer algunas gotas de esta suspensin con una pipeta.

6. Colocar una gota de la suspensin


en un portaobjetos y cubrirlo con el cubreobjetos. No olvidar numerar el portaobjetos con el nmero que contiene la muestra.

7.

Examinar inmediatamente microscopio:

con

el

Primero, examinar con el objetivo 10x. Luego, examinar con el objetivo 40x. No usar filtro de color.

217

GRAVEDAD ESPECFICA Y PH DE LA ORINA

MEDICIN DE LA GRAVEDAD ESPECFICA

PRINCIPIOS GENERALES
La gravedad especfica de la orina vara de acuerdo con el funcionamiento de los riones, correspondiendo: Gravedad especfica elevada Gravedad especfica baja = = Orina concentrada. Orina diluida.

La gravedad especfica se mide por medio de un urinmetro calibrado de 1 000 a 1 060.

La temperatura de la orina tambin se debe medir para calcular correctamente la gravedad especfica.

MATERIALES

Un urinmetro. Un termmetro de 0 - 50C. Una probeta de 50 ml. Muestra de orina. Se necesita por lo menos 40 ml.

218

MTODO

l.

Verter 40 ml de orina en la probeta.

2.

Descender suavemente el urinmetro en la orina, y soltado.

3.

Esperar a que el urinmetro se detenga. El urinmetro no debe tocar paredes ni el fondo de la probeta.

4. Leer la gravedad especfica, que


indica la escala del urinmetro en la superficie de la orina, es decir, el punto inferior del menisco.

5.

Retirar el urinmetro. Medir la temperatura de la orina inmediatamente con el termmetro.

LECTURA Y RESULTADOS
Tomar nota de:

La temperatura medida en la orina. La temperatura a que se encuentra calibrado el urinmetro. sta es habitualmente 20C.

219

A la gravedad especfica medida:

Agregar 0,001 por cada 3C que mida la temperatura de la orina por arriba de la temperatura de calibracin del urinmetro. Restar 0,00 1 por cada 3C que tenga la orina por debajo de la temperatura de calibracin del urinmetro.

Ejemplo La temperatura de la orina es de 26 C. La temperatura del urinmetro calibrado es de 20C. La gravedad especfica medida es de 1,021. Entonces: La temperatura de la orina es 6C mayor que la temperatura de calibracin del urinmetro.

Agregar a la gravedad especfica: 6/3 x 0,001 = 2 x 0,00 1 = 0,002

La gravedad especfica real es: 1,021 + 0,002 = 1,023

Los resultados son: Gravedad especfica normal 1,020 (variacin normal: 1,010 Gravedad especfica baja Menos de 1,0 10 (en casos de transtornos renales, endocrinos. Carece de importancia si el paciente ha ingerido una gran cantidad de lquidos antes de la prueba). Gravedad especfica elevada Superior a 1,025 (en casos de prdidas de glucosa y protenas por la orina).

1,025).

220

MEDICIN DEL pH

PRINCIPIOS GENERALES
La orina normal tiene una reaccin ligeramente cida, con un pH de 6,0 aproximadamente.

En ciertas enfermedades el pH de la orina puede aumentar o disminuir.

Una manera prctica y rpida de determinar el pH es sumergir en la orina piezas de papel indicador de colores. El color cambia segn el pH. Este papel indicador se compara con un cuadro estandarizado testigo en el que figuran las cifras correspondientes.

MATERIALES

Muestra de orina fresca (recin eliminada). Una pinza. Papeles indicadores de tipo universal, para medir pH en intervalos de 1 a 10. Papeles indicadores de graduacin limitada para intervalos de 5,0 7,0 Y 6,0 8,0.

MTODO

l.

Tomar con la pinza la tira de papel indicador de tipo universal, el cual se sumerge 0,5 cm en la orina y se observa su color.

221

2.

Comparar el color que se ha producido con los que figuran en el cuadro estandarizado. Vea la cifra del pH en la unidad cuyo color corresponda ms estrechamente al de la tira de papel.

3.

Segn el resultado obtenido repetir el paso 1 con una tira de papel indicador de graduacin limitada.

Ejemplo: Para pH 6: Usar el papel indicador con intervalo de 5,0 - 7,0 Para pH 8: Usar el papel indicador con intervalo de 6,0 - 8,0.

4. Comparar el color producido con los


que figuren en el cuadro estandarizado del papel indicador de graduacin limitada.

RESULTADOS

pH normal Aproximadamente 6,0 (lmite del intervalo normal, de 5,0 a 7,0 durante el da).

pH cido 4,5 - 5,5 (casos de diabetes, fatiga muscular, acidosis, etc.).

pH alcalino 7,8 - 8,0 (en casos de infeccin urinaria, alimentacin vegetariana, etc.).

222

USO DE TABLETAS Y TIRAS REACTIVAS EN LOS EXMENES DE ORINA

PRINCIPIOS GENERALES

Son productos comerciales, y su presentacin puede ser: Tiras de papel reactivas que se sumergen en la orina. Tabletas sobre las cuales se depositan gotas de orina. Tabletas que se ponen en contacto con la orina.

Si el resultado es positivo, hay un cambio de color en las tiras y las tabletas.

Las ventajas de este mtodo son: Fciles y rpidos de usar. No requiere de utensilios de vidrio, balanzas o sustancias qumicas.

Las desventajas de este mtodo son: El costo de estos reactivos es alto. En ciertos casos son poco estables y no reaccionan.

223

Cuando el resultado es positivo hay un cambio de color, dependiendo del reactivo impregnado en la tira o tableta.

En todos los casos, sea con tiras o tabletas, se deben poner en contacto con la orina, sumergiendo las tiras o colocando gotas en las tabletas.

TABLETAS Y TIRAS REACTIVAS

a. Deteccin de glucosa
Las tiras estn impregnadas con glucosa oxidasa y reactivos de color. Si el resultado es positivo se forma en el papel un color violeta azulado. Se puede usar para confirmar un resultado dbilmente positivo que se haya obtenido por medio de mtodos que no sean especficos.

b. Deteccin de protenas
Las tiras estn impregnadas con azul de tetrabromofenol. Si el resultado es positivo se forma en el papel un color verde amarillento (huellas de protenas) o verde azulado (fuertemente positivo). Algunos son demasiado sensibles y pueden dar resultados dbilmente positivos que son falsos.

c. Deteccin de sustancias cetnicas


Las tiras estn impregnadas de pentacianonitrosilferrato (2-) s6dico o nitroprusiato s6dico. En caso de usar tabletas, sta se coloca en un recipiente y se agrega una gota de orina en la tableta. Si el resultado es positivo, se forma un color violeta en menos de 30 segundos.

224

d. Deteccin de pigmentos biliares


Las tiras estn impregnadas a base de 2-4 dic1oroanilina diazotada. Si el resultado es positivo a la presencia de bilirrubina, adquiere un color caf.

e. Deteccin de urobilingeno
Las tiras estn impregnadas del p-dimetilaminobenzaldehdo. El resultado positivo produce un color rojo.

225

PRUEBA DEL EMBARAZO

PRINCIPIOS GENERALES
La prueba del embarazo se basa en la presencia de gonadotrofina corinica humana (HCG) en la orina de la mujer embarazada.

Actualmente se dispone de preparados comerciales para detectar la HCG urinaria, que resultan ms rpidos y econmicos.

Con este tipo de prueba en general, los resultados positivos se observan a partir de 15 das despus de que ha existido retraso en el perodo menstrual.

Las muestras de orina se deben obtener en un frasco limpio, bien enjuagado. Si quedan huellas de un detergente, puede causar un resultado falso.

MATERIALES

Reactivo comercial para llevar a cabo la prueba. Un tubo de ensayo o un portaobjetos.

226

MTODOS

MTODO DEL TUBO DE ENSAYO

l.

Seguir las instrucciones del fabricante.

2.

Resultados Resultado positivo: Se observa un anillo uniforme de color rojo pardo, en el fondo del tubo. Resultado negativo: No se forma anillo. El lquido contina siendo homogneo

MTODO DEL PORTAOBJETOS

l.

Uno de los re activos usados se compone principalmente de una suspensin de partculas de ltex. Seguir las instrucciones del fabricante. Resultados a. Resultado negativo: Las partculas de ltex se aglutinan sobre el portaobjetos. b. Resultado positivo: No se produce aglutinacin (lo impide la HCG que se encuentra en la orina de la mujer embarazada).

2. 3.

227

CAPITULO VI

PARASITOLOGA
OBTENCIN DE HECES ............................. 239 Principios generales ............................. 239 RECIPIENTES PARA HECES ..................... 241 Materiales............................................. 241 Mtodo de obtencin ............................ 242 PROCEDIMIENTOS DE DIAGNSTICO EN PARASITOLOGA........................................ 245 GUA DE IDENTIFICACIN2....................... 245 HELMINTOS ADULTOSQUE SE ENCUENTRAN EN HECES.......................... 246 Helmintos redondos frecuentes ............ 246 Tenias o helmintos planos segmentados ........................................ 247 Otros heimintos .................................... 250 HUEVOS Y LARVAS DE PARASITOS INTESTINALES ............................................ 251 Principios generales ............................. 251 Caractersticas de los huevos .............. 252 AMEBAS, FLAGELADOS Y CILlADOS: FORMAS MVILES...................................... 258 Principios generales ............................. 258 Amebas ................................................ 259 Flagetados............................................ 260 Ciliados................................................. 261 AMEBAS, FLAGELADOS Y CILlADOS: FORMAS QUSTICAS .................................. 262 Principios generales ............................. 262 Quistes de amebas............................... 263 Quistes de flagelados y ciliados ........... 264 EXAMEN DIRECTO DE HECES .................. 265 Principios generales...................................... 265 EXAMEN DE TINCIN CON YODO Y CON SOLUCIN SALINA O CLORURO DE SODIO .................................................... 266 Materiales............................................. 266 Mtodo ................................................. 266 EXAMEN DE HUEVOS DE OXIUROS269 MTODO DE LA CINTA ADHESIVA ............ 269 Principios generales ............................. 269 Materiales............................................. 269 Mtodo ..................................................269 MTODO DE CONCENTRACIN DE PARSITOS..................................................270 Principios generales..............................270 Mtodo de flotacin de Faust................270 Mtodo de sedimentacin de Ritchie ....272 EXAMEN DIRECTO DE TRICOMONAS EN SECRECIONES GENITOURINARIAS..........275 Principios generales..............................275 Materiales .............................................275 Mtodo ..................................................275 EXAMEN DE GOTA GRUESA Y FROTIS PARA LA IDENTIFICACIN DE PLASMODIUM..............................................277 Principios generales..............................277 Coloracin de la gota gruesa y frotis.....278 Examen microscpico del plasmodium .282 Principios generales..............................283 Frotis .....................................................284 Gota gruesa ..........................................286 Determinacin de la densidad parasitaria .............................................289 OBTENCIN DE MUESTRAS PARA DIAGNSTICO DE LEISHMANIASIS ..........293 Muestra de cuerpos fluidos (linfa) .........293 Muestra de frotis ...................................294 Muestra de tejido (biopsia)....................296 EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO EN EL DIAGNSTICO DE LEISHMANIASIS TEGUMENTARIA..........................................298 Principios generales..............................298 Procesamiento e identificacin del parsito ...........................................299 EXAMEN QUMICO PARA ENCONTRAR SANGRE OCULTA EN LAS HECES.............306 Principios generales..............................306 Materiales y reactivos ...........................306 Mtodo ..................................................306 Precauciones en el laboratorio..............308 Precauciones para el paciente..............308

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OBTENCIN DE HECES

PRINCIPIOS GENERALES

Cada muestra debe contener, por lo menos 4 mI (4 cm3). Esta es necesaria para facilitar la deteccin de los parsitos cuando se encuentran poco concentrados.

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230

RECIPIENTES PARA HECES

Los recipientes apropiados son: Una caja de cartn encerado. Un envase de material plstico. Un frasco de vidrio transparente, de boca ancha con o sin una cucharilla fija en la tapa.

Para el examen bacteriolgico el recipiente debe estar estril.

MATERIALES

Recipientes indicados segn el examen solicitado. Hisopo rectal estril si el examen solicitado es bacteriolgico y el paciente tiene problemas en la recoleccin o, se trata de un nio pequeo.

Para la obtencin de huevos de oxiuros se necesita:

Una cinta adhesiva (engomada) transparente de 12 cm de largo por 1 cm de ancho. Un bajalengua. Una lmina portaobjetos.

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MTODO DE OBTENCIN

a. Examen parasitolgico
Usar un recipiente limpio para obtener la muestra.

OBTENCIN DE HUEVOS DE OXIUROS (TEST DE GRAHAM)

1.

Pegar la cinta adhesiva en la lmina portaobjeto, dejando que sobresalgan ambos extremos de la cinta.

2. Colocar el lado plano del bajalengua


debajo del portaobjeto.

3.

Separar la cinta adhesiva del portaobjeto con suavidad y doblarla sobre el extremo del mango del bajalengua, de tal modo que la parte pegante quede hacia fuera.

232

4.

Sostener el extremo formado (bajalengua y la cinta adhesiva) con la mano derecha, presione firmemente el portaobjeto contra el mango del bajalengua.

5. Separar con la mano izquierda las


nalgas del paciente. Aplicar presionando el extremo del bajalengua cubierto con la cinta adhesiva, en varios sitios de la piel que rodea al ano.

6.

Colocar de nuevo la cinta adhesiva sobre el portaobjeto, con el lado adhesivo hacia abajo. Para estar seguro que la cinta se adhiere uniformemente y no se forme burbujas de aire, presionar el portaobjeto con un trozo de algodn.

b. Examen bacteriolgico

Usar un recipiente estril para obtener la muestra.

Debe recolectarse antes de la administracin de cualquier antibitico.

233

Se prefiere una muestra ms que un hisopado rectal.

En el caso de nios u otros pacientes que tengan problemas en la recoleccin de muestra, obtenerla directamente, introduciendo en el recto un hisopo previamente embebido en el espesor del medio de transporte que se va usar y luego se introduce en el recto. Una vez que est dentro del recto (alrededor de 3 cm), aplicar un movimiento de rotacin amplio al hisopo para arrastrar mucosidad de la pared de la ampolla rectal y luego un movimiento circular pequeo para arrastrar deposicin.

MTODO

l.

Colocar el hisopo con la muestra en un tubo estril o en el tercio superior del tubo con medio de transporte.

2.

Cortar la porcin sobrante del palo del hisopo y ajustar fuertemente la tapa del tubo.

234

PROCEDIMIENTOS DE DIAGNSTICO EN PARASITOLOGA

GUA DE IDENTIFICACIN

La parasitologa mdica es el estudio de los parsitos que causan enfermedades al ser humano.

En el laboratorio se pueden llevar a cabo exmenes de:

Helmintos (gusanos) Que se observan a simple vista.

Huevos o larvas de helmintos Que son visibles por medio del microscopio.

Protozoarios (organismos unicelulares) Formas vegetativas:


Presentan movilidad.

Formas qusticas:
Carecen de movilidad.

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HELMINTOS ADULTOS QUE SE ENCUENTRAN EN HECES

Los helmintos adultos, que son llevados al laboratorio para ser identificados, se pueden haber recogido de las heces, la ropa personal o de la cama, o durante una operacin quirrgica.

Se debe anotar: Su longitud. Su forma.

HELMINTOS REDONDOS FRECUENTES

a. scaris
Helmintos redondos grandes. Color: Rosceo. Grosor: 0,3 - 0,5 cm. Longitud: Macho: 15 cm (con cola en forma de bucle). Hembra: 20 25 cm (con cola recta).

b. Oxiuros
Frecuente en heces de nios. Tambin se pueden hallar en los pliegues de la piel que rodea el ano. Helmintos redondos pequeos. Color: Blanco. Longitud: Macho: 0,5 cm. Hembra: 1 cm (de cola puntiaguda).

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TENIAS O HELMINTOS PLANOS SEGMENTADOS

a. Tenias
Color: Marfil o azul plido. Longitud: 3 - 10m (para el examen por lo general llegan los segmentos maduros separados, de longitud variable).

b. Tenias frecuentes

237

c. Examen de tenias

l.

Examinar una cadena de segmentos para observar el orden de los poros laterales.

238

2.

Examinar un solo segmento aplanado suavemente entre dos portaobjetos.

3. Sostener el portaobjetos contra la


luz,
observar y contar las ramificaciones uterinas a simple vista.

4.

Para examinar el esclex o cabeza, seguir los siguientes pasos:

Colocar todo el helminto en una placa Petri o en un plato lleno de agua. Por medio de una pinza trasladar el helminto poco a poco a otro plato, desenrollarlo comenzando por el extremo ms grueso.

Si al final de la porcin ms delgada (cuello), se observa un ensanchamiento del tamao de un alfiler (esclex o cabeza), examinar con una lupa o microscopio.

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OTROS HELMINTOS

a. Ancylostoma

Pequeo helminto redondo, parecido a un oxiuro (semejante a un trozo de hilo). La cabeza se examina con el microscopio. Longitud: 1 - 1,5 cm. Color: Blanco o rojo si contiene sangre.

a. Ancylostoma duodenale Presenta una cpsula bucal que muestra dos dientes fusionados.

b. Nector americanus En lugar de dientes, tiene un par de placas semilunares en las superficies ventral y dorsal de la cpsula bucal.

b. Tricocfalo (Trichuris trichiura)

Semejante a un pequeo ltigo. La tercera parte de su cuerpo es gruesa y el resto es filiforme. Se encuentra en la pared del recto o en el ciego. Longitud: 3 - 5 cm. Color: Blanco.

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HUEVOS Y LARVAS DE PARASITOS INTESTINALES

PRINCIPIOS GENERALES

Los huevos de parsitos intestinales se identifican por su: Tamao. Envoltura. Forma. Contenido.

El tamao de los huevos se puede determinar adaptando una regla micromtrica al ocular del microscopio.

Entre las estructuras que se pueden confundir con huevos de parsitos tenemos:

Grnulos de almidn de origen vegetal que son residuos de alimentos, como la papa, la yuca, etc. (a). Fibras de carne digerida (b). Jabones (c). Burbujas y gotas de grasa (d). Pelos vegetales (e). Granos de polen y esporas de Hongos (f).

241

CARACTERSTICAS DE LOS HUEVOS

a. Ancylostoma duodenale

Tamao: 50 - 60 m. Forma: Oval, con polos o extremos redondos y ligeramente aplanados. Envoltura: Delgada, se observa como una lnea oscura. Color: Las clulas que hay en su interior son gris plido. Contenido: Vara segn el grado de maduracin: Heces frescas: Se observa 4, 8 16 clulas granulosas. Heces de menos de 12 horas: Masa uniforme compuesta por numerosas clulas granulosas. Heces de 12 a 48 horas: El huevo se encuentra Lleno por una larva enrollada sobre s misma, se llama "huevo embrionario".

b. Nector americanus

Los huevecillos son semejantes a los de Ancylostoma, pero un poco ms largos y estrechos de 30 x 40 m a 64 x 76 m.

242

c. scaris lumbricoides

Existen cuatro tipos de huevos de scaris:

HUEVOS FECUNDADOS, CON ENVOLTURA DOBLE

Tamao: Aproximadamente 70 m. Forma: Oval o redonda. Envoltura: Tiene dos envolturas: Envoltura externa, que es spera, parda, cubierta de pequeas protuberancias (mamelonada). Envoltura interna, que es lisa, gruesa, sin color. Contenido: Una sola masa central, redonda y granulosa.

HUEVOS NO FECUNDADOS, CON ENVOLTURA DOBLE

Tamao: Aproximadamente 80 - 90 J1m. Forma: Alargada e irregular. Envoltura: Tiene dos envolturas: Envoltura externa, que es parda y con protuberancia. Envoltura interna, que es muy delgada, a veces se observa dos lneas. Contenido: Se encuentra lleno de grnulos brillantes, voluminosos y redondos.

243

HUEVOS SEMIDECORTICADOS, FECUNDADOS

Envoltura: Carecen de envoltura externa. Tienen envoltura nica lisa, gruesa, de color amarillo plido. Contenido: Una sola masa granulosa central redonda.

HUEVOS SEMIDECORTICADOS, NO FECUNDADOS

Envoltura: Una sola envoltura delgada con doble lnea. Contenido: Grnulos redondos.

lisa

voluminosos,

d. Diphyllobothrium latum

Tamao: 70 m. Forma: Oval, uniforme. Envoltura: Lisa y delgada. Contenido: Masa de clulas pequeas ordenadas alrededor de una clula central voluminosa. Color amarillo plido.

244

e. Enterobius vermicularis
Tamao: 50 - 60 m. Forma: Oval, plana de un lado y redondeada del otro lado. Envoltura: Lisa y delgada, a veces se observa doble lnea. Contenido: Masa granulosa pequea, oval e irregular. Se puede observar en otros casos el embrin (pequea larva enrollada).

f.

Fasciola heptica
Tamao: 130 m. Forma: Oval con polos redondeados. Color: Amarillo o pardo oscuro. Envoltura: Lisa, con doble lnea. Contenido: Una masa de clulas voluminosas granulosas. Otras caractersticas: Presenta oprculo (O) en uno de los polos; en esta regin la envoltura es irregular. En el polo contrario hay engrosamiento (E) de la envoltura.

g. Hymenolepis nana
Tamao: 40 - 45 m. Forma: Oval o redonda. Color: Gris plido. Envoltura: Presenta dos envolturas: La envoltura externa, delgada. La envoltura interna, ms gruesa en los polos, con filamentos que salen a partir de stos. Se observa grnulos entre ambas membranas. Contenido: Masa redonda que corresponde al embrin con 6 ganchos, dispuestos en forma de abanico y con grnulos en el centro.

245

h. Strongyloides stercoralis

LARVAS: De gran movilidad

Tamao: 200 - 300 m de longitud y 15 m de grosor. Cola: Delgada. Boca: Pequea. Tubo digestivo: Consta de un esfago (O) con un ensanchamiento en un extremo y un poro anal (A) en el otro extremo. Primordio genital (E): Espacio redondo, en la parte media de la larva.

HUEVOS: Se pueden hallar en heces lquidas.

Tamao: 50 m. Forma: Oval, con polos redondos y ligeramente aplanados. Color: Gris plido, la solucin de yodo los tie de pardo oscuro. Envoltura: Delgada, se observa como una lnea oscura. Contenido: Una larva gruesa, enrollada una o dos veces, algunas veces en movimiento.

246

i.

Trichuris trichiura

Tamao: 50m Forma: Alargada. Color: Envoltura anaranjada. Contenido amarillo. Envoltura: Doble, gruesa y lisa. Otras caractersticas: Presenta un tapn redondo y transparente en cada polo. Contenido: Una masa granulosa uniforme.

j.

Taenia saginata o Taenia solium

Los huevos de estos cstodos son casi idnticos. Son huevos embrionarios. Tamao: 30 - 40 m. Forma: Redonda. Color: El color de la envoltura es amarillo oscuro. El contenido es amarillo claro o gris. Envoltura: Gruesa, lisa y con lneas transversales. Contenido: Una masa granulosa con tres pares de ganchos. Saco externo: A veces el huevo se encuentra encerrado en un saco transparente, en cuyo interior flota.

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AMEBAS. FLAGELADOS Y CILIADOS: FORMAS MVILES

PRINCIPIOS GENERALES

Los protozoarios son microorganismos compuestos por una sola clula. Su forma mvil se denomina trofozoto y la forma inmvil, quiste.

Los trofozotos se encuentran principalmente en: Heces lquidas. Heces con moco. Heces blandas, no formadas.

Los trofozotos tienen movimiento debido a: Movimientos lentos de la clula. Presencia de flagelos, que semejan ltigos. Presencia de cilios, que son pelos numerosos y cortos.

Los trofozotos se clasifican en: Amebas: Sin flagelos ni cilios Flagelados: Con flagelos. Ciliados: Con cilios.

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AMEBAS

a. Entamoeba histolytica

Tamao: 12 - 35 m. Forma: En movimiento se alarga y cambia de forma; si no est en movimiento es redonda. Ncleo: Al teido con yodo se observa una membrana uniforme y un cariosoma central, pequeo y oscuro. Movilidad: Se mueve en una sola direccin ayudada por un pseudpodo que le hace avanzar. Citoplasma: El ectoplasma es transparente y el endoplasma granuloso fino en la que puede haber vacuolas. La entamoeba patgena presenta vacuolas en cuyo interior se observa glbulos rojos.

b. Entamoeba coli

Tamao: 20 - 40 m. Forma: Ovalo alargada. Ncleo: Visible en preparaciones frescas, sin tincin. La membrana es irregular y granulosa; el cariosoma es grande y excntrico. Movilidad: Frecuentemente inmvil o se desplaza con lentitud emitiendo pseudpodos. Citoplasma: Es difcil diferenciar el ectoplasma del endoplasma granuloso.

249

FLAGELADOS

a. Giardia lamblia

Tamao: 10 - 18 m. Forma: Vista frontal: Piriforme (pera). Vista lateral: Forma de cuchara. Movilidad: Se desplaza hacia delante con pequeos saltos, o bien dando giros. Contenido: Presenta dos grandes ncleos ovalados, poco visibles.

250

b. Trichomonas hominis

Tamao: 10 - 15 m. Forma: Oval con dos polos adelgazados. Ncleo: Difcil de identificar. Flagelos: Generalmente 4. Membrana ondulante: Slo se encuentra en un lado; es sumamente mvil. Movilidad: Gira y parece vibrar.

CILlADOS

a. Balantidium coli

Tamao: 50 m. Mayor que un huevo de Ascaris. Forma: Oval, con un polo ms redondo que el otro. Cilios: Cubierto por cilios pequeos, que se mueven. Ncleo: Asemeja la forma de un rin junto a otro ncleo pequeo y redondo. "Boca": Un citostoma, especie de boca que se abre y se cierra dando entrada a diversos materiales. Movilidad: Se desplaza con rapidez en una direccin, a veces se mueve en crculos.

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AMEBAS. FLAGELADOS Y CILIADOS: FORMAS QUSTICAS

PRINCIPIOS GENERALES
Los quistes son pequeas formas inmviles y resistentes de ciertos protozoarios intestinales. Pueden tener uno o varios ncleos.

Los quistes por lo general, se encuentran en heces blandas o formadas. Se pueden observar como glbulos transparentes de envolturas definidas. En la misma muestra se pueden encontrar quistes de especies diferentes.

Los quistes no deben confundirse con: Levaduras, que son pequeas (5 - 6 J.1m), con brote o yema. De color rojo pardo con solucin de yodo. En su interior se observa 3 - 6 grnulos en posicin excntrica. Leucocitos, 10 - 20 J.1m, de forma redonda o alargada, cuyo citoplasma contiene vacuolas pequeas. Pus, se observa como una masa de leucocitos degenerados, de color grisceo y no transparente como

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QUISTES DE AMEBAS

a. Entamoeba histolytica

Tamao: 12 - 15 m. Forma: Redonda. Ncleos: 1 - 4, de membrana delgada circular. Con cariosoma pequeo, compacto, semejante a un punto negro. Vacuola: Voluminosa, teida de yodo, es de color pardo rojizo. Citoplasma: Granuloso, con yodo se tie de gris amarillento. Cuerpos cromatoides: Extremos redondeados en forma de "salchicha".

b. Entamoeba coli

Tamao: 12 - 20 m. Forma: Redonda o ligeramente oval. Ncleos: 1 - 8, de membrana irregular engrosada en algunas partes, no forma un crculo perfecto. Con cariosoma voluminoso excntrico. Vacuola: Algunas veces existe una vacuola voluminosa, que comprime dos ncleos, uno en cada polo. Citoplasma Con yodo se tie de amarillo plido brillante. Cuerpos cromatoides: Extremos agudos o mellados, en forma de "cuchillo".

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QUISTES DE FLAGELADOS Y CILlADOS

a. Giardia lamblia

Tamao: 8 12 m. Forma: Oval, con un polo ms redondeado que otro. Con gruesa envoltura de doble pared. Ncleos: 2 - 4, de membrana delgada cariosoma pequeo, central. Fibrilla: Semeja un cabello; en forma de "S" que recorre el quiste a lo largo, por el centro. Citoplasma: Claro, con yodo se tie verde amarillento o azulado.

b. Balantidium coli

Tamao: 50 70 m. Forma: Redonda. Ncleos: Uno semejante a un rin y otro pequeo que asemeja una mancha gruesa. Envoltura: Delgada con pared doble. Citoplasma: Granuloso, verdoso, lleno de cuerpos de inclusin.

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EXAMEN DIRECTO DE HECES

PRINCIPIOS GENERALES
Si en el laboratorio se recibe muchas muestras en el mismo da, comenzar por examinar las ms lquidas. Examinar heces frescas de menos de una hora de eliminadas. Esto aumenta la posibilidad de encontrar amebas. Elegir, preferentemente, para el examen directo una porcin de la superficie de la muestra donde se encuentre el moco. Examinar en una solucin de cloruro de sodio u observar directamente con el microscopio cuando las heces son muy lquidas. Los trofozotos se inmovilizan en solucin de yodo y puede ser difcil diferenciar entre trofozotos y quistes. En las heces lquidas los depsitos de moco frecuentemente contienen grupos numerosos de Giardia lamblia. Si las heces se dejan expuestas al aire en un recipiente sin tapa pueden caer en ellas microorganismos de la atmsfera, como los infusorios. Estos son muy semejantes a Balantidium coli.

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EXAMEN DE TINCIN CON YODO Y CON SOLUCIN SALINA O CLORURO DE SODIO

MATERIALES

Portaobjetos o lminas. Cubreobjetos o laminillas. Aplicadores de madera. Solucin yodurada de Lugol. Solucin salina o de cloruro de sodio. Un microscopio. Lpiz de cera.

MTODO

l.

En un portaobjetos colocar Una gota de solucin salina o de cloruro de sodio, en la mitad del lado izquierdo del portaobjetos. Una gota de solucin yodurada de Lugol, en la mitad del lado derecho del portaobjetos.

2. Tomar 1 - 2 mg de material fecal (de


preferencia de la parte profunda de la muestra y si hay moco, elegir esta porcin) con el aplicador de madera.

256

3.

Mezclar la porcin tomada de la muestra con la gota de solucin salina o de cloruro de sodio.

4.

Tomar otra porcin de la muestra y mezclarla con la gota de solucin yodurada.

5. Colocar un cubreobjeto sobre cada


gota.

6.

Con el lpiz de cera marcar el nmero de la muestra en el portaobjetos.

7. Examinar las preparaciones con el


microscopio con objetivos de 10x y 40x, comenzando en el ngulo superior izquierdo del cubreobjeto.

257

8.

Observar con atencin las formas, recordando que los quistes y trofozotos de los protozoario s se observan en forma natural en el lado sin colorear (solucin salina o de cloruro de sodio).

9.

Las estructuras internas (ncleos, vacuolas, etc.) se observan en las tinciones con solucin yodurada de Lugol.

10. Suele encontrarse como elementos normales, estructuras pertenecientes a la


ingestin de alimentos, como fibras vegetales, granos de almidn, esporas de hongos, granos de polen, fibras musculares lisas o estriadas, cristales de cidos grasos, cristales de oxalato de calcio, etc.

258

EXAMEN DE HUEVOS DE OXIUROS MTODO DE LA CINTA ADHESIVA

PRINCIPIOS GENERALES
Los oxiuros (Enterobius vermiculares) afectan frecuentemente a los nios. Sus huevos se recogen de los pliegues de la piel que rodea al ano, porque raras veces se hallan en las materias fecales.

MATERIALES
Material para obtencin de huevos de oxiuros. Un microscopio. Una pipeta Pasteur. Portaobjetos. Cubreobjetos.

MTODO

l.

Obtenida la muestra por el mtodo de la cinta adhesiva, sta queda lista para mirarla al microscopio. Si la muestra es obtenida usando un hisopo de algodn aspirar la solucin de cloruro de sodio (donde ha sido sumergido el hisopo) con una pipeta de Pasteur. Colocar una gota en el portaobjeto, poner un cubreobjeto encima de la gota y queda lista para mirarla al microscopio.

2.

3. Observar

con el microscopio utilizando objetivo de 10x, en busca de los huevos de Enterobius vermiculares.

259

MTODO DE CONCENTRACIN DE PARSIT0S

PRINCIPIOS GENERALES
Antes de preparar una concentracin de parsitos se debe realizar un examen microscpico directo de las heces. El mtodo de concentracin hace posible que se detecten parsitos que estn presentes en escaso nmero. Este mtodo se basa en el peso especfico de los quistes o huevos. En este mtodo de concentracin de parsitos no se encuentran formas mviles de protozoarios. En el mtodo de concentracin, cuando se usa soluciones de baja densidad, los huevos o quistes sedimentan y cuando se usa soluciones de alta densidad, los huevos o quistes flotan.

MTODO DE FLOTACIN DE FAUST


Es una tcnica mixta de centrifugacin y flotacin que concentra quistes y huevos con la solucin de sulfato de zinc. El mtodo permite concentrar los quistes, los huevecillos y las larvas.

MATERIALES
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Portaobjetos. Cubreobjetos. Sulfato de zinc al 33,3%. Lugol. Agua corriente tibia. Aplicador de madera. Una centrfuga. Un microscopio.

260

MTODO

l.

En el tubo de ensayo mezclar, usando el aplicador. de madera, 2 g de heces con 8 - 10 ml de agua corriente tibia, centrifugar a 3 000 RPM durante 3 minutos.

2. El lquido sobrenadante obtenido en


el tubo centrifugado, se elimina. Aadir 2 - 3 ml de agua y volver a centrifugar segn el procedimiento anterior. Repetir 3 - 4 veces esta operacin hasta obtener un lquido sobrenadante claro.

3.

Se aaden 3 - 4 ml de solucin de zinc a133,3%, se centrifuga durante 2 - 5 minutos a 3 000 RPM.

4. Colocar el tubo centrifugado en una


gradilla, llenndolo con el sulfato de zinc hasta el borde del tubo y colocar encima un cubreobjetos, dejar en reposo por 15.minutos.

261

5.

Despus de los 15 minutos, sacar el cubreobjetos, levantndolo. Colocarlo en un portaobjetos con una gota de Lugol y observarlo al microscopio con objetivos de 10x y 40x.

MTODO DE SEDIMENTACIN DE RITCHIE

MATERIALES

Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Portaobjetos. Cubreobjetos. Formol al 10%. ter sulfrico comercial. Lugol. Agua corriente tibia. Un aplicador de madera. Bagueta. Una centrfuga. Un microscopio.

MTODO

l.

Lavar las heces en igual forma que en la tcnica de Faust.

262

2.

Despus del ltimo lavado, llenar hasta la mitad el tubo centrifugado, con formol al 10% Y 2 mI de ter.

3. Tapar con un tapn de jebe y sacudir


vigorosamente, teniendo que el tapn no salte. cuidado

4.

Retirar el tapn y centrifugar a 3 000 RPM por 3 minutos.

5.

Se observar que en el tubo quedan 4 capas que son, de arriba hacia abajo: el ter con las grasas disueltas, una capa de detritus, el formol y el sedimento.

6. Desprender el tapn de detritus de


las paredes del tubo, usando una bagueta y eliminar el resto de las capas, quedando en el tubo, nicamente el sedimento.

263

7.

Diluir el sedimento con el lquido sobrante que escurre por las paredes del tubo, agitndolo.

8. Poner una gota en un portaobjetos,


con una gota de lugol. Colocar encima un cubreobjetos y observar en el microscopio con objetivos de l0x y40x.

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EXAMEN DIRECTO DE TRICHOMONAS EN SECRECIONES GENITOURINARIAS

PRINCIPIOS GENERALES
La trichomona vaginalis es un protozoario que puede causar secreciones genitourinarias, principalmente en la mujer y ocasionalmente en el hombre. Esta secrecin es blanquecina o puede ser gris - verdusca y espumosa. La secrecin se debe entregar al laboratorio inmediatamente despus de haberse recogido. Es preferible colocar la muestra obtenida con un hisopo de algodn en un tubo de ensayo que contenga solucin de cloruro de sodio; de este modo las trichomonas conservan su movilidad durante varias horas.

MATERIALES

Portaobjetos. Cubreobjetos. Solucin de cloruro de sodio, tibia a 37C. Un asa de siembra. Material para obtencin de muestra. Un microscopio.

MTODO

l. 2.

Obtener la muestra. Depositar una gota de la secrecin con el asa de siembra, en un portaobjetos.

265

3.

Aadir una gota tibia de solucin de cloruro de sodio. Mezclar y poner un cubreobjetos.

4. Observar en el microscopio con


objetivo de l0x: unos organismos pequeos redondeados y transparentes, del tamao de un leucocito, que se mueven rpido dando saltos y giros.

5.

Observar en el microscopio con objetivo de 40x los cuerpos de trichomonas:

Tamao: 10 - 20 m. Forma: Redonda, globulosa. Movilidad: Giran. Flagelos: Tienen 4, semejantes a ltigos. Membrana: Ondulante, se encuentra slo en un lado y parece aleta de un pez; es muy mvil.

6.

Si no se encuentra nada en la gota que se ha examinado, preparar en otro portaobjetos un frotis amplio y delgado de la secrecin. Aplicar tincin Gram al frotis seco (buscar bacterias, podra haber gonococos).

266

EXAMEN DE GOTA GRUESA Y FROTIS PARA LA IDENTIFICACIN DE PLASMODIUM

PRINCIPIOS GENERALES

El parsito causante de la malaria o paludismo es el Plasmodium que se encuentra en la sangre.

La gota gruesa es la extensin de una gota de sangre en forma cuadrangular de un dimetro aproximado de 1 a 1,5 cm mediante la cual se puede concentrar la densidad del parsito permitiendo un examen rpido. Con la gota gruesa se puede detectar la presencia de Plasmodium, su especie y la densidad parasitaria.

El frotis sanguneo es la extensin de una gota de sangre de tal manera que se pueden observar al microscopio, tanto los eritrocito s como los parsitos en un slo plano. Con el frotis sanguneo se logra diferenciar claramente la especie de Plasmodium.

La recoleccin de sangre se debe hacer en el momento en que se presenta la fiebre (en esta etapa los parsitos son ms numerosos) y antes que se administren medicamentos antipaldicos.

Para el pronstico y el tratamiento de la enfermedad es importante que se identifique la especie en el laboratorio.

267

Existen 4 especies diferentes de parsitos que causan malaria o paludismo en el mundo: Plasmodium vivax. Plasmodium malariae. Plasmodium ovale. Plasmodium jalciparum.

En el Per slo se presentan 3 de ellas. Plasmodium ovale slo se encuentra presente en el frica.

Un paciente puede tener ms de una especie de parsitos del paludismo al mismo tiempo.

COLORACIN DE LA GOTA GRUESA Y FROTIS

La preparacin de la gota gruesa se tie inmediatamente con Giemsa diluida. Los frotis se deben primero fijar durante 2 - 3 minutos con metano!.

MATERIALES
Probetas de 10, 50 Y 100 ml. Beaker o vaso plstico de trabajo. Un agitador de vidrio. Una gradilla para portaobjetos. Un cronmetro o reloj con segundero. Un frasco gotero con metano!. Colorante Giemsa (solucin madre). Agua amortiguada puede ser reemplazada por agua de lluvia o agua hervida fra.

268

a. Mtodo para colorear de 1 a 10 lminas

l.

Utilizar la probeta de vidrio para preparar colorante de Giemsa diluido al 5% con agua amortiguada de pH 7,2 en la proporcin de 1 gota de Giemsa (solucin madre) con 1 ml de agua amortiguada (o agua de lluvia o agua hervida fra).

2. Mezclar suavemente con una varilla


de vidrio.

3.

Si slo es una lmina (gota gruesa) para colorear, se necesitar aproximadamente 1,5 ml de solucin preparada. Si se tuviera que colorear 2 lminas, se necesitar 3 gotas de solucin Giemsa (solucin madre) por cada 3 ml de agua amortiguada.

4.

Antes de colorear verificar si las claves de las lminas coincidan con las solicitudes de investigacin.

5.

Colocar las lminas a travs de dos varillas de vidrio. Cubrirlas suavemente con el colorante de Giemsa diluido. Nunca echar el colorante muy alejado de las lminas, porque pueden formarse "espumas" que dificultaran el examen microscpico.

269

6.

Dejar reposar las lminas con el colorante por 10 minutos (la experiencia le indicar el tiempo correcto para cada lmina o grupo de lminas).

7. Transcurrido el tiempo indicado de


coloracin, lavar suavemente el colorante de la lmina aadiendo un chorro suave de agua limpia.

8.

Colocar en una gradilla las lminas inclinadas, con la cara de sangre teida hacia abajo, para eliminar el exceso de agua, facilitar el secado y protegerlos del polvo.

b. Mtodo para colorear ms de 10 lminas: Coloracin en bloque

Generalmente se usa cuando se realizan muestreos hemticos masivos.

l.

Previamente se debe conocer el dimetro y capacidad del beaker o vaso plstico de trabajo para calcular la cantidad de lminas que en posicin vertical puedan ser coloreadas. Asimismo se debe conocer el volumen del colorante Giemsa diluido que se va a utilizar (calcular de acuerdo con el mtodo anterior).

270

2.

Colocar las lminas con las muestras hemticas en el beaker o vaso, en posicin vertical, de 2 en 2 y separadas por tarjetas de cartn de 2 x 3 cm de rea, de tal manera, que los lados que contengan la muestra estn hacia las caras externas y entren en contacto con el colorante. Asegurar el bloque de lminas formadas, pasndole alrededor una liga o hilo de pabilo.

3.

Preparar una cantidad suficiente de colorante de Giemsa diluido para llenar el beaker o vaso plstico.

4. Una vez que las lminas con las muestras


se hayan colocado en el beaker o vaso plstico, llenar el recipiente lentamente con el colorante de Giemsa diluido. Evitar mojar los cartones. Tapar el beaker.

5.

Dejar las lminas en el colorante por 10 minutos, lejos de la luz del sol.

6.

Transcurrido el tiempo indicado de coloracin, quitar la tapa, sacar el bloque de lminas del recipiente con colorante y enjuagarlo sumergindolo y sacndolo alternativamente en un recipiente con agua limpia, hasta que no se desprenda colorante en el enjuague. Evitar mojar los cartones.

7.

Dejar escurrir el agua del bloque. Colocarlo sobre papel toalla o papel higinico y dejarlo secar. Cuando est seco, retirar las lminas del bloque, una por una, y colocarlas en la gradilla de madera, de modo que queden inclinadas y con la gota gruesa hacia abajo, evitando que la muestra toque algo.

8.

271

EXAMEN MICROSCPICO DEL PLASMODIUM


Durante el examen microscpico se debe anotar las caractersticas de los estados del Plasmodium.

a. Trofozoto joven
Es el estado ms pequeo, presenta un ncleo o cromatina de color rojo grosella y una masa citoplasmtica tenue de color celeste. Carece de pigmento malrico. Las formas de citoplasma pueden variar desde anillos, comas, crculo. En P. vivax y P.Jalciparum se pueden presentar formas con dos ncleos.

b. Trofozoto mediano
Ms grande que el estado anterior. El citoplasma en P. vivax se puede presentar en forma de anillo, coma o fragmentado. En P.malariae el citoplasma es redondeado y compacto. En P .Jalciparum es similar, pero no es comn observarlo en sangre perifrica. A partir de este estado se observa pigmento malrico o hemozona.

c. Trofozoto adulto o maduro


El citoplasma y el ncleo son ms compactos.

d. Esquizonte presegmentado
Parecido al adulto pero con presencia de 2 a ms ncleos.

e. Esquizonte segmentado
El nmero de merozotos (cromatina rodeada de citoplasma) define la especie. El pigmento se encuentra a un lado.

f.

Gametocitos
En P. vivax y P.malariae slo se puede observar el gametocito macho o microgametocito cuyo ncleo es grande y el citoplasma muy tenue. El pigmento se ve en forma concntrica.

272

PRINCIPIOS GENERALES

GOTA GRUESA Y FROTIS

En climas hmedos y clidos, las muestras se fijan muy rpidamente, por lo tanto, deben ser coloreadas con solucin Giemsa cuanto antes, a ms tardar en un plazo de 3 das despus de obtenida la muestra, a fin de evitar la fijacin y contaminacin por hongos.

Las lminas con muestras de sangre no deben exponerse a la luz solar fuerte o estar cerca a fuentes de calor.

Las lminas con muestras de sangre deben protegerse de moscas, cucarachas y hormigas. Estas comen la sangre seca y daan la muestra.

Para cumplir con las medidas de bioseguridad y evitar posibles contagios, las muestras de sangre sern procesadas como material altamente infeccioso.

Para la conservacin y el envo de muestras, las lminas deben ser envueltas y rotuladas individualmente, con sus respectivas fichas. Luego se introducirn en una caja de cartn rotulada para enviarse al laboratorio del centro de salud.

Para el control de calidad se enviarn las muestras al centro de salud de referencia.

LMINAS TEIDAS

En todas las etapas de desarrollo las diversas partes del parsito se tien del mismo color.

La cromatina (ncleo del parsito) es generalmente redonda y se colorea de un rojo intenso.

273

El citoplasma del parsito toma diferentes formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular. Se colorea siempre de azul, aunque la tonalidad puede variar entre las especies de Plasmodium.

FROTIS

Para fines de aprendizaje de las especies de Plasmodium, etapas de desarrollo, etc.; es mejor iniciarse en la lectura del frotis.

l.

Una manera de distinguir entre las cuatro especies de malaria es ver el efecto que tiene el parsito dentro de los glbulos rojos infectados:

El tamao del glbulo rojo. Su forma, su color. Los grnulos de Schffner se pueden ver como un moteado en los glbulos rojos. El pigmento malrico.

2.

El examen de frotis de sangre no es recomendable rutinariamente, ya que requiere mayor tiempo de observacin en comparacin con la gota gruesa.

3.

El examen de frotis es recomendado en los siguientes casos:

Cuando no es posible examinar la gota gruesa por ser muy pequea. Cuando es necesaria la identificacin de la especie.

274

275

GOTA GRUESA
El examen de la gota gruesa es mejor para detectar la presencia de parsitos.

Rutinariamente, la gota gruesa debe ser examinada primero. Presenta las siguientes caractersticas:

Los glbulos rojos han desaparecido. Los grnulos de Schffner se pueden observar alrededor del parsito. Los leucocitos se conservan sin modificaciones. Los parsitos pueden ser vistos semejantes a los leucocitos, pero tienen apariencia ms pequea que en el frotis. El citoplasma de los anillos finos de los trofozotos puede aparecer incompleto o roto en las preparaciones de gota gruesa. Las granulaciones de Maurer de Plasmodium falciparum no pueden ser vistos en gota gruesa.

a. Tcnica para el examen de gota gruesa


El examen de rutina de gota gruesa est basado en el examen de 100 campos. Se reporta lmina negativa slo despus de no haber encontrado parsitos en 100 campos de la muestra de sangre. Si son encontrados parsitos debe finalizarse el examen con la identificacin de especie. Colocar la lmina entre los soportes de la platina mecnica del microscopio. Examinar la muestra con el objetivo de 7x l0x hasta localizar una zona en la que los leucocitos sean numerosos y aparezcan bien coloreados. Colocar aceite de inmersin sobre la zona localizada de la gota gruesa y cambiar el objetivo a 100x.

l.

2.

276

3.

Examinar 100 campos. Desplazar la muestra de sangre siguiendo las flechas de la figura. Usar un contador manual para contar los campos que van a ser examinados y para el recuento de parsitos. Al encontrar el parsito anotar sus caractersticas de color, aspecto, etc.

4.

5.

277

278

DETERMINACIN DE LA DENSIDAD PARASITARIA

PRINCIPIOS GENERALES
La densidad de los parsitos es el nmero de parsitos que se cuentan en cada campo microscpico.

Generalmente se determina la densidad parasitaria en la gota gruesa.

Es importante notificar la densidad de los parsitos por estados en caso de P.falciparum (estados asexuados y sexuados), los cuales se asocian a enfermedad ms grave, que algunas veces causa la muerte.

La determinacin de la densidad parasitaria es til para conocer la gravedad de a malaria y para conocer la respuesta al tratamiento antimalrico. Si el tratamiento es eficaz, la densidad parasitaria en la sangre debe disminuir progresivamente.

a. Mtodos de determinacin de la densidad parasitaria

EL SISTEMA DE CRUCES (+) O MTODO SIMPLE


Es un mtodo sencillo para determinar el nmero de parsitos en gota gruesa, usado rutinariamente.

Se observan 100 campos microscpicos, vistos con un aumento de 750x. Una muestra de gota gruesa corresponde aproximadamente a 0,2 1-11 de sangre. Por lo tanto, si encontramos 1 parsito por campo microscpico, en 11-11 tendremos (100 xl) x 5 = 500 parsitos.

Si luego de leer 100 campos microscpicos se observan menos de 40 parsitos (1 a 39) se determina el nmero exacto de parsitos.

279

Cuando se encuentra ms de 40 parsitos en 100 campos microscpicos se usa cruces, de la siguiente manera:

PARSITOS POR MICROLITRO DE SANGRE


Es un mtodo prctico y de precisin aceptable. El nmero de parsitos por microlitro de sangre en gota gruesa es contado en relacin con el nmero estndar de leucocitos (8 000). A pesar de que hay variaciones en el nmero de leucocitos entre personas sanas y enfermas, este mtodo permite una precisin aceptable. Se requiere de dos contadores: .uno para los parsitos y otro para los leucocitos. Si despus de contar 200 leucocitos, se han encontrado 10 o ms parsitos, se debe anotar los resultados en funcin del nmero de parsitos por 200 leucocitos. Ejemplo: 11 parsitos por 200 leucocitos.

280

Si despus de contar 200 leucocitos, hay 9 o menos parsitos, continuar contando hasta llegar a 500 leucocito s en su contador, luego anotar el nmero de parsitos por 500 leucocitos. Ejemplo: 7 parsitos por 500 leucocitos.

Para informar los resultados por microlitro de sangre, se debe usar la siguiente frmula:

Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 8 000 Nmero de leucocitos

Esto significa que:

Si son contados 200 leucocitos, entonces:

Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 8 000 200

Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 40

Si son contados 500 leucocitos, entonces:

Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 8 000 500

Parsitos por microlitro = Nmero de parsitos x 16

281

b. En caso de Plasmodium falciparum

Cuando la infeccin es por Plasmodium falciparum, adems de la densidad parasitaria se debe registrar las fases de desarrollo:

F = Anillos solamente. F y Fg = Anillos y gametos. Fg = Gametos solamente.

Cuando se detecta un caso positivo a Plasmodium falciparum, debe ser reportado al jefe inmediato y realizar un seguimiento o control tomando muestras como mnimo durante 7 das consecutivos. Si al paciente se le puede seguir observando por ms tiempo, se debe tomar 2 muestras semanales la segunda, tercera y cuarta semanas.

Para garantizar el diagnstico en el seguimiento o evolucin de un caso de Plasmodium falciparum, se debe observar como mnimo 300 campos microscpicos con la finalidad de observar cualquier signo de resistencia o recrudescencia (nueva aparicin de los parsitos).

En caso de seguimiento a Plasmodium falciparum, se identificar la muestra con la clave original (primera muestra), en todas las lminas que se tomen, agregndose un nmero correlativo para cada una de ellas. Ejemplo: Clave original: (150) 10 Claves de seguimiento: (150) 10 - 1, (150) 10 - 2, (150) 10 - 3, etc.

No olvidar adicionar la fecha de toma de muestra en cada muestra de sangre.

282

OBTENCIN DE MUESTRAS PARA DIAGNSTICO DE LEISHMANIASIS

Para el diagnstico de leishmaniasis se requiere de muestras de linfa, frotis de tejido, exudado y biopsias.

Las biopsias deben ser realizadas por el mdico o un personal de salud capacitado.

MUESTRA DE CUERPOS FLUIDOS (LINFA)

MATERIALES
Una jeringa de tuberculina estril (1 cc). Algodn. Alcohol al 70%. Agua oxigenada. Suero fisiolgico estril. Tubos con medio de cultivo agar sangre o NNN.

MTODO DE OBTENCIN

1.

Lavar la lesin ulcerada (rea necrtica, muerta) del paciente con agua y jabn.

283

2.

Elegir el rea decolorada de la ppula (pequeo ndulo) que se halla al margen de la lcera. Desinfectarla con alcohol al 70% yagua oxigenada.

3.

Cargar la jeringa de tuberculina con 0,2 cc de solucin salina estril.

4. Por puncin inyectar suavemente


dentro del rea elegida y enseguida aspirar el contenido inyectado.

5. Retirar la jeringa.

6.

Con 2 3 gotas del material aspirado, inocular en los tubos con medio de cultivo.

MUESTRA DE FROTIS

MATERIALES
Lminas portaobjetos limpias y desgrasadas. Un bistur con hoja 20 21 estril. Algodn y gasa estril. Alcohol al 70%.

284

MTODO DE OBTENCIN

l.

Lavar la lesin ulcerada con agua y jabn.

2. Elegir el borde de la lesin ulcerada.


Desinfectar con alcohol al 70%.

3.

Presionar con firmeza los bordes de la lesin hasta que palidezca; en el borde interno, hacer una pequea incisin con la hoja del bistur estril tratando de levantar la piel; secar la sangre con gasa y raspar el tejido.

4. Con el material obtenido en la hoja


de bistur, hacer el frotis en el portaobjetos, procurando que ste sea delgado y evitando pasar dos veces por el mismo sitio.

285

5.

Rotular el portaobjetos y dejar secar al medio ambiente.

MUESTRA DE TEJIDO (BIOPSIA)

MATERIALES
Algodn y gasa. Alcohol al 70%. Agua oxigenada. Punch de biopsia de 2 - 4 mm, estril. Bistur con hoja 20 21 estril. Pinzas estriles punta roma. Xilocana al 2%. Papel filtro. Viales. Solucin salina estril o formol.

MTODO DE OBTENCIN 1. 2.
Lavar la lesin ulcerada con agua y jabn. Elegir el borde de la lesin ulcerada. Desinfectar con alcohol al 70% yagua oxigenada. Anestesiar con 0,5 cc de xilocana el rea elegida.

3.

286

4.

Introducir el punch en el borde de la lesin y rotar varias veces con movimiento suave.

5. Retirar el punch, y con ayuda de la


pinza y la hoja de bistur, cortar la base del tejido removido por el punch.

6.

Presionar con gasa el rea donde se ha retirado el tejido, hasta que deje de sangrar. Luego cubrir la herida.

7.

Colocar la biopsia (el tejido cortado) sobre un papel filtro para absorber el exceso de sangre.

8. Introducir el tejido en un vial que


contenga solucin salina estril o formol de acuerdo con lo indicado en el examen.

287

EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO EN EL DIAGNSTICO DE LEISHMANIASIS TEGUMENTARIA

PRINCIPIOS GENERALES
La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria endmica en los valles interandinos y el llano amaznico de nuestro pas. Es transmitida por picaduras de flebotominos.

El agente causal es un protozoario parsito del gnero Leishmania, del cual se han reportado 5 especies en el Per: L. braziliensis, L. peruviana, L. guyanensis, L. amazonensis y L. lainsoni. Siendo las dos primeras las responsables de la mayora de los casos de leishmaniasis.

En nuestro pas se han descrito como forma clnica, la leishmaniasis tegumentaria ya sea cutnea (uta) o cutnea-mucosa (espundia).

EXAMEN DIRECTO

Se basa en la deteccin del parsito bajo su forma de amastigote, los cuales se encuentran dentro de los macrfagos.

Los amastigotes tienen formas redondeadas y en el citoplasma se nota el ncleo y el kinetoplasto.

La muestra se obtiene por frotis, de una puncin - aspiracin o una biopsia con la cual se puede realizar una impronta - frotis.

288

Este examen tiene una positividad que vara del 33 - 43%. A pesar de su baja positividad es de bajo costo y fcil de aplicar en sitios que cuentan como mnimo con un microscopio.

CULTIVO
Se basa en la recuperacin del parsito bajo su forma de promastigote.

La muestra se obtiene de una puncin - aspiracin o una biopsia.

PROCESAMIENTO E IDENTIFICACIN DEL PARSITO

a. Examen directo

MATERIALES
Materiales para la obtencin de muestra. Metanol absoluto. Coloracin Giemsa diluido 1 en 10 a partir de una solucin stock. Agua corriente de cao. Microscopio con objetivo de l00x. Aceite de inmersin.

MTODO

l.

Obtener la muestra de frotis o una impronta - frotis.

289

2.

Fijar las lminas que contienen el frotis o impronta-frotis cubrindolas con metanol absoluto durante 3 minutos o hasta que se haya evaporado.

3. Cubrir la lmina con coloracin


Giemsa diluida 1 en l0a partir de una solucin stock por 30 minutos.

4.

Descartar el colorante y ligeramente con agua corriente.

lavar

5.

Dejar secar la lmina a temperatura ambiente durante 10 minutos.

6. Observar la lmina a un aumento de


l00x, adicionar una gota de aceite de inmersin y examinar el frotis hasta que se visualicen los parsitos.

290

LECTURA E INTERPRETACIN DE RESULTADOS DE FROTIS


La observacin de formas amastigotes de Leishmania en los frotis indica un resultado positivo. El resultado debe informarse: Leishmaniasis (+): observacin de amastigotes de Leishmania.

b. Cultivo

CULTIVO DE BIOPSIA (TEJIDO)

MATERIALES Materiales para la obtencin de la biopsia. Papel filtro. Una jeringa o micropipeta estril. Placa Petri estril u homogenizador. Vial que contenga solucin salina ms antibiticos. Tubos con medios de cultivo NNN, USMARU o agar sangre.

MTODO

l.

Colocar la biopsia obtenida sobre un papel filtro para absorber el exceso de sangre.

2.

Enseguida, introducir la biopsia en un vial que contenga solucin salina ms antibitico por dos horas, para que el antibitico acte sobre la flora normal de la piel.

291

3.

Triturar la biopsia en un homogenizador o placa Petri estril que contenga 0,5 ml de solucin salina ms antibitico.

4. Con una jeringa o micropipeta tomar


la suspensin obtenida.

5. 6.

Inocular 0,2 ml de suspensin para cada tubo de medio de cultivo. Mantener los cultivos a una temperatura de 22C, hasta un mximo de 25C.

CULTIVO DE ASPIRADO (PUNCIN. ASPIRACIN)

MATERIALES Materiales para la obtencin del aspirado. Solucin salina ms antibiticos. Tubos con medios de cultivo NNN, USMARU o agar sangre.

MTODO

l.

Obtener la muestra (puncin - aspiracin).

por

aspirado

2.

Inocular 2 - 3 gotas del material aspirado, en cada tubo que contiene medio de cultivo.

292

3.

Mantener los tubos de cultivo a 22C, siendo la temperatura mxima de 25C.

LECTURA E INTERPRETACIN DE CULTIVOS DE BIOPSIAS O ASPIRADO l.


Los tubos deben ser revisados cada 2 das.

RESULTADOS

DE

2.

Utilizando un asa de siembra, tomar una gota del sobrenadante y observar al microscopio de luz con objetivo de l0x en bsqueda de promastigotes.

3.

Slo la observacin de formas mviles de promastigotes indica positividad de la muestra.

4.

El resultado debe informarse: Leishmaniasis (+): observacin de promastigotes de Leishmania.

c. Intradermoreaccin de Montenegro o Leishmanina

La prueba de Montenegro o Leishmanina, es una suspensin de promastigotes (antgeno) de Leishmania, colocados intradrmicamente en la superficie del antebrazo.

En los sujetos con reaccin positiva se produce una reaccin de hipersensibilidad cutnea: Se observa generalmente una zona rojiza e indurada en el sitio de la inoculacin.

Un dimetro de induracin en el sitio de la inoculacin de 5 mm o ms se considera positivo.

293

MATERIALES

Una jeringa de lec con aguja N 26 de pulgada (jeringa de tuberculina). Alcohol al 70%. Algodn. Leishmanina (antgeno) conservado en refrigeracin. Un lapicero. Una regla graduada en mm.

MTODO

l.

Tomar aspticamente 0,1 ml leishmanina con la jeringa tuberculina.

de de

2. Limpiar con alcohol el tercio medio


anterior del brazo izquierdo.

3.

Introducir intradrmicamente la aguja de la jeringa con el bisel hacia arriba, cargada con leishmanina. Lentamente introducir el antgeno formando una pequea ppula.

4.

Recomendar al paciente que no debe frotarse en el rea de aplicacin.

294

LECTURA E INTERPRETACIN

l.

A las 48 horas leer la prueba.

2.

En la zona de la inoculacin delimitar el rea de induracin con el lapicero, de la siguiente manera:

Trazar lneas con el lapicero desde uno de los bordes de la reaccin hacia el centro de la inoculacin, avanzando hasta encontrar resistencia al trazado.

Repetir el trazo de lneas siguiendo los 4 puntos cardinales.

3. Medir ahora el dimetro vertical (eje


Y) del rea indurada (ppula) con una regla.

4.

Si el dimetro es igualo superior a 5 mm se considera positivo.

295

EXAMEN QUMICO PARA ENCONTRAR SANGRE OCULTA EN LAS HECES

PRINCIPIOS GENERALES
Cuando la hemoglobina de la sangre se pone en contacto con perxido de hidrgeno se libera oxgeno. Este oxgeno liberado reacciona con aminofenazona (aminopirina) y se forma una coloracin azul.

MATERIALES Y REACTIVOS
Una centrfuga. Tubos cnicos para centrifugacin. Aplicadores. Una probeta de 20 ml. Tubos de ensayo. cido actico al 10%. Perxido de hidrgeno (solucin fresca, de 10 vol.) Etanol al 95%. Aminofenazona cristalina.

MTODO

l.

Inmediatamente antes de llevar a cabo el ensayo preparar una solucin de aminofenazona como se indica a continuacin: Poner alrededor de 0,25 g de aminofenazona en el fondo de un tubo de ensayo. Aadir 5 ml de etanol al 95%.

2.

Colocar una porcin de la muestra de heces de 4 mI (4 cm3) aproximadamente para un tubo de centrifugacin.

296

3.

Agregar 7 ml de agua destilada y mezclarla completamente.

4.

Centrifugar a baja velocidad aproximadamente durante 5 minutos, o hasta que se precipiten los slidos (se puede emplear una centrfuga manual).

5.

Decantar el lquido flotante en otro tubo de ensayo y conservarlo.

6.

Aadir al tubo de ensayo que contiene el lquido flotante, sin mezclar: 10 gotas de cido actico al 10%. 5 ml de la solucin de aminofenazona.

Para evitar que se mezclen poner la solucin de aminofenazona con una pipeta deslizndola por la pared interior del tubo de ensayo.

7.

Agregar 10 gotas de solucin de perxido de hidrgeno de 10 vol. No mezclar. Dejar reposar un minuto.

REACCIN POSITIVA

Entre las dos capas de lquido aparece una coloracin azul:

Azul plido Azul oscuro Azul negra

= = =

Reaccin positiva Reaccin positiva intensa Reaccin positiva sumamente intensa

+ + +

REACCIN NEGATIVA

No ocurre cambio alguno en el color.

297

298

CAPTULO VII

SECRECIONES
OBTENCIN DE SECRECIONES FARNGEAS................................................. 311 Materiales............................................. 311 Mtodo de obtencin ............................ 311 OBTENCIN DE SECRECIN TICA ........ 313 Materiales............................................. 313 Mtodo de obtencin ............................ 313 OBTENCIN DE SECRECIN URETRAL .. 314 Materiales............................................. 314 Mtodo de obtencin ............................ 314 OBTENCIN DE SECRECIN VAGINAL ... 316 Materiales............................................. 316 Mtodo de obtencin ............................ 316 PREPARACIN DE FROTIS........................318 Materiales .............................................318 Mtodo ..................................................319 TINCIN DE GRAM......................................321 Principios generales..............................321 Reactivos ..............................................321 Mtodo ..................................................321 Lectura ..................................................322 MICROORGANISMOS QUE SE OBSERVAN EN EL FROTIS..............................................324 Examen directo de frotis con tincin de Gram .....................................................324

299

OBTENCIN DE SECRECIONES FARNGEAS

MATERIALES
Hisopos de algodn estril en tubos de ensayo, para recolectar las muestras. Un bajalengua estril. Una mascarilla protectora. Tubo estril.

MTODO DE OBTENCIN

1.

El paciente debe permanecer sentado en la posicin ms cmoda y con la mejor iluminacin (se puede usar una linterna).

2.

Indicar al paciente que abra la boca sin sacar la lengua y que diga "Ahhh...".

3.

Mientras el paciente dice "Ahhh...", bajar las 2/3 anteriores de la lengua con el bajalengua, empleando la mano izquierda.

4.

Se deber observar las amgdalas (A), el fondo de la faringe limitada por los pilares (P) y vula (U).

300

5.

Introducir el hisopo con la mano derecha. Evitar tocar la lengua, que se encuentra cubierta de microorganismos.

6.

Ubicar el lugar inflamado de la garganta (amgdalas o pilares). Estar enrojecida o blanca, segn sea el caso.

7. Frotar el hisopo con firmeza en la


parte inflamada, hacindolo girar y, si existen membranas, recjalas con el hisopo.

8.

Si no se encuentra inflamacin pasar el hisopo por las amgdalas, los pilares. Evitar tocar la vula.

9.

Introducir el hisopo con la muestra en el tubo estril.

301

OBTENCIN DE SECRECIN TICA

MATERIALES
Hisopo de algodn no demasiado abultado. Tubo estril.

MTODO DE OBTENCIN

l.

Si el pus sale al exterior y llena el pabelln de la oreja, es preferible eliminado previamente con algodn estril.

2. Introducir el hisopo en el conducto


auditivo externo siguiendo una direccin ligeramente oblicua de atrs hacia adelante y de abajo hacia arriba.

3.

Introducir el hisopo con la muestra en el tubo estril.

302

OBTENCIN DE SECRECIN URETRAL

MATERIALES

Asa bacteriolgica estril o hisopo estril de alambre delgado y de algodn no demasiado abultado. Guantes quirrgicos estriles. Solucin salina estril. Tubo con medio de transporte.

MTODO DE OBTENCIN

l.

Tomar la muestra a primera hora de la maana, antes de que el paciente haya orinado.

2.

Limpiar el meato con algodn humedecido con solucin salina estril.

3. Aplicar al pene una ligera presin


(desde atrs), de manera que salga una gota de secrecin (pus) por el meato.

303

4.

Si la gota de pus no aparece introducir el asa o hisopo estril en el conducto uretral anterior, hasta una profundidad de 2,5 cm aproximadamente para obtener la muestra.

5.

Tomar el pus con el asa o hisopo estril e introducido en el tubo con medio de transporte.

304

OBTENCIN DE SECRECIN VAGINAL

La muestra debe ser tomada del conducto cervical por un mdico o personal de salud capacitado.

En los casos de gonorrea crnica se deber tomar inmediatamente antes o inmediatamente despus del periodo menstrual.

MATERIALES

Hisopo estril de alambre delgado y de algodn no demasiado abultado. Guantes quirrgicos estriles. Espculo estril. Tubo con medio de transporte.

MTODO DE OBTENCIN

l.

Colocar a la paciente en posicin ginecolgica.

2.

Entreabrir la vulva.

3.

Introducir un espculo humedecido en agua tibia en la vagina. No usar lubricante. Visualizar el cuello uterino.

305

4.

Introducir el hisopo estril dentro del canal cervical rotndolo suavemente y permitiendo que permanezca all por 10 - 30 segundos; retirar y colocar en un tubo estril o en un tubo con medio de transporte.

306

PREPARACIN DE FROTIS

El examen microscpico directo de frotis teidos constituye una manera eficiente para estudiar la presencia de bacterias en medios biolgicos que normalmente son estriles, como el lquido cefalorraqudeo y el lquido pleural.

Tambin se aplica a la orina centrifugada, esputo, pus y muestras que provienen del cuello del tero, vagina, bronquios, etc.

MATERIALES

ASA DE SIEMBRA
Es un alambre, con una aleacin de nquel y cromo, que por un extremo se fija a un mango que lo sostiene y por el otro extremo se dobla formando un pequeo crculo de aproximadamente 2mm.

PORTA OBJETOS
Se debe limpiar con una mezcla de etanol y ter, mediante una gasa. El portaobjetos deber estar rotulado.

MECHERO DE BUNSEN O DE ALCOHOL

307

MTODO

l.

Flamear el asa de siembra hasta que se ponga al rojo vivo, para lograrlo, colocar el asa por arriba de la porcin azul de la llama, en posicin vertical.

2.

Dejar enfriar el asa, contar hasta 20.

3. Tomar una porcin de la muestra


que se va a examinar, colocando el asa en posicin plana en la superficie del lquido.

4.

Colocar el asa sobre el portaobjetos y aplanar ligeramente en el centro de ste.

5.

Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjetos, mover trazando un espiral del centro a la periferia.

6.

Dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los cuatro lados del portaobjetos.

308

7.

Dejar secar la muestra completamente al aire.

8.

En caso de frotis para diagnstico citolgico (cuello de tero, vagina, etc.), los frotis no se deben dejar secar, pues se alterara la morfologa de las clulas. En cuanto estn listos y mientras estn hmedos todava, se fijan con alcohol absoluto y ter o laca especial en spray.

9. Flamear de nuevo el asa hasta que


est al rojo vivo para destruir las bacterias que se encuentren en ella, una vez usada.

10. Proceder

a fijar, pasando el portaobjetos tres veces a travs de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra hacia arriba. Dejado enfriar antes de aplicar la tincin.

11. Hacer la tincin de frotis fijo, se tiene la tincin de Gram, de Ziehl y Neelsen.

12. Es preferible marcar un crculo


alrededor del frotis con un lpiz graso, a fin de que se pueda ver ms fcilmente.

309

TINCIN DE GRAM

PRINCIPIOS GENERALES
La tincin Gram sirve para clasificar las bacterias en dos grupos: Bacterias grampositivas, que se tien de azul violceo oscuro. Bacterias gramnegativas, que se tien de rojo, grosella o rosado.

REACTIVOS
Solucin de cristal violeta al 1 %. Solucin de safranina. Solucin de Lugol. Alcohol acetona. Agua corriente.

MTODO

l.

Fijar el frotis por calor suave y dejarlo enfriar.

2.

Cubrir el frotis con cristal violeta al 1 %, dejando que el colorante acte por 1 minuto.

3. Enjuagar

suavemente la preparacin con agua corriente y dejarla escurrir.

310

4.

Cubrir el frotis con solucin Lugol, dejando actuar por 2 minutos.

5.

Enjuagar suavemente la preparacin con agua corriente.

6.

Cubrir el frotis con alcohol acetona por 1 minuto.

7.

Enjuagar suavemente con agua corriente.

8.

Cubrir el frotis con solucin de safranina, por 30 segundos

9.

Enjuagar suavemente con agua corriente y dejar secar la preparacin al aire libre.

LECTURA
Observar al microscopio, utilizando el lente de inmersin. Se deber buscar: Bacterias grampositivas: Se tien de azul violceo oscuro, como estaf1lococo, estreptococos neumococos enterococos, etc. Bacterias gramnegativas: Se tien de color rojo, grosella o rosado, como gonococos, vibrios, enterobacterias.

311

312

MICROORGANISMOS QUE SE OBSERVAN EN EL FROTIS

EXAMEN DIRECTO DE FROTIS CON TINCIN DE GRAM

a. Cocos grampositivos de forma redonda


Se pueden encontrar en: Racimo (estafilococo). Cadenas (estreptococos). Pares (neumococo). Grupos de 4, etc.

Se observan en muestras de pus, orina, sangre y otras.

b. Diplococos gramnegativos en pares


Se pueden encontrar: Asemejando granos de caf o arrionado. Formando racimos en el citoplasma de un leucocito.

Se observan en muestras de pus provenientes de la uretra (gonococo) y del lquido cefalorraqudeo lmeningococo). Existen otros diplococos que generalmente no son ratgenos y se observan en muestras de exudado farngeo o de esputo.

313

c. Bacilos grampositivos semejantes a bastoncillos

BACILOS GRAMPOSITIVOS CON ESPORAS


Son largos, gruesos y pueden terminar en extremos cuadrados (ntrax) o romos (ttanos).

La espora es una amplia zona incolora, en el interior del bacilo, que no se tie con la coloracin de Gram.

BACILOS GRAMPOSITIVOS SIN ESPORAS


Son pequeos y de formas variables, y los extremos pueden estar ensanchados; se agrupan en hileras o parecen formar letras.

Se observan en muestras de exudado farngeo, sangre, piel, etc. (difteria, listeria, etc.)

d. Bacilos gramnegativos

Son de tamao variable, con extremos redondeados o agudos.

Pueden ser largos y rectos (bacilos coleriformes), con forma de coma (vibrio) o cortos y gruesos (proteus).

314

e. Cocobacilos gramnegativos

Su forma es variable; no son tan redondos como los cocos, ni tan alargados como los bacilos (haemophilus).

Se pueden muestras.

encontrar

en

diversas

f.

Levaduras yactinomicetos

LEVADURAS

Son de tamao variable, aunque mayores que las bacterias, puede observarse gemacin.

Se puede observar como patgenas en exudado genital.

ACTINOMICETOS

Grnulos voluminosos que a veces pueden observarse a simple vista (su color vara entre blanco y amarillo).

El centro es gramnegativo y la periferia grampositiva. Se encuentran en muestras de pus cutneo, esputo, etc.

315

CAPITULO VIII

BACTERIOLOGA
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 329 Principios generales ............................. 329 Preparacin de los principales medios de cultivo ................................................... 330 Mtodos de siembra en medios de cultivo .............................................. 341 Mtodos................................................ 342 Lectura e Informe de una muestra cultivada ............................................... 344 UROCULTIVO .............................................. 347 Principios generales ............................. 347 Materiales............................................ 348 Mtodo ................................................. 348 Lectura e Interpretacin........................ 348 HEMOCULTIVOS ......................................... 350 Principios generales ............................. 350 Eleccin del medio para hemocultlvo ... 350 Obtencin de la muestra ...................... 351 Lectura del hemocultivo........................ 352 Microorganismos que se pueden encontrar en los hemocultlvos .............................. 353 ANTlBIOGRAMAS........................................354 Principios generales..............................354 Mtodo ..................................................354 Lectura ..................................................354 DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE GONORREA .................................................356 Principios generales..............................356 Examen directo .....................................356 Identificacin presuntiva de neisseria gonorrhoeae..........................................361 Identificacin confirmatoria de neisseria gonorrhoeae..........................................361 Informe..................................................361 DIAGNSTICO DE YERSINIA PESTlS362 Principios generales..............................362 Obtencin de muestras .........................363 Procesamiento de muestras .................365

316

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

PRINCIPIOS GENERALES
Las bacterias requieren de medios de cultivo que contengan sustancias nutritivas parecidas en lo posible al medio natural en el que viven y se reproducen. Es importante conocer la procedencia de la muestra, para escoger el medio de cultivo apropiado que permita el crecimiento del microorganismo que se necesita estudiar. Las sustancias nutritivas, que contienen los medios de cultivo son: Compuestos orgnicos nitrogenados. Compuestos inorgnicos. Sustancias energticas, etc.

Los medios de cultivo se agrupan de acuerdo con: Su estado fsico: Medio lquido. Medio slido. Medio semislido.

Los requerimientos para el diagnstico son: Medios nutritivos simples Se usa para el cultivo de la mayora de las bacterias. Ejemplo: caldo y agar nutritivo. Medios nutritivos enriquecidos Permite el crecimiento de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutritivos. Ejemplo: agar sangre y agar chocolate.

317

Medios selectivos o especiales Permiten slo el crecimiento de la especie que se desea aislar. Contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos grupos bacterianos, favoreciendo a su vez el desarrollo de otros. Ejemplo: agar Mac Conkey, agar hipertnico de Chapman, etc. Medios diferenciales Ponen de manifiesto la actividad bioqumica de un microorganismo, lo cual permite diferenciado de otro parecido. Medios para transporte Permite el transporte y la viabilidad de microorganismos. Ejemplo: el medio de Stuart es til para el transporte y conservacin de la viabilidad del gonococo hasta por 24 horas.

PREPARACIN DE LOS PRINCIPALES MEDIOS DE CULTIVO


Se debe asegurar el mximo porcentaje de sustancias nutritivas de crecimiento. Debe adaptarse la reaccin final del medio de cultivo, a un pH ptimo para los microorganismos que se van a cultivar, con errores no mayores de 0,1 de la unidad del pH requerido. No debe olvidarse que una filtracin exagerada del medio puede eliminar las sustancias nutritivas. La esterilizacin debe tener un control minucioso de la temperatura y tiempo de duracin. La prolongacin indebida en el tiempo de esterilizacin destruye las sustancias nutritivas y se produce una reduccin del volumen de los medios. Debe usarse durante la preparacin de los medios slo recipientes de cristal, de preferencia Pyrex o similares. La reparticin de los medios de cultivo se realiza siempre cerca del mechero de Bunsen (o de alcohol), en tubos o placas Petri. En los tubos se debe formar un plano inclinado y en las placas se debe tener una distribucin homognea. Los medios de cultivo contenidos en tubos se conservan mejor en refrigeracin, ya que se disminuye la evaporacin.

318

Se tiene medios inclinados en tubo y medios en placa Petri:

Medios inclinados en tubo, se emplea principalmente para resembrar cepas aisladas previamente, con la finalidad de identificarlas.

Medios en placa Petn, se emplea principalmente para permitir el crecimiento de colonias individualmente aisladas. Las placas se colocan en la estufa con la base hacia arriba.

Debe seguirse al pie de la letra las instrucciones escritas en relacin con la preparacin de medios de cultivo, debiendo usarse exclusivamente, productos qumicamente puros, a no ser que se indique lo contrario.

En casas comerciales los medios se adquieren en forma deshidratada. Se debe registrar en el recipiente del medio deshidratado la fecha de recepcin y de apertura. Entre uso y uso, se debe almacenar como se indica en la etiqueta, con escasa luz, baja humedad ambiental, y con el recipiente fuertemente tapado.

Antes de empezar a usar un nuevo lote de medios de cultivo, realizar un control de calidad del medio.

319

a. Medios nutritivos simples

CALDO NUTRITIVO

COMPOSICIN Extracto de carne Peptona Dextrosa Cloruro de sodio Agua destilada pH 0,3 g 1,0 g 0,5 g 0,5 g 100 ml 7,0 - 7,4

PREPARACIN

l.

Disolver en agua destilada los ingredientes previamente pesados.

2.

Someter a la accin del calor, agitando constantemente hasta llegar al primer hervor.

3.

Ajustar el pH con las tiras indicadoras de pH. Si est por debajo de un pH de 6,8 (cida) agregar gota a gota la solucin de NaOH, si por el contrario esta por encima de 7,4 (a1calino) agregar gota a gota la solucin de HCL hasta el pH adecuado (7,0 - 7,4).

4.

Envasar el medio en tubos y esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos.

5.

Controlar la esterilidad colocando el medio envasado en una incubadora a 37C por 24 horas.

6.

Mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo.

320

AGAR NUTRITIVO

COMPOSICIN Extracto de carne Peptona Agar Agua destilada pH final 3g 5g 15 g 1 000 ml 6.8 0,2 a 25C

PREPARACIN

l.

Disolver los ingredientes previamente pesados en 1 000 ml de agua destilada, cuidando de disolver primero el agar.

2.

Someter a la accin del calor y calentar hasta el primer hervor para que se disuelva por completo, agitando constantemente.

3.

Ajustar el pH con las tiras indicadoras de pH. Si est por debajo de un pH de 6,8 (cida) agregar gota a gota la solucin de NaOH, si por el contrario est por encima de 7,0 (alcalino) agregar gota a gota la solucin de HCL hasta el pH adecuado (6,8 - 7,0).

4.

Envasar el medio en tubos o placas de Petri y llevados a esterilizar al autoclave.

5.

Controlar la esterilidad y mantener el medio envasado en la refrigeradora hasta el momento de usarlo.

6.

El medio debe ser de color mbar claro, de transparente a ligeramente opalecente.

321

b. Medios nutritivos enriquecidos

AGAR SANGRE l.
En un frasco licuar 100 ml de agar nutritivo esteril, en bao mara a 55C.

2.

Dejar enfriar hasta alcanzar una temperatura de 45C, es decir, hasta que el calor sea soportable en el dorso de la mano.

3.

Agregar 5 ml de sangre citrada o desfibrinada de carnero con una pipeta estril. Agitar por rotacin en forma suave, con el fin de obtener una buena mezcla y evitar la formacin de burbujas.

4.

Su color normal debe ser rojo cereza homogneo.

5.

Repartir el contenido en placas Petri estriles y dejar solidificar.

6.

Controlar la esterilidad en incubadora a 37C, por 24 horas.

7.

Mantener el medio envasado en la refrigeradora.

AGAR CHOCOLATE 1.
Preparar agar sangre hasta obtener su color normal rojo cereza.

2.

Llevar el agar sangre antes de su solidificacin al bao mara a 80C por 10 minutos. Por el calentamiento, el color rojo cereza cambiar al chocolate, debido a la ruptura de los hemates y la salida de la hemoglobina.

3.

Durante el calentamiento mezclar constantemente para evitar la formacin de precipitado (grumos).

322

4.

Repartir con mucho cuidado en las placas Petri para evitar la formacin de burbujas.

5.

Otra manera de preparar agar chocolate es utilizar como base un agar de Mueller Hinton mezclado con sangre de carnero.

c. Medios selectivos o especiales

AGAR MAC CONKEY


COMPOSICIN Peptona Presreosa peptona Lactosa Sales biliares Cloruros de sodio Agar Rojo neutro Cristal violeta pH 17,0 3,0 10,0 1,5 5,0 13,5 0,03 0,001 7,1 g g g g g g g g

PREPARACIN

l.

Para rehidratar el medio se suspenden 50 gramos de agar Mac Conkey en 1 000 ml de agua destilada fra. Calentar hasta el punto de hervor para disolver el medio completamente. Esterilizar en el autoclave durante 15 minutos a 121 C. Cuando el medio se ha enfriado a 50 C, repartir en placas Petri ms o menos 20 a 25 ml por placa.

2. 3. 4.

323

AGAR SALMONELLA SIDGELLA (SS)

COMPOSICIN

Extracto de carne Proteosa peptona Lactosa Sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato sdico Citrato frrico Agar Verde brillante Rojo neutro pH

5,0 g 5,0 g 10,0 g 8,5 g 8,5 g 8,5 g 1,5 g 13,5 g 0,00033 g 0,025 g 7,0 0,1

PREPARACIN

l.

Para rehidratar el medio preparado se suspende 60 gramos de agar salmomella shiguella en 1 000 ml de agua destilada fra.

2.

Calentar hasta punto de hervor para disolverlo por completo.

3.

Repartir el medio en placas Petri, ms o menos 20 a 25 ml por placa.

324

AGAR TRIPLE AZCAR HIERRO (TSI)


COMPOSICIN

Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Proteosa peptona Lactosa Sacarosa Glucosa Sulfato ferroso Tiosulfato de sodio Agar Rojo de fenol Cloruro de sodio

3,0 3,0 15,0 5,0 10,0 10,0 1,0 0,2 0,3 15,0

g g g g g g g g g g

0,024 g 5,0 g

PREPARACIN

l.

Pesar 65 gramos de agar triple azcar hierro (TSI) para 1 000 ml de agua destilada.

2.

Calentar al fuego hasta mezclar completamente.

3.

Esterilizar a 121 C, durante 15 minutos.

4.

Repartir en tubos, de tal manera que queden con 2,5.cm de fondo y 3,5 cm de tendido (medio inclinado).

325

THA YER-MARTIN MODIFICADO

COMPOSICIN Agar Medio base para gonococos (GC) Hemoglobina Suplemento nutritivo Solucin de antibiticos Agua destilada pH final 10 g 36 g 10 g 10 ml 10 ml 1 000 ml 7,2:t 0,2 a 25C

PREPARACIN

l.

En un matraz de 250 mI colocar 125 "perlas de vidrio" (que sirven para obtener una buena mezcla) agregar los 10 gramos de hemoglobina y 125 mI de agua destilada, agitar hasta observar completa disolucin. En una probeta de 500 mI colocar un embudo de vidrio con filtro de gasa algodn - gasa (a manera de sandwich) para filtrar la solucin de hemoglobina. Completar a 500 mI con agua destilada y al final, colocar esta solucin en un matraz de 2 litros para ser esterilizada en el autoclave. En un matraz de 2 litros mezclar 36 gramos de medio de GC base y logramos de agar en 500 mI de agua destilada, calentando hasta hervir para disolver completamente. Esterilizar por separado el agar base GC y la solucin de hemoglobina en autoclave a 121C por 15 minutos. Mantener estas soluciones estriles en bao mara a la temperatura de 50 . 56C. Rehidratar el suplemento nutritivo con lquido rehidratante estril y agitar para asegurar una completa disolucin. Seguir las instrucciones del fabricante.

2.

3.

4.

5.

6.

326

7.

Rehidratar la solucin de antibiticos con agua destilada estril y dejar reposar 20 minutos. Seguir las instrucciones del fabricante. Agregar al medio base 10 ml de suplemento nutritivo y 10 ml de solucin de antibiticos, mezclando suavemente. Mezclar suavemente la solucin de hemoglobina al agar base y mantener en bao mara a la temperatura de 50 - 56C hasta el momento de repartir el medio.

8.

9.

10. Repartir en placas Petri estriles entre 15 a 20 mI por placa de 100 mm de


dimetro.

d. Medios de transporte

MEDIO DE CARY Y BLAIR


COMPOSICIN Fosfato disdico Cloruro de sodio Tioglicolato de sodio Agar Agua desrilada pH final 1,1 5,0 1,5 5,0 991 8,4 g g g g ml

327

PREPARACIN

1.

Colocar los ingredientes en un baln con el agua destilada.

2.

Calentar en bao mara hasta que la solucin est clara (no se permite que hierva).

3.

Enfriar a 50C. Agregar 9 ml de solucin de cloruro de calcio al l % recin preparada y ajustar el pH a 8,4 con NaOH 10 N gota a gota.

4.

Colocar cantidades de 5 a 7 mI en tubos con tapas de rosca (aflojado) estriles de 13 x 100 mm.

5.

Esterilizar (no en autoclave) a 100C en bao mara hirviendo durante 15 minutos. Se aprietan las tapas despus de la esterilizacin.

MEDIO TRANSGROW TG

Este medio est compuesto por agar Thayer Martin modificado al cual se le agrega bicarbonato de amonio hasta lograr una concentracin final de 0,1 %.

328

MTODOS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO


La siembra es el procedimiento por el cual se pone en contacto el microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin pueda desarrollarse y multiplicarse in vitro.

Siempre debe trabajarse cerca del mechero de B unsen para flamear la boca del tubo o la placa Petri con el medio, antes y despus de sembrar para evitar contaminaciones.

Para sembrar en placa Petri es importante que la superficie del medio este completamente seca, para conseguir esto las placas deben quedar en reposo durante 2 horas.

MATERIALES

Muestras para cultivar. Tubos y placas Petri con medios de cultivo Asas de siembra. Aguja de platino. Mechero de Bunsen.

329

MTODOS

a. Mtodo por inoculacin en medio lquido

l.

El asa de siembra debe ser esterilizada en la llama (flameada) y enfriada.

2.

Tomar con el asa de siembra una cantidad suficiente de la muestra.

3.

Introducir el asa de siembra con la muestra hasta el fondo del tubo con medio lquido, sin tocar las paredes del mismo.

b. Mtodo por estra en medio slido en tubo

l.

El asa de siembra debe ser esterilizada en la llama (flameada), y enfriada.

2.

Tomar una pequea muestra con el asa de siembra.

3.

Deslizar el asa de siembra suavemente en zigzag en el tubo con medio slido, empezando desde el fondo del tubo.

330

c. Mtodo por dispersin - agotamiento en medio slido en placa Petri

1.

El asa de siembra debe ser esterilizada a la llama (flameada), y enfriada.

2.

Tomar con el asa de siembra una cantidad suficiente de muestra.

3.

El asa debe ser sostenida suavemente entre los dedos con cuidado de no hundida en el medio.

4.

Sembrar en el medio slido en placa Petri, dividido en cuatro cuadrantes, inoculando la muestra en cantidades sucesivamente menores en cada cuadrante. Cada cuadrante presentar diferente distribucin de colonias.

d. Mtodo por puntura en medio semislido en tubo

1.

La aguja de platino debe ser esterilizada a la llama (flameada), y enfriada.

2.

Tomar con la aguja de platino (o alambre recto), una pequea cantidad de muestra.

3.

Sembrar en el agar semislido introduciendo la aguja en forma vertical. Debe tenerse cuidado en hacer que el trayecto de salida sea el mismo que el de entrada.

331

LECTURA E INFORME DE UNA MUESTRA CULTIVADA


Una vez sembrada, se rotula correctamente para identificarla y se incuba a 37C. Algunos microorganismos requieren atmsfera con un 3 - 5% de CO2 Y otros como los anaerobios que requieren una atmsfera privada de oxgeno (02). El perodo de incubacin para los microorganismos patgeno s comunes es de 18 - 24 horas, al trmino del cual los cultivos se sacan del incubador, se observa su crecimiento estudiando sus caractersticas. Entre las caractersticas de las colonias se debe detallar: Forma: Circular, elptica filamentosa, etc. Elevacin: Plana convexa, umbilicada, etc. Puntiforme Borde: Entero, ondulado, dentado, filamentoso, etc. Superficie: Lisa, rugosa, granular. Tamao: Medida del dimetro en milmetros. Consistencia: Membranosa, cremosa mucosa, etc. Pigmentacin: Amarilla, blanca, gris negra, etc. Olor: Ptrido, alcohlico, etc.

332

En ocasiones esta descripcin puede llevar al diagnstico presuntivo del gnero y especie de que se trata.

Posteriormente de una de las colonias, se debe hacer una coloracin Gram para determinar: Morfologa. Caracterstica de la tincin. Agrupacin.

El aislamiento y pureza de la cepa aislada son indispensables. Debe pasarse a distintos sus tratos para: Llegar a la identificacin por pruebas bioqumicas Realizar pruebas de sensibilidad antibitica.

333

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Para el control de calidad de los medios de cultivo: se debe probar cada lote de medio con cepas conocidas, si no se obtienen los resultados caractersticos debe desecharse el medio.

334

UROCULTIVO
PRINCIPIOS GENERALES
Los cultivos son esenciales para determinar la identidad y cantidad exacta de las bacterias y para reconocer si los microorganismos encontrados en una muestra son patgenos o inocuo s (no afectan la salud del hombre y se llaman tambin "saprofitos").

Para hacer el cultivo de la orina, llamado tambin urocultivo, el paciente no debe haber recibido antibiticos por lo menos cinco das antes del examen.

Los cultivos sirven para aislar microorganismos que se encuentran en escasa cantidad y decidir cul ser el antibitico ms efectivo en el tratamiento de la infeccin (Antibiograma).

Los cultivos bacterianos pueden ser: Medios slidos: agar en placas Petri o en tubos. Medios lquidos: tubos con caldos de cultivo.

Los microorganismos que frecuentemente se encuentran en la orina infectada: E. coli. Pseudomona aeruginosa. Enterococo. Citrobacter. Klebsiella.

Se acepta que un recuento superior de 100 000 bacterias por mi de orina, indica infeccin de las vas urinarias.

335

MATERIALES
Muestra de orina. Microscopio. Placas de agar Mac Conkey. Placas de agar sangre. Asa de siembra estndar (calibrada).

MTODO
l. Tomar la orina sin centrifugar, con el asa de siembra calibrada, es decir, que cada asada suministre 0,01 0,001 ml de orina.

2.

Sembrar la orina por dispersinagotamiento con un asa de siembra calibrada, sobre una placa de agar sangre y otra sobre una placa de agar de Mac Conkey.

3.

Rotular e incubar a 37C.

LECTURA E INTERPRETACIN
Detallar las caractersticas de las colonias en el agar Mac Conkey y el agar sangre. Seleccionar colonias del agar Mac Conkey y replicar (resembrar) en los medios de diferenciacin bioqumica (TSI, citrato, rea, etc.)

Las interpretaciones se harn de acuerdo con las reacciones bioqumicas de las enterobacterias.

336

Para conocer el nmero de microorganismos en un 1 mI de orina, se cuentan las colonias y el resultado se multiplica por 100 si se us asa de 0,01 mI o por 1 000 si se us asa de 0,001 ml.

El resultado ser el nmero de bacterias por mI de orina, considerndose:

Cuando el nmero de colonias sobrepasa el nmero de 100 000 bacterias por mI de orina, al informar no interesa precisar el nmero exacto de bacterias, slo debe informarse "ms de 100 000 bacterias por mi de orina".

337

HEMOCULTIVOS

PRINCIPIOS GENERALES
Es la prueba ms til y ms frecuentemente usada para demostrar la presencia de bacterias en la corriente sangunea.

El mtodo del hemocultivo consiste en obtener sangre con la ms rigurosa tcnica de asepsia y aadida a un frasco que contiene un medio de cultivo elegido para aislar un determinado microorganismo (bacteria).

Las muestras de sangre para hemocultivo deben obtenerse, antes que el paciente reciba terapia antimicrobiana.

Es importante obtener la muestra de sangre, en el momento en que la temperatura del paciente se encuentra elevada. Esto da una probabilidad ms elevada de tener resultados positivos en el hemocultivo.

Se requiere de un mnimo de tres hemocultivos seriados por paciente antes de considerar el caso como negativo.

ELECCIN DEL MEDIO PARA HEMOCULTIVO


La eleccin del medio depende del microorganismo que se desea aislar.

Para la mayor parte de hemocultivos, resultan satisfactorios los medios generales: Infusin corazn-cerebro con agar, este medio permite el desarrollo de bacterias tanto aerobias como anaerobias El caldo de tioglicolato, que se emplea principalmente para cultivar bacterias anaerobias

338

OBTENCIN DE LA MUESTRA

l.

Generalmente se extrae sangre del pliegue del codo, con la ms rigurosa tcnica de asepsia.

2.

Sembrar la mayor cantidad posible de sangre (entre 5 y 10 ml).

3. El medio de eleccin se calienta a


37C en una estufa de cultivo, y el tapn de caucho del frasco se flamea con alcohol para destruir los microorganismos contaminantes en su superficie.

4.

Para llevar el frasco a la cabecera del paciente se cubre el tapn con un algodn mojado de alcohol.

5.

Obtenida la muestra de sangre, se retira el algodn del frasco y la aguja de la jeringa se introduce a travs del tapn de caucho del frasco, se expulsa la sangre en el medio, se retira la aguja y se mezcla el contenido del frasco.

339

6.

Cada frasco debe rotularse: nombre del paciente, fecha y hora de obtencin de la muestra.

LECTURA DEL HEMOCULTIVO


Los frascos de hemocultivos inoculados deben inmediatamente incubarse a 35 37C.

Examinar el frasco diariamente durante la primera semana para detectar la aparicin de turbidez en el medio, hemlisis, signos de produccin de gas o crecimiento de colonias directamente encima de la sangre.

Si los hemocultivos son negativos deben seguir en observacin hasta por 21 das antes de informarse como negativos.

Los hemocultivos "visualmente positivos" (turbidez del contenido del frasco) deben teirse por el mtodo de Gram y subcultivarse (resiembras).

En los subcultivos (resiembras) se procede de la siguiente manera:

Retirar una gota del hemocultivo positivo con todas las precauciones de asepsia, utilizando una jeringa pequea, con este material se siembra. Sembrar en medios de agar sangre, y otros medios selectivos dependiendo de los resultados de la coloracin Gram. Ejemplo: Medio de agar MacConkey, para investigar la presencia de microorganismos entricos gramnegativos. Las placas deben incubarse tanto bajo condiciones aerobias como anaerobias.

340

Una vez que se han logrado colonias aisladas, debe determinarse su identificacin.

Los resultados, tanto positivos como negativos, deben comunicarse lo antes posible al mdico que lo solicit.

MICROORGANISMOS QUE SE PUEDEN ENCONTRAR EN LOS HEMOCUL TIVOS

Streptococcus viridans. Streptococcus pyogenes. Staphilococcus aureus y albus. Diplococcus pnemoniae. Neisseria meningitidis. Brucella sp. Proteus-providence. Pseudomona aeruginosa. Enterococos. Estreptococcos anaerobios. Salmonella sp. Pasteurella tularensis. Leptospira sp. Streptobacillus monilifonnis. Escherichia. Citrobacter. Klebsiella. Haemophilus influenzae.

341

ANTIBIOGRAMAS

PRINCIPIOS GENERALES
Es una prueba que se pide cotidianamente al laboratorio, a fin de seleccionar el antibitico ms eficaz en el tratamiento de una infeccin determinada. Consiste en efectuar un cultivo del microorganismo en el medio ms apropiado y despus diseminarlo en placa Petri con agar, al que se le colocan discos de papel de filtro impregnados con solucin de antibitico.

MTODO

1.

Despus de preparar las placas Petri con el medio slido (agar sangre o MullerHinton) se distribuye sobre la placa el microorganismo previamente cultivado, en forma uniforme y abundante con un asa de siembra. Espesor del agar: 4 mm, lo que equivale a: 60 ml para las placas de 150 mm de dimetro. 25 ml para las placas de 90 mm de dimetro.

2.

Colocar los discos sobre este medio slido con pinzas estriles, dejando 2 cm entre cada uno de ellos.

3.

Inmediatamente, llevar a la estufa e incubar a 37C durante 12 - 18 horas.

LECTURA
Se buscan las zonas de inhibicin (donde no crecen los microorganismos) alrededor de los discos ("halo claro") que deben ser medidas con una regla en mm, en la parte exterior y reversa de la placa.

342

Una zona de inhibicin indicar sensibilidad o resistencia del antibitico correspondiente, segn las medidas obtenidas en mm, para lo cual se usar una tabla de medidas, conforme a las instrucciones del fabricante (ver anexo).

343

DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE GONORREA

PRINCIPIOS GENERALES
Se le denomina Neisseria gonorrehoeae, diplococo gram negativo, intracelular, que adopta la forma arrionada. Es el agente etiolgico de la gonorrea, enfermedad de transmisin sexual. El perodo de incubacin de la enfermedad es de 4 - 8 das. En el hombre se manifiesta con abundante secrecin uretral mucopurulenta. En la mujer, puede no presentar sntomas. Las infecciones ms frecuentes causadas por el gonococo son: uretritis cervicitis, proctitis, salpingitis y oftalma del recin nacido, entre otras.

EXAMEN DIRECTO
El examen directo es de gran valor para el diagnstico de la gonorrea en el hombre, en la mujer su utilidad es menor, por tal razn, en ste ltimo caso, el cultivo es necesario.

MATERIALES
Obtencin de la muestra: secrecin uretral, cervical, farngea, rectal, ocular. Asa bacteriolgica estril. Hisopo de algodn estril. Lminas portaobjetos. Tincin Gram. Un microscopio. Aceite de inmersin.

344

MTODOS

l.

De las muestras obtenidas directamente con asa bacteriolgica preparar dos frotis tan finos como seaposible que abarque una buena extensin de la lmina portaobjetos.

LECTURA
Con microscopio y objetivo de inmersin (100x), los gonococos se pueden reconocer por las siguientes caractersticas: Son diplococos, se agrupan en pares, con formas que asemejan riones. Son glamnegativos. Son intracelulares, se hallan dentro de los leucocitos. A veces son exacelulares, agrupados en racimos entre leucocitos o cerca de leucocitos rotos.

345

INFORME
Resultado positivo Si se encuentran diplococos intracelulares gramnegativos agrupados en pares, con formas que asemejan riones.

Resultado sospechoso Si slo se observan diplococos gramnegativos extracelulares. Debe confmnarse con cultivo.

Resultado negativo No se observa diplococos gramnegativos.

CULTIVOS
La Neisseria gonorrhoeae se desarrolla en los siguientes medios de cultivo: Selectivos: Thayer Martn modificado. Enriquecidos: Agar chocolate con suplemento de crecimiento.

Estos cultivos exigen condiciones especiales de- anaerobiosis a pH 7,3 Y con atmsfera de 3 - 10% de CO2 y 70 - 80% de humedad. Las colonias se desarrollan en 18 - 24 horas.

MATERIALES
Obtencin de muestra de secrecin uretral, cervical, rectal, farngea, ocular. Asa bacteriolgica estril. Hisopo de algodn estril. Tubos o placas Petri conteniendo medios de Thayer Martn modificado o agar chocolate con suplemento de crecimiento. Estufa a 37C.

346

Jarra de anaerobiosis o frasco de boca ancha con tapa (tipo lata de caf, pintura u otro). Vela blanca. Gasa o algodn humedecido con agua de cao.

MTODO

SI LA MUESTRA HA SIDO TOMADA CON HISOPO

l.

Debe sembrarse directamente en la placa conteniendo el medio de Thayer Martin modificado o agar chocolate enriquecido.

2. La siembra se realiza rotando el hisopo


sobre el medio, en forma de "Z", procurando depositar toda la muestra y con el mismo hisopo diseminarla en todo el medio, por el mtodo de dispersin-agotamiento.

SI LA MUESTRA HA SIDO TOMADA DIRECTAMENTE CON EL ASA Sembrar sobre el medio de cultivo, en forma de Z y luego con la misma asa se dispersa toda la muestra, por el mtodo de dispersin agotamiento.

347

INCUBAClN DE LAS PLACAS SEMBRADAS

Debe tener un ambiente que contenga CO2 y humedad. Este ambiente se logra:

l.

Usando una jarra de anaerobiosis o frasco de boca ancha con tapa (tipo lata de caf, pintura u otro), colocar las placas sembradas (en forma invertida) en la jarra de anaerobiosis o frasco de boca ancha con tapa.

2.

En la base de la jarra o en la ltima placa se coloca sobre una lmina portaobjetos, un pedazo de vela blanca encendida, para proporcionar una atmsfera de 3 - 10% de CO2; as mismo, se coloca un pedazo de gasa o algodn humedecido con agua de cao para darle una atmsfera de 70 - 80% de humedad (Este ltimo paso se repetir todas las veces que se abra la jarra o frasco).

3.

Cerrar hermticamente la tapa de la jarra o frasco e incubar a 37C hasta por 72 horas. La vela se apaga cuando se consuma el O2.

LECTURA

Los cultivos deben examinarse cada 18 - 24 horas, hasta por 72 horas.

Se informa como resultado negativo si no hay crecimiento de colonias despus de 72 horas.

Las colonias sospechosas de gonococos, despus de 20 horas en medio de agar chocolate son pequeas (2 - 5 mm), redondas convexas, brillantes, cremosas, mucoides, con bordes uniformes. Luego se vuelven ondeadas.

En el medio selectivo de Thayer Martin modificado, las colonias gonoccicas aparecen generalmente como crecimiento selectivo.

348

IDENTIFICACIN PRESUNTIVA DE NEISSERIA GONORRHOEAE


De las colonias que aparecen en el medio selectivo Thayer Martin modificado o agar chocolate, se hace la identificacin presuntiva realizando todas estas pruebas: Coloracin gram: Demostrando los diplococos gramnegativos caractersticos en un frotis de la colonia. Prueba de oxidasa: Reaccin positiva. Prueba de superoxol: Reaccin positiva.

IDENTIFICACIN GONORRHOEAE

CONFIRMA

TORIA

DE

NEISSERIA

Se realiza a partir de las colonias con identificacin presuntiva, mediante: La prueba de utilizacin de carbohidratos, determinndose la produccin de acidez a partir de carbohidratos esterilizados: glucosa, lactosa, maltosa y sacarosa a la concentracin de 1 - 2%, contenidos en base agar cistina tripticasa.

INFORME
RESULTADO POSITIVO Si hay crecimiento de colonias con pruebas confirmatorias.

RESULTADOSOSPECHOSO Si se ha realizado las pruebas de identificacin presuntiva.

RESULTADO NEGATIVO Si no hay crecimiento de colonias despus de las 72 horas.

349

DIAGNSTICO DE YERSINIA PESTIS

PRINCIPIOS GENERALES
La peste es una infeccin bacteriana de animales y humanos causada por Yersinia pestis.

La Yersinia pestis pertenece a la familia enterobacteriaceae y es un bacilo gramnegativo aerobio, que cuenta con gran cantidad de antgenos y toxinas.

La forma clnica ms frecuente, es la linfangitis regional aguda, llamada peste bubnica caracterizada por aumento de tamao de los ndulos linfticos con dolor (reas inguinales o axilares). Algunas formas menos comunes son la septicmica y la neumnica.

El xito de los procedimientos para el diagnstico depende de una buena obtencin de la muestra y la rapidez con que las mismas lleguen al laboratorio. Se debe obtener la muestra antes de la administracin de antibiticos.

La confirmacin absoluta de un brote de peste, requiere del aislamiento e identificacin del agente etiolgico.

350

En la fase aguda de la enfermedad, hay una intermitente bacteremia (presencia del microorganismo en el torrente sanguneo), por lo que se requiere la obtencin de 4 muestras de sangre para tener mayor probabilidad de cultivo positivo. Las muestras deben tener aproximadamente 5 mI de sangre en adulto y 2,5 mI en nios.

Una vez aisladas por cultivo colonias sospechosas de Yersinia pestis, se debe enviar al laboratorio de referencia regional para su confirmacin diagnstica.

OBTENCIN DE MUESTRAS a. Aspirado de bubn

MATERIALES
Alcohol yodado. Alcohol al 70%. Algodn. Solucin salina estril. Una jeringa de 10 cc, aguja N 20. Medio de transporte Cary y Blair. Lminas portaobjetos. Fenol al 5%.

MTODO PUNCIN ASPIRACIN l.


Ubicar los bubones (axilar o inguinal) y seleccionar el que aproximadamente mida 3 cm o ms de dimetro.

2.

Desinfectar dos veces la piel del bubn con alcohol yodado, descartando el algodn cada vez, y una tercera vez con alcohol al 70%. Antes de la puncin debe haberse evaporado.

351

3.

Sosteniendo la jeringa entre el ndice y el pulgar de la mano derecha introducir la aguja en el bubn.

4. Con la mano izquierda, tirar


lentamente del mbolo de la jeringa. Deber entrar en sta, un lquido que puede ser sanguinolento, proveniente del bubn.

5.

En el caso que no entre lquido alguno en la jeringa, cargar la jeringa con 2 ml de solucin salina estril e inyectar en el bubn, empujar suavemente el mbolo con el pulgar. Imprimir a la aguja introducida en el bubn un movimiento circular, a continuacin, tirar lentamente el mbolo, para as obtener el lquido seroso.

6.

Retirar la jeringa y limpiar con alcohol al 70% el sitio de la puncin.

7.

Sostener la jeringa en posicin vertical, con la aguja hacia abajo e inocular parte del aspirado del bubn en el medio de transporte Cary y Blair. El resto del aspirado se usar para el frotis. Dejar caer una gota de la muestra contenida en la jeringa y extenderla con la misma aguja sobre una lmina portaobjetos formando una capa delgada. Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

8.

Descartar el material usado (jeringa y aguja) en fenolal5%.

352

b. rganos de pacientes fallecidos

La obtencin de rganos de paciente fallecido, con diagnstico de sospecha de peste, es de suma importancia.

En un cuerpo no refrigerado (24 - 48 horas) realizar autopsia inmediatamente, obtener muestras de hgado, bazo y tejido de ndulo linftico (bubn).

Si no se puede procesar inmediatamente, se puede guardar hasta por 6 meses en medio de transporte Cary y Blair o Thioglicolato a 4C. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 100% por cultivo el agente etiolgico, as como realizar inmunofluorescencia directa.

En un cuerpo no refrigerado (despus de 48 horas) obtener muestras de hgado, bazo y tejido de ndulo linftico (bubn) y procesar inmediatamente.

Se tiene la posibilidad de recuperar en un 20% por cultivo el agente etiolgico, as como realizar inmunofluorescencia directa.

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

MTODO

MEDIO DE AGAR SANGRE AL 6%

El medio de agar sangre al 6%, es el medio slido estndar que se usa para el cultivo de Yersinia pestis.

En caso de muestras de aspirado de bubn, esputo, rganos, sembrar directamente la muestra en el medio, la muestra se estra en la superficie del medio e incuba por 24 horas a 37C.

353

La Yersinia pestis crece como colonias translcidas blanco grisceas:

A las de 24 horas de incubacin, se observan colonias pequeas como cabeza de alfiler. Despus de una incubacin de 48 horas, las colonias miden aproximadamente 1 - 2 mm de dimetro y son blanco grisceas y ms opacas. Para su confirmacin diagnstica enviar al Laboratorio de Referencia Regional.

CALDO INFUSiN CEREBRO CORAZN (BHI)

El caldo de infusin cerebro corazn es el medio estndar usado en el laboratorio para el aislamiento primario, crecimiento y caracterizacin de Yersinia pestis.

Antes de proceder a la inoculacin de las muestras, el medio debe encontrarse a temperatura ambiente.

Realizar con el asa de siembra la inoculacin de la muestra en un tubo con tapa rosca que contenga 10 ml de caldo. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.

Crecen como pequeos cmulos de clulas en los lados y fondo del tubo; el resto del caldo permanece claro.

Para su confirmacin diagnstica enviar al Laboratorio de Referencia Regional.

354

CAPITULO IX

BIOQUMICA SANGUNEA
GLUCOSA EN SANGRE.............................. 369 Principios generales ............................. 369 Mtodo de la glucosa oxidasa .............. 369 REA EN SUERO ........................................ 371 Principios generales ............................. 371 Mtodo de Chaney y Marbach ............. 371 Tiras reactivas ...................................... 373 CREATININA EN PLASMA O EN SUERO .. 374 POTASIO (K) ................................................383 Principios generales ............................. 374 Mtodo ................................................. 374 TRANSAMINASAS EN SANGRE ................ 376 Principios generales ............................. 376 Mtodo ................................................. 376 Principios generales..............................383 Mtodo ..................................................383 FOSFATASA ALCALlNA .............................379 Principios generales..............................379 Mtodo ..................................................379 ELECTROLITOS SRICOS..........................381 SODIO (Na)...................................................381 Principios generales..............................381 Mtodo ..................................................381

355

GLUCOSA EN SANGRE

PRINCIPIOS GENERALES
La detenninacin de la glucosa (azcar) sangunea es necesaria para establecer el diagnstico de la diabetes mellitus y otras enfermedades en que existen alteraciones del metabolismo de los carbohidratos. En el mtodo de la glucosa oxidasa, el color formado en el proceso es directamente proporcional a la cantidad de glucosa sangunea que puede medirse con el espectrofotmetro. La glucosa es oxidada enzimticamente por la glucosa oxidas a a cido glucnico yagua oxigenada. La reaccin es la siguiente:
Glucosa + H20 + O2

= cido glucnico + H202

El agua oxigenada formada es separada, y el agua y el oxgeno disminuyen por una peroxidasa en presencia de un aceptor de oxgeno, que es convertido en un componente coloreado, cuya cantidad se lee con el espectrofotmetro.

MTODO DE LA GLUCOSA OXIDASA

REACTIVOS
Hidrxido de sodio 0,05 M. Sulfato de zinc a110%. Solucin de fosfato monosdico p,a. 0,5 M. Reactivo enzima-color, que una vez preparado se debe conservar en el refrigerador. Solucin estndar de glucosa de 200 mg por 100 ml de solucin saturada de cido benzoico.

356

MTODO

Preparar 3 tubos de ensayo y marcarlos de la siguiente manera: Tubo de la muestra: Tubo blanco: Tubo estndar: M. B. S.

1.

En el tubo M colocar 0,1 mI de sangre total, suero, plasma o lquido cefalorraqudeo (LCR), agregar 1 mI de hidrxido de sodio 0,05 M Y 0,1 mI de sulfato de zinc al 10%. Mezclar y centrifugar. Del sobrenadante tomar 0,2 mI Y agregar 4 mI del reactivo enzima-color. En el tubo S colocar 0,1 mI de la solucin estndar de glucosa y tratar igual que la muestra del paciente (repetir paso 1,2 Y 3). En el tubo B colocar 0,2 mI de agua destilada, agregar 4 mI del reactivo de enzima-color. Colocar los tubos a 37C en bao mara durante 10 minutos. Leer con el espectrofotmetro la absorbancia entre 430 - 500 nm (nan6metro), poniendo a cero con el tubo B. Calcular usando la siguiente frmula:

2. 3. 4.

5.

6. 7.

8.

Glucosa (mg I 100 mi) = Absorbancia de la muestra Absorbancia del estndar x 200

9.

Los valores normales son: Glucosa (mg / dl) : 70 - 115 mg / dl..

El mtodo es lineal hasta 500 mg / dl.

357

UREA EN SUERO

PRINCIPIOS GENERALES

Una de las funciones del rin es eliminar los productos de desecho no voltiles del metabolismo, entre ellos la rea y la creatinina; un aumento de las cifras de estas sustancias en suero es signo de transtorno renal.

En el mtodo de Chaney y Marbach, la rea presente en el suero es hidrolizada por la ureasa en CO2 y N~. Este ltimo reacciona luego con el fenol y el hipoclorito de sodio en medio alcalino y se produce un color azul de indofenol.

MTODO DE CHANEY Y MARBACH

REACTIVOS
Solucin ureasa. Reactivo de fenol (Reactivo 2). Reactivo de hipoclorito alcalino (Reactivo 3). Solucin testigo de urea de 60 mgll00 mI.

PROCEDIMIENTO l.
Marcar tres tubos de ensayo de 150 x 16 mm con: Testigo: Desconocido: Blanco: T. D. B.

358

3.

Agitar bien despus de cada agregado.

4.

Volver a incubar los tres tubos a la misma temperatura y durante igual tiempo.

5.

Sacar los tubos del bao mara y agregar a cada tubo 10 mI de agua destilada, mezclar.

6.

Leer en el espectrofotmetro a 525 nm, empleando la solucin blanco de reactivos para establecer el nivel cero de absorbancia.

359

7.

Calcular usando la siguiente frmula:

mg de rea por 100 ml de suero= Absorbancia del desconocido x 60 Absorbancia del testigo

8.

Los valores normales son: Suero: 20 a 40 mg / 100 ml.

9.

Se observa aumento o falso positivo por ingestin de compuestos mercurial es diurticos, tiazdicos, gentamicina, kanamicina.

10. Se puede emplear plasma recogido con oxalato, citrato, heparina o EDTA
como anticoagulante; pero no debe contener oxalato de amonio.

11. No utilizar plasma o suero preservado con fluoruro, pues esta sal inactiva la
enzima.

12. La rea es estable en suero congelado durante varios meses.

TIRAS REACTIVAS

Es una prueba enzimtica para determinar la rea en sangre.

Las tiras estn compuestas por ureasa purificada y azul de bromotimol, utilizando cromgeno como indicador.

El color vara del amarillo verdoso a tonos ms oscuros. La comparacin del color se efecta en un cuadro de valores.

360

CREATININA EN PLASMA O EN SUERO

PRINCIPIOS GENERALES
El plasma o suero se diluyen con agua destilada, y se precipitan las protenas con cido tngstico.

Se agrega a una parte del filtrado libre de protenas, picrato alcalino con el cual, la creatinina forma un complejo de color rojo que se valora con el espectrofotmetro.

MTODO

l.

Poner en un tubo de centrfuga limpio y seco lo siguiente: Plasma o suero 2,0 ml. Agua destilada 2,0 ml. Solucin tungtato de sodio al 10% 1,0 ml. cido sulfrico 0,66N 1,0 ml. Solucin de creatinina de 1 mg / 100 ml.

2.

Mezclar cuidadosamente sin sacudir.

3.

Centrifugar a 2 500 RPM durante 5 minutos. El lquido sobrenadante se usa en el paso siguiente.

361

4.

Preparar en 4 tubos de ensayos limpios y secos lo siguiente:

5.

Mezclar con cuidado y dejar a temperatura ambiente unos 10 minutos.

6.

Leer las densidades pticas del problema y de los patrones en un espectrofotmetro con banda de 520 nm; el cero de densidad ptica se obtiene con el blanco.

7.

Calcular usando la siguiente frmula: Utilizar la lectura del patrn ms parecido a la del problema. Utilizando el patrn 1: mg de creatinina por 100 ml = Lectura del problema x 1,0 Lectura e patrn 1

Utilizando el patrn 2: mg de creatinina por 100 ml = Lectura del problema x 3 0 Lectura del patrn 2

8.

Los valores normales son: 0,4 a 1,2 mg por 100 mI de plasma o suero.

362

TRANSAMINASAS EN SANGRE

PRINCIPIOS GENERALES
Se incuba el suero con cido alfa-cetoglutrico y cido asprtico. Se forma cierta cantidad de cido oxalactico o de cido pirvico, respectivamente. En medio alcalino, el cetocido formado, da lugar a un compuesto coloreado proporcional a la cantidad de cido presente, y refleja la actividad de transaminasa.

MTODO

REACTIVOS

Buffer de fosfatos Piruvato de sodio Sustrato para TGO (transaminasa glutmico oxalactica). Sustrato para TGP (transaminasa glutmico pirvica). Reactivo cromgeno. Solucin NaOH

PROCEDIMIENTO
Es idntica para las transaminasas oxalactica y pirvica: slo cambia el sustrato. Colocar 1 ml de sustrato (TGO o TGP) en un tubo de ensayo y poner en bao mara a 37C durante unos minutos. Aadir 0,2 ml de suero. Mezclar.

l.

2.

363

3.

Incubar durante 60 minutos para TGO o durante 30 minutos para TGP en bao mara a 37C. Trascurrido el tiempo necesario, sacar del bao y agregar 1,0 ml del reactivo cromgeno. Mezclar. Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 minutos. Aadir 10 ml de NaOH 0,4 N. Mezclar por inversin y dejar en reposo por 20 minutos. Leer en el fotocolormetro a 505 nm poniendo a cero con agua y con un blanco de 1,0 mI de sus trato, 0,2 mI de suero, 1,0 mI del reactivo cromgeno y 10 ml de NaOH 0,4 N. Los resultados se calculan sobre la curva de calibracin que se realiza en 6 tubos de ensayo, segn la tabla siguiente:

4.

5. 6.

7.

8.

9.

En cada uno de los 6 tubos aadir 1 mI de reactivo cromgeno, agitar suavemente y dejar 20 minutos en reposo a temperatura ambiente.

10. Agregar 10 mI de NaOH 0,4 N. Mezclar por inversin y dejar reposar 30


minutos.

364

11. Leer en el fotocolormetro a 505 nm poniendo a cero con agua destilada. 12. Los valores normales son:
TGO: de 8 a 40 unidades por mI. TGP: de 5 a 35 unidades por mI.

13. Se puede observar.


Aumento o falso positivo de TGO: Por la ingestin de cido nalidxico, anticonceptivos orales, eritromicina, gentamicina, etc. Aumento o falso positivo de TGP: Por la ingestin de agentes anablicos, metildopa, salicilatos, etc.

365

FOSFATASA ALCALINA

PRINCIPIOS GENERALES
Se basa en las actividades fosfatsica del suero mediante la determinacin de la velocidad de hidrlisis enzimtica del paranitrofenlifosfato, que da lugar a pnitrofenol y fosfato en condiciones de temperatura y de pH previamente establecidas. El incremento de la concentracin srica de fosfatasa a1calina est asociada bsicamente a enfermedades hepticas u seas.

MTODO

REACTIVOS
Buffer Sustrato Hidrxido de sodio Agua destilada Solucin testigo de trabajo pH 10,5 0,012 M

PROCEDIMIENTO 1.
Marcar en dos tubos de ensayo: D (desconocido) y B (blanco).

2. Colocar 0,5 mI de buffer pH 10,5 Y 0,5 de sustrato en los tubos de ensayo


marcados.

3. Poner ambos tubos en bao mara a 37C durante 5 minutos. 4. Aadir 0,10 mI de suero en el tubo D .

366

5. Aadir 0,10 mI de agua destilada en el tubo B. 6. Mezclar. Colocar ambos tubos en bao de agua a 37C durante 30 minutos. 7. Transcurrido el tiempo indicado, agregar en cada tubo 10 mI de hidrxido de
sodio 0,02 N.

8. Agregar 0,10 mI de suero en el tubo B. Mezclar bien. 9. Leer en el fotocolormetro a 407 nm ambos tubos, poniendo a cero con agua
destilada.

10. Restar los resultados del tubo D del tubo B mediante la tabla de calibracin. 11. La obtencin de la tabla de calibracin, se realiza de acuerdo con lo siguiente:

12. Efectuar la lectura en el fotocolormetro a 407 nm poniendo a cero con agua


destilada.

13. Se representa en papel semilogartmico las U.I. (Unidades internacionales) de


fosfatasa a1calina. 14. Los valores normales son: Fosfatasa A1calina: 13 - 60 U.I. / litro en adultos. 45 115 U.I. / litro en nios.

367

ELECTRLITOS SRICOS

SODIO (Na)

PRINCIPIOS GENERALES
Determinacin fotocolorimtrica de sodio: El sodio se precipita en forma de acetato sdico de uracHo y zinc, midindose el color amarillo fotocolorimtricamente.

MTODO

REACTIVOS
Reactivo de acetato de uracilo y zinc. Alcohol etilico de 95. cido tric1oroactico al 10%. Solucin testigo de sodio que equivale a 139 mEq/l.

PROCEDIMIENTO 1.
En un tubo de ensayo colocar 0,5 ml de suero. Agregar 2 ml de cido tric1oroactico al 10%, dejar reposar 5 minutos y centrifugar. El sobrenadante se usa para el siguiente paso. En tres tubos de centrfuga marcados con: D (desconocido), T (testigo) y B (blanco) colocar:

2.

368

3. 4.

Mezclar cada tubo y colocarlos en el refrigerador durante una hora. Centrifugar. Decantar cuidadosamente los tubos descartando el lquido sobrenadante y dejando los tubos invertidos durante varios minutos sobre papel de filtro. Lavar las paredes de los tubos con 2 mI de alcohol de 95 o agitando suavemente, para resuspender el precipitado (sedimento). Centrfugar de nuevo y descartar el lquido sobrenadante invirtiendo los tubos en papel filtro como en el caso anterior. Disolver el precipitado (sedimento) con 5 mI de agua destilada. Si la solucin resulta turbia, se debe centrifugar. Leer en el fotocolormetro a 430 nm poniendo a cero con agua destilada. Calcular usando la siguiente frmula: mEq Nall = Densidad ptica del desconocido - Densidad ptica del blanco x 139 Densidad ptica del testigo - Densidad ptica del blanco

5.

6.

7.

8. 9.

10. Los valores normales son:


135 a 155 mEq Na/l.

369

POTASIO (K)

PRINCIPIOS GENERALES
Determinacin fotocolorimtrica del potasio El potasio del suero se precipita en forma de cobaltonitrito de sodio y potasio, el que se determina fotocolorimtricamente aprovechando el hecho de que las soluciones alcalinas de cobalto en presencia de glicina reducen el reactivo de los fenoles a un color azul.

MTODO

REACTIVOS
Reactivo de cobaltonitrito de sodio. Solucin semisaturada de acetato de sodio. Solucin lavadora saturada con cobaltonitrito de sodio y potasio. Solucin de glicina al 7,5% en agua destilada. Carbonato de sodio al 25% en agua destilada. Reactivo de Folin-Ciocalteu. Solucin testigo de potasio que equivale a 5,1 mEq/l.

PROCEDIMIENTO l.
En dos tubos de centrfuga graduados marcados con: D (desconocido) y T (testigo), colocar: Al tubo D: Al tubo T: 0,20 ml de suero. 0,20 ml de solucin testigo de potasio.

2.

Agregar en cada tubo 0,20 ml de solucin semi saturada de acetato de sodio y mezclar.

370

3.

Agregar agitando constantemente, a cada tubo 0,5 ml del reactivo cobaltonitrito sdico recientemente filtrado.

4.

Dejar reposar 45 minutos a temperatura ambiente.

5.

Agregar a cada tubo 1 mI de agua destilada, mezclar y centrifugar ambos tubos durante 15 minutos.

6.

Decantar el lquido sobrenadante e invertir los tubos sobre papel filtro durante 15 minutos.

7.

Agregar al precipitado (sedimento) de cada tubo 1 ml de la solucin lavadora.

8.

Centrifugar los tubos durante 15 minutos, decantar el lquido sobrenadante, invertir los tubos sobre papel de filtro durante 5 minutos.

9.

Agregar a cada tubo 1 ml de alcohol eti1ico de 70 o, mezclar empleando una varilla de vidrio.

10. Lavar la varilla con 3 mI de alcohol etlico de 700, luego verter en el tubo
correspondiente.

11. Centrifugar durante 5 minutos, decantar e invertir los tubos sobre papel filtro
otros 5 minutos.

12. Repetir nuevamente los pasos 9 y 10.

13. Preparar un tercer tubo marcado B (blanco).

371

14. Agregar a los tres tubos D, T Y B, 2 mI de agua destilada.

15. Sumergir en bao hirviente hasta que el precipitado se haya disuelto por
completo (ms o menos 15 minutos).

16. Antes que se enfre, agregar a cada tubo 1 mI de la solucin de glicina y luego
1 mI de la solucin de carbonato de sodio. Mezclar.

17. Aadir a cada tubo 1 mI del reactivo de Folin - Ciocalteu para uso. Mezclar.

18. Sumergir los tubos en bao de agua a 37C durante 15 minutos.

19. Enfriar a temperatura ambiente, agregando a cada tubo cantidad suficiente de


agua destilada hasta completar 6 mI. Mezclar bien.

20. Leer al fotocolormetro a 660 nm poniendo a cero con agua destilada.

21. Calcular usando la siguiente frmula:


mEq KIl = Densidad ptica del desconocido - Densidad ptica del bla~co x 5 1 Densidad ptica del testigo - Densidad ptica del blanco

22. Los valores normales son:


3,6 a 5,5 mEq K/1.

372

CAPTULO X

SEROLOGA
DIAGNSTICO SEROLGICO DE SFILIS 389 Principios generales ............................. 389 Examen directo .................................... 390 Mtodo ................................................. 390 Examen de VDRL (Prueba no treponmlca) ........................................ 392 Limitaciones del examen de VDRL....... 401 Prueba de reagina plasmtica rpida (RPR)(Prueba no treponmica) ............ 401 DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFlCIENCIA HUMANA (VIH) ............................................ 406 Principios generales ............................. 406 DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR EL VIRUS DE LA HEPAMIS B .......................... 411 Principios generales ............................. 411 Mtodo ................................................. 412 MTODOS SEROLGICOS EN EL DIAGNSTICO DE BRUCELOSIS...............414 Principios generales..............................414 Materiales para serologa de Brucelosis .............................................415 Mtodos sexolgicos.............................416 Control de calidad de las pruebas.........423 MTODOS SEROLGICOS EN EL DIAGNSTICO DE SALMONELOSIS..........425 Principios generales..............................425 Aglutinacin en placa ............................426 Aglutinacin en tubo..............................428 Control de calidad de ambas pruebas...431 Limitaciones ..........................................431

373

DIAGNOSTICO SERLOGICO DE SIFILIS

PRINCIPIOS GENERALES
La sfilis es una infeccin de transmisin sexual causada por una bacteria espirilar, el Treponema pallidum. El perodo de incubacin es de aproximadamente un mes.

Las manifestaciones clnicas son variadas, por lo que de acuerdo con los estados de la enfermedad es importante elegir la prueba de laboratorio adecuada para su confirmacin diagnstica y seguimiento de su evolucin, as tenemos: En la sfilis primaria se puede observar el chancro duro (genital, oral, rectal), cuya secrecin contiene gran cantidad de treponemas, los cuales pueden visualizarse por examen directo en un microscopio de campo oscuro. En la sfilis secundaria se observa lesiones en la piel y se realizan las pruebas treponmicas y no treponmicas. Luego de un perodo de latencia variado se presenta la srilis terciaria, en la que hay compromiso cardiovascular o del sistema nervioso; en este caso, las pruebas treponmicas son las que hacen el diagnstico.

Son pruebas no treponmicas VDRL RPR Prueba del Laboratorio de Investigaciones en Enfermedades Venreas. Prueba de reagina plasmtica rpida.

Son pruebas treponmicas FTA-Abs MHA-TP Anticuerpos de treponema fIuorescentes absorbidos. Microhemaglutinacin para Treponema pallidum.

374

EXAMEN DIRECTO

Se requiere un microscopio con condensador para campo oscuro. El examen carece de valor si el paciente ha tratado la lesin (chancro duro) con algn ungento. En este caso se debe esperar tres das para efectuar el examen. El examen de frotis secos y teidos no se recomienda, ya que en la piel y en las membranas mucosas suelen existir treponemas saprofitos.

MATERIALES

Gasa estril. Solucin estril de cloruro de sodio al 0,9%. Una lanceta estril. Pipeta Pasteur con chupn. Portaobjetos de vidrio delgado. Un microscopio con condensador para campo oscuro.

MTODO

1.

Limpiar el chancro con gasa humedecida con una solucin estril de cloruro de sodio al 0,9%. Secar bien.

2. Raspar los bordes del chancro varias


veces con la hojilla de una lanceta estril colocada en posicin plana. Evitar provocar la salida de sangre.

375

3.

Presionar con gasa estril seca.

4.

Retirar la gasa y esperar durante unos minutos a que aparezca un lquido seroso de color rosceo.

5. Aspirar ese lquido con una pipeta


Pasteur provista de un chupn.

6. Depositar

una gota en el portaobjetos de vidrio delgado, especialmente fabricado para microscopa en campo oscuro.

LECTURA

Examinar el portaobjetos con el microscopio empleando un condensador para campo oscuro. Los treponemas se distinguen por sus cuerpos sumamente delgados y sus movimientos caractersticos, rotando alrededor de su eje longitudinal y enroscndose.

376

EXAMEN DE VDRL (PRUEBA NO TREPONMICA)

VDRL significa "Prueba del Laboratorio de Investigaciones en Enfermedades Venreas", que es el lugar donde se elabor por primera vez este examen.

Se examina el suero o lquido cefalorraqudeo (LCR) en busca de reaginas, anticuerpos que se producen en personas que padecen de sfilis.

La existencia de estos anticuerpos se pone de manifiesto por un antgeno, que es una suspensin de partculas minsculas que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol

La suspensin de antgeno forma grumos cuando se enfrenta con anticuerpo s presentes en el suero o LCR (microaglutinacin en lmina) de pacientes con sfilis.

a. Antgeno

El antgeno es una solucin alcohlica que contiene cardiolipina al 0,03%, colesterol al 0,9% Y lecitina al 0,21 %.

El antgeno debe permanecer a una temperatura entre 23 a 29C antes de su preparacin.

Debe examinar el antgeno sostenindolo contra la luz. Si contiene partculas o un precipitado no se debe usar.

Debe ser preparado el mismo da en que se use.

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b. Preparacin de la solucin antignica para el examen de VDRL

MATERIALES
Frasco de fondo plano. Pipetas graduadas de 1 mI. Pipetas graduadas de 5 mI. Un cronmetro. Antgeno VDRL. Solucin amortiguadora para

VDRL, que se suministra junto con el antgeno.

MTODO

l.

Con una pipeta de 1 mI medir 0,4 ml de solucin amortiguadora para VDRL y depostelo en un frasco de fondo plano, de modo que el extremo de la pipeta toque el fondo del frasco.

2.

Con la pipeta de 1 mI medir 0,5 mI de antgeno de VDRL.

3. Introducir en el frasco la punta de la


pipeta conteniendo el antgeno de VDRL, de modo que llegue hasta el tercio superior del frasco.

378

4.

Dar un movimiento rotatorio al frasco, sostenindolo en posicin vertical y' deslizndolo en la superficie de la mesa de trabajo.

5. A medida que se efecta este


movimiento rotatorio dejar caer el antgeno contenido en la pipeta gota a gota. Este procedimiento debe durar aproximadamente 6 segundos o 18 - 20 movimientos rotatorios del frasco en un crculo de 5 cm de dimetro.

6.

Verificar que no quede antgeno en la pipeta.

7.

Con la pipeta de 5 mI medir 4,1 ml de solucin amortiguadora para VDRL y aada al frasco con la mezcla anterior.

8. Tapar el frasco y agitar el frasco


vigorosamente, 30 veces durante 10 segundos aproximadamente. As la solucin quedar lista, para ser usada por un da, pero debe mantenerse entre 23 - 29C (en estufa).

9.

Antes de su uso, la solucin de antgeno, debe probarse con sueros testigos cuya reaccin (resultados) se ha determinado previamente.

379

c. Examen de VDRL en suero

MATERIALES
Mquina rotatoria adaptable a 180 RPM (revoluciones por minuto) que describa un crculo de 19 mm de dimetro en un plano horizontal. Si no cuenta con este equipo hacer rotar completamente la lmina con las dos manos, sobre una superficie plana dando 180 movimientos circulares por minuto, durante 4 minutos. Un microscopio. Un bao mara a 56C. Una aguja roma (sin bisel) calibre 18 para reacciones con suero y calibre 21 para LCR. Una jeringa de 2 cc. Lminas serolgicas, de 2 x 3 pulgadas con anillos de 14 mm de dimetro. Frasco redondo de fondo plano con boca angosta y tapn de vidrio con capacidad de 30 ml. Micropipeta de un canal graduable, rango 5 - 50 l. Tips (1 - 100 I). Pipetas de 1 mI, 5 ml, Y 10 ml. Frasco de vidrio con leja al 3 5%. Solucin antignica preparada. Solucin salina al 0,9% Solucin salina al 10% Sueros control (reactivo y no reactivo). Muestra de suero inactivado por calentamiento en bao mara a 56C por 30 minutos. Muestra de LCD centriugado, pero no debe ser calentado.

380

MTODOS

VDRL CUALITATIVA EN SUERO

l.

Numerar los anillos de la lmina serolgica con un lpiz graso en el orden en que indica la figura. Tomar nota de que los nmeros de los tubos correspondan a los nmeros de los anillos.

2.

Con una micropipeta colocar 50 l (0,05 mI) del suero control reactivo al anillo 1 de la lmina serolgica y 50 l (0,05 mI) del suero control no reactivo al anillo 2.

3.

A partir del anillo 3, colocar 50 l (0,05 mI) de los sueros problemas en cada uno de los anillos de la lmina serolgica.

4.

Aadir con una micropipeta 17 l (0,017 mI) de solucin antignica preparada sobre el suero contenido en cada uno de los anillos de la lmina.

5.

De no contar con micropipetas, utilizar una jeringa de 2 cc con aguja calibre 18 (sin bisel) y sostenindola en posicin vertical deje caer una gota de solucin antignica sobre el suero contenido en cada uno de los anillos de la lmina.

381

6.

Colocar la lmina serolgica con las muestras en un rotador a 180 RPM por 4 minutos o rotarlo manualmente (segn lo indicado, ver materiales).

7.

Terminada la rotacin, examinar la lmina inmediatamente usando un microscopio con el objetivo de 10x y ocular de 10x.

LECTURA E INFORME Grumos medianos o grandes = Reactivo (R). Grumos pequeos = Reactivo dbil (RD). Sin grumos = No re activo (NR).

VDRL CUANTITATIVA EN SUERO

l.

Colocar 50 1 (0,05 mI) de solucin salina al 0,9% del anillo 2 al anillo 6 de la lmina serolgica.

2.

Aadir 50 1 (0,05 mI) de suero problema en el anillo 1 y 2.

3.

Mezclar la solucin salina y el suero del anillo 2 y transferir de este anillo, 50 1 (0,05 mI) al anillo 3.

382

4.

Mezclar el contenido del anillo 3 y transferir 50 1 (0,05 mI) al anillo 4

5.

Mezclar el contenido del anillo 4 y transferir 50 1 (0,05 mI) al anillo 5 y as sucesivamente hasta el anillo 6.

6.

Aadir con una micropipeta 17 1 (0,017 mI) de solucin antignica sobre el contenido de cada anillo de la lmina serolgica (del anillo 1 al 6)

7. Colocar la lmina con las muestras


en el rotador a 180 RPM por 4 minutos o rotarlo manualmente (segn lo indicado, ver pgina 395).

8.

Tan pronto como hayan transcurrido los 4 minutos, colocar la lmina serolgica en el microscopio y examinar con el objetivo de l0x y ocular de l0x.

9.

Si se obtiene re activo por sobre el ttulo 1/8 continuar con las siguientes diluciones: Preparar una dilucin 1/8, colocando en un tubo 0,7 ml de solucin salina al 0,9% Y agregar 0,1 ml del suero problema. Colocar 50 1 de solucin salina 0,9% en los crculos 2, 3 Y 4 de la lmina serolgica. Aadir 50 l de la dilucin 1/8 en los crculos 1 y 2. Seguir el procedimiento repitiendo los pasos 3, 4, 5, 6, 7 y 8.

383

LECTURA E INFORMATICA Definir como: Reactivo Reactivo debl No reactivo (R) (RD) (NR)

Segn las caractersticas microscpicas mencionadas anteriormente.

Se informa los resultados segn el siguiente cuadro de titulacin para el examen cuantitativo de VDRL:

Los resultados se notifican en trminos de la mayor dilucin de suero en que se haya producido la reactividad.

384

d. Examen de VDRL en lquido cefalorraqudeo (LCR)

PREPARACIN SENSIBILIZADA l.

DE

SUSPENSIN

ANTIGNICA

En un tubo de ensayo mezclar 1 parte de solucin salina al 10% con 1 parte de suspensin antignica preparada para la prueba con suero. Mezclar vigorosamente y dejar reposar por 5 minutos. As estar lista para ser utilizada.

2.

MTODO l. 2.
Colocar 50 l (0,05 ml) de LCR problema en una lmina serolgica. Aadir 10 l (0,01 ml) con micropipeta o de lo contrario una gota de suspensin antignica sensibilizada utilizando una jeringa con aguja de calibre 21 (sin bisel). Colocar la lmina en el rotador por 8 minutos a 180 RPM o rotarlo manualmente. Terminada la rotacin observar al microscopio con objetivo de l0x y ocular de 10x.

3.

4.

LECTURA E INFORME
Grumos medianos o grandes Grumos pequeos Sin grumos = = = Reactivo (R)

Reactivo dbil (RD) No reactivo (NR)

385

LIMITACIONES DEL EXAMEN DE VDRL

Puede producirse un fenmeno de prozona (exceso de anticuerpos), en el cual la reactividad de un suero no diluido se ve inhibida.

Este fenmeno de prozona se sospecha cuando se produce una reaccin dbilmente reactiva.

Para evitar ste fenmeno de prozona todo suero que presente algn tipo de reaccin debe ser sometido a una prueba cuantitativa de VDRL.

Puede producirse falsos positivos en muestras de persona o pacientes que usan narcticos, padecen de lupus eritematoso, mononucleosis, malaria, lepra, neumona viral, o que recientemente han sido inmunizados.

PRUEBA DE REAGINA PLASMTICA RPIDA (RPR) (PRUEBA NO TREPONMICA)

La prueba de RPR, es una prueba serolgica no treponmica de floculacin macroscpica.

La prueba de RPR utiliza un antgeno que es una modificacin del antgeno de VDRL, que contiene partculas de carbn para ayudar a visualizar de modo macroscpico la reaccin, cloruro de colina para no inactivar los sueros y cido etildiaminotetraactico (EDT A) para hacer ms estable la suspensin.

Para la prueba de RPR se usa dos tipos de muestras: suero y plasma.

Dichas muestras no deben presentar turbidez (contaminado), no deben estar hemolizadas y deben estar a una temperatura de 23 - 29C.

386

MATERIALES

Kit de RPR 18 mm prueba en tarjeta. Este kit trae lo siguiente:

Tarjeta con crculos marcados. Capilares. Antgeno. Aguja roma (sin bisel) N 20. Aplicadores de madera o plstico. Frasco gotero de plstico.

a. Prueba RPR cualitativa

MTODO 1.
Colocar la aguja sin bisel en el frasco gotero de plstico.

2.

Colocar parte del antgeno (dependiendo del nmero de muestras a procesar), en el frasco gotero de plstico y verificar que la gota de antgeno salga de forma uniforme a travs de la aguja.

387

3.

Colocar sobre cada uno de los crculos de la tarjeta, 50 1 (0,05 mI) de los sueros a evaluar, o una gota utilizando el aplicador del kit. No olvidar colocar los sueros control.

4.

Con ayuda del aplicador extienda la muestra dentro del crculo sin salir del margen.

5.

Agregar 17 1 (0,017 mI) de antgeno, con micropipeta o una gota con el gotero del kit, sobre las muestras a evaluar.

6.

Colocar la tarjeta con las muestras sobre el rotador por 8 minutos a 100 RPM.

7.

Si no cuenta con rotador, hacer rotar completamente la tarjeta con las dos manos, sobre una superficie plana, dando 100 movimientos circulares por minuto, durante 8 minutos.

8.

Luego de los 8 minutos, tomar la tarjeta con ambas manos y balancearla para observar los grumos, sobre todo en casos de nnima reactividad.

9.

Hacer la lectura bajo una lmpara de luz, de preferencia.

LECTURA E INFORME

Si se observan grumos definidos o pequeos, debe realizarse la prueba cuantitativa.

388

b. Prueba RPR cuantitativa

MTODO l.
Colocar 50 1 (0,05 mI) de suero fisiolgico al 0,9% del segundo al sexto crculo de la tarjeta.

2.

Colocar 50 1 (0,05 mI) del suero problema en el primer crculo y 50 1 (0,05 mI) en el segundo crculo, mezclar bien en el segundo crculo.

3.

Transferir 50 l (0,05 mI) al tercer crculo, mezclar bien y transferir 50 l (0,05 mI) al cuarto crculo, mezclar bien.

4.

Transferir 50 1 (0,05 mI) al quinto crculo y as sucesivamente hasta el sexto crculo.

5.

Usando un aplicador, extender la mezcla en cada crculo comenzando en el sexto crculo y terminando en el primer crculo.

6.

Agregar 17 l (0,017 mI) de antgeno, con micropipeta o una gota con el gotero del kit, sobre las muestras a evaluar:.

7.

Colocar la tarjeta con las muestras sobre el rotador por 8 minutos a 100 RPM. Si no cuenta con rotador, hacer rotar completamente la tarjeta con las dos manos, sobre una superficie plana, dando 100 movimientos circulares por minuto, durante 8 minutos.

8.

Luego de los 8 minutos, tomar la tarjeta con ambas manos y balancearla para observar los grumos, sobre todo en casos de mnima reactividad. Reportar el ttulo hasta la dilucin en que se observe una reaccin, inclusive una reaccin muy fina, que considerar como reactivo mnimo.

9.

389

c. Limitaciones de la prueba RPR

Fenmeno de prozona (exceso de anticuerpos), en el cual la reactividad de un suero no diluido se ve inhibida. Puede sospecharse cuando se produce una Reaccin mnima, o se aprecian grumos, bastante grandes mezclados con partculas sueltas de antgeno en la prueba cualitativa, por tanto, todo suero que presente algn tipo de reaccin debe ser sometido a una prueba cuantitativa.

Puede producirse falsos positivos en muestras de personas que usan narcticos padecen de lupus eritematoso, mononucleosis, malaria, lepra, neumona viral o hayan sido recientemente vacunadas.

390

DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH)

PRINCIPIOS GENERALES
Para hacer el diagnstico de infeccin por VIII, se emplean pruebas para un diagnstico preliminar (tamizaje) y contirmatorias, que detectan anticuerpos en muestras de sueros.

Las pruebas inmunolgicas ligadas a enzimas (ELISA) se usan para un diagnstico preliminar basado en la deteccin de los anticuerpo s contra VIII.

El suero o plasma son los elementos ms comunes usados para la deteccin de anticuerpos. Deben guardarse congelados en el caso de que la prueba no pueda realizarse inmediatamente luego de la recoleccin.

Los procedimientos ms comnmente usados se clasifican como pruebas de ELISA indirecto, competitivo y de captura.

Los antgenos usados en estas pruebas pueden ser derivados de virus lisados o producidos por recombinacin gentica o sintticamente.

Los anticuerpos son producidos en animales y pueden ser monoclonales o policlonales.

Estos reactivos se incluyen en los paquetes (kits) de las pruebas comerciales, ya sea fijados a fase slida o empaquetados separadamente junto con otros reactivos.

Todos los juegos de las pruebas incluyen especmenes de control positivo y negativo que deben ser incluidos durante cada examen para asegurar la validez de los resultados de la prueba.

391

a. Prueba de ELISA indirecto

FUNDAMENTO
La muestra de suero se diluye en el soporte en el que se encuentra inmovilizado el antgeno. Se incuba por un perodo especfico de tiempo y a una temperatura exacta de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Si las muestras de suero contienen los anticuerps especficos, stos formarn un complejo antgeno anticuerpo y permanecern unidos al soporte. La muestra de suero se elimina por lavado.

Luego, agregar anticuerpos antihimunoglobulinas totales conjugadas con peroxidasa. Fabricante humanas Incubar a la temperatura indicada por el

Este conjugado se unir al complejo antgeno-anticuerpo, si esto ltimo se produjo en el paso 2 del proceso.

392

Realizar un nuevo lavado y agregar el substrato enzimtico.

En los casos en que se haya unido el conjugado, la reaccin genera un producto coloreado proporcional a la concentracin de anticuerpos en la muestra.

La concentracin de anticuerpos es detectada por el espectrofotmetro a una longitud de onda determinada segn los procedimientos del fabricante.

La lectura de resultados positivos se basa en la aparicin de un color que se puede detectar ya sea visualmente o con un espectro fotmetro.

Es la prueba ms usada.

b. Prueba de ELISA competitivo

FUNDAMENTO

Es un mtodo indirecto modificado para detectar anticuerpos VIH.

El anticuerpo VIH en la muestra positiva compite con el anticuerpo VIH marcado con la enzima por los lugares re activos en los antgenos ligados al soporte de fase slida.

Por lo tanto, ambos, la muestra y el anticuerpo marcado con la enzima son aadidos al mismo tiempo.

El anticuerpo de la muestra positiva se ligar al antgeno, y por lo tanto evitar que los anticuerpos marcados con enzima se junten con el antgeno.

393

Esto limitar la cantidad de enzima disponible para reaccionar con el substrato y no se producir ningn color para casos de muestras positivas con anticuerpos a VIH.

En contraste, las muestras que son negativas para anticuerpos a VIH permitir a la gran mayora de los anticuerpo s marcados con enzima ligarse al antgeno fijado al soporte.

Al agregar el substrato de la enzima resultar en el desarrollo de un color similar al control negativo.

394

c. Prueba de ELISA con antgeno de captura

FUNDAMENTO
Esta prueba puede ser realizada como una prueba indirecta o competitiva.

Un anticuerpo monoclonal (especfico para un determinante antignico) es ligado a la fase slida.

Un re activo con el antgeno especfico del VIH se aade enseguida a la fase slida, con el fin de que el antgeno se ligue al anticuerpo monoclonal.

PROCEDIMIENTO l.
Despus de un perodo de incubacin y de lavado, el suero que se va a examinar es aadido e incubado. La fase slida es luego lavada y se aade la inmunoglobulina anti-Ig humana marcada con la enzima, se incuba y se lava. Aadir el substrato de la enzima, mezclar e incubar. Si es positiva, en la muestra de suero se produce color.

2.

3. 4.

395

DIAGNOSTICO DE LA INFECCIN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS B

PRINCIPIOS GENERALES

TEST DE LTEX DIRECTO PARA LA DETECCIN DEL ANTGENO DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B (HBsAg)

Se basa en una reaccin de aglutinacin de ltex.

Las partculas de ltex estn sensibilizadas con anticuerpos monoclonales re activos frente al antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg).

En el caso de una reaccin positiva pueden obtenerse distintos patrones de aglutinacin. En ausencia del antgeno HBsAg no se produce la aglutinacin.

Los procedimientos del fabricante son incluidos en los paquetes (kits), y es especialmente importante que stos se entiendan y que todo el equipo, material y condiciones ambientales estn disponibles para la realizacin de la prueba.

Todos los juegos de las pruebas incluyen controles positivos y negativos que deben ser procesados durante cada examen para asegurar la validez de los resultados de la prueba.

396

MTODO
Las partculas de ltex estn sensibilizadas con gamma-globulinas de conejo.

MATERIALES
Reactivo de ltex: Control positivo: Control negativo: Placas de reaccin. Agitadores desechables.

1 x 2,5 mI. 1 x 0,5 mI. 1 x 0,5 mI.


Prediluido. Prediluido.

PROCEDIMIENTO l. 2. 3.
Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. Homogenizar completamente el reactivo de ltex. Diluir la muestra que se examinar, 1/40 en salina (0,9% NaCl): 1 gota (50 l) de suero fresco ms 2 mI de salina (0,9% de cloruro de sodio).

4.

Colocar una gota de la muestra diluida en uno de los crculos de reaccin.

5. Colocar una gota de la muestra sin


diluir en otro de los crculos.

6. Colocar una gota de cada uno de los


controles en los correspondientes crculos de reaccin.

397

7.

Aadir una gota de reactivo de ltex homogenizado a cada uno de los crculos.

8.

Mezclar con distintos agitadores, cada uno de los crculos, de modo que el lquido se extienda por toda la superficie.

9. Balancear la placa y observar la


presencia de aglutinacin a los 5 minutos.

LECTURA
De acuerdo con los siguientes patrones de aglutinacin: HBsAg negativo No hay aglutinacin ni en la muestra diluida ni en la muestra sin diluir. HBsAg positivo (Nivel medio o elevado) Aglutinacin en las muestras diluid~ y sin diluir. HBsAg positivo (Nivel bajo) Aglutinacin en la muestra sin diluir. No aglutinacin en la muestra diluida. HBsAg positivo (Nivel alto) Aglutinacin en la muestra diluida. No aglutinacin en la muestra sin diluir (por fenmeno de zona).

398

MTODOS SEROLGICOS EN EL DIAGNSTICO DE BRUCELOSIS


PRINCIPIOS GENERALES
La brucelosis es una enfermedad infecciosa, bacteriana, que afecta principalmente a los bovinos, caprino s porcinos y equinos. Es una enfermedad zoontica de importancia mundial por afectar al hombre en ciertas circunstancias especiales.

La Brucella es un microorganismo cocobacilar, no mvil, no esporulado, gram negativo de 0,5 x 1,5 m. Puede agruparse en pares o en cadenas cortas. Existen tres especies principales del gnero Brucella: Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, siendo esta ltima la que produce mayor severidad clnica en el hombre.

El diagnstico microbiolgico de brucelosis se basa en la demostracin de la presencia de brucelas en el organismo y/o en la presencia de los anticuerpo s anti-Brucella con ttulos demostrativos en la sangre y, ocasionalmente, en otros lquidos como el lquido cefalorraqudeo, exudados, etc. Puesto que no se consigue siempre el aislamiento de la brucela, es obligatorio recurrir para el diagnstico al empleo de mtodos serolgicos. Si tomamos en consideracin la estructura antignica del gnero Brucella y la respuesta inmune del paciente, las pruebas serolgicas se pueden agrupar segn el antgeno o la clase de inmunoglobulina (IgM o IgG) que interviene en la reaccin. Las pruebas que se usan en el diagnstico serolgico de brucelosis son: Prueba de aglutinacin en placa. Prueba de aglutinacin en tubo. Prueba de 2- Mercaptoetanol. Rosa de Bengala. Anticuerpos bloqueadores y el fenmeno de zona que se observa en la prueba en tubo.

399

MATERIALES PARA SEROLOGA DE BRUCELOSIS

Aglutinoscopio. Placa o lmina de vidrio dividida en 72 cuadrados de 3,0 a 3,5 cm por lado. Pipetas graduadas para medir 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005 mI (puede usarse pipetas de 0,2 mI graduadas al milsimo o al centsimo).

Gotero calibrado que d exactamente 0,03 mI por gota. Agitadores de metal, de plstico o palitos de dientes. Un cron6metro. Sueros control positivo y negativo. Tubos de ensayo 13 x 100 mm. Pipetas serol6gicas de 10 y 5 ml. Jeringas de 2 ml de capacidad con aguja N 16 y 2~ pulgadas de longitud. Micropipetas de 5 - 50 1, de 20 - 200 1 y otra de 200 - 1 000 1 de rango.

400

MTODOS SEROLGICOS a. Prueba de aglutinacin rpida en placa


Es una prueba de diagnstico rpida, muy usada, sin embargo los resultados pueden variar cuando los antgenos empleados son de mala calidad o la tcnica no es la correcta.

Se utiliza el antgeno preparado con Brucella abortus.

Con esta prueba se detecta la presencia tanto de hununoglobulina IgM como de la IgG.

Se debe considerar como ttulo presuntivamente positivo 1/100, o positivo cuando aumenta el ttulo por lo menos el cudruplo del valor inicial en una muestra examinada con por lo menos 1 semana de diferencia.

MTODO l.
Con la pipeta inclinada a 45 o en contacto con la placa, depositar: 0,08 ml 0,04 ml 0,02 ml 0,01 ml 0,005 ml

de la muestra de suero en una columna de la placa.

2. Agitar suavemente el antgeno y con


el gotero en posicin vertical dejar caer una gota del antgeno sobre cada una de las muestras del suero.

401

3.

Con un agitador o un palito de dientes, mezclar cuidadosamente el suero y el antgeno con un movimiento circular, empezando por la dilucin ms alta. La mancha circular ocupada por cada dilucin debe tener los siguientes dimetros: 0,08 = 27 mm. 0,04 = 24 mm. 0,02 = 21 mm. 0,01 = 18 mm. 0,005 = 15 mm.

Si se trata del suero de un mismo paciente, no es necesario enjuagar y secar los agitadores cuando se agita de altas a bajas diluciones. Cambiar de agitador cuando se trata de sueros de diferentes pacientes.

4.

Levantar la placa y agitar con un suave movimiento rotatorio (4 veces).

5.

Colocar la placa en el aglutinoscopio, se apaga la luz oscureciendo la habitacin y se cierra la tapa para evitar la evaporacin, y se espera 8 minutos.

6.

Al trmino de los 8 minutos se levanta la tapa, se prenden las luces del aglutinoscopio, se rota nuevamente la placa por 4 veces y hacer la lectura inmediatamente.

LECTURA l.
La lectura debe hacerse exactamente a los 8 minutos, que es cuando las muestras alcanzan la aglutinacin mxima, si se prolonga el tiempo favorece la evaporacin excesiva que da apariencia de aglutinacin en la periferia de la mezcla suero-antgeno.

402

REACCIN COMPLETA La mezcla suero-antgeno ha sido aglutinada y el lquido que las rodea es completamente transparente. El tamao de la masa aglutinada vara de fmo a grandes grumos.

REACCIN INCOMPLETA Incluye todos los grados intermedios de reaccin que van de trazas de partculas aglutinadas y el lquido que las rodea no es transparente. En tal caso, si el porcentaje de aglutinacin es mayor del 50%, se informa como reaccin completa en este ttulo y si es menor del 50% se informa como negativa.

REACCIN NEGATIVA Es una mezcla homognea de suero-antgeno sin ninguna evidencia de aglutinacin.

403

b. Prueba de Rosa de Bengala


Llamada tambin de la tarjeta o Card Test, se basa en la inactivacin de las inmunoglobulinas IgM a un pH bajo. Detecta exclusivamente IgG 1.

Utiliza el antgeno de Rosa de Bengala (cepa de Brucella abortus).

Se considera positiva cuando se observa aglutinacin.

En todos los casos de Rosa de Bengala positiva se debe someter a una prueba confirmatoria como, por ejemplo, la aglutinacin en tubo o la de 2-Mercaptoetanol.

La prueba de Rosa de Bengala es cualitativa, por lo que el resultado se informa como positivo o negativo.

Es muy til para el diagnstico inicial eJe brucelosis aguda; no se recomienda para ver la evolucin de los pacientes.

MTODO l.
Colocar 0,03 ml de suero problema sobre uno de los cuadrados de la lmina de vidrio (o tarjeta de cartn, lmina de plstico, etc.)

2.

Colocar una gota (0,03 mI) de antgeno de Rosa de Bengala cerca de la del suero problema.

3.

Mezclar bien el suero y el antgeno utilizando un agitador o un palito de dientes distinto para cada muestra. La mancha circular ocupada por la muestra debe tener un dimetro de 23 a 24 mm.

4.

Hacer girar la lmina o tarjeta durante 4 minutos a razn de 10 a 12 movimientos por minuto. Esto se puede hacer en forma manual o con rotadores mecnicos.

404

LECTURA
El resultado de la prueba se lee a los 4 minutos sobre un fondo blanco.

REACCIN POSITIVA Presenta grumos de aglutinacin, que pueden ser grandes o pequeos.

c. Prueba en tubo y del 2-Mercaptoetanol


La prueba en tubo es una prueba confirmatoria (concluyente) de los resultados obtenidos con otras pruebas serolgicas (ejemplo, la de placa). Detecta la presencia de inmunoglobulinas IgG e IgM. Los sueros hemolizados no son adecuados para la aglutinacin en tubo por la interferencia del fenol con la hemoglobina libre, que puede ocasionar pseudoaglutinaciones. La prueba del 2-Mercaptoetanol (2ME) es una prueba selectiva que detecta presencia de IgG y se debe efectuar simultneamente con la prueba en tubo. El 2MB es sensible a la luz y al calor y se deteriora rpidamente por exposicin al aire. Se debe conservar en frascos de color mbar hermticamente cerrados y en refrigeracin. El ttulo positivo del 2MB es considerado 1/25, es una buena prueba para el seguimiento del paciente.

MATERIALES
Antgeno para la prueba en tubo: 1 mI de antgeno ms 99 mI de solucin salina al 0,85% fenolada al 0,5%. Antgeno para la prueba 2ME: lmI de antgeno ms 49 mI de solucin salina al 0,85%. Solucin de 2MB 0,1 molar: 0,39 mI de 2-Mercaptoetanol Q.P. ms 49,61 mI de solucin de cloruro de sodio al 0,85% (no utilizar salina fenolada).

405

MTODO

l.

Colocar dos hileras de 5 tubos de 13 x 100 mm en una gradilla por cada muestra de suero.

2.

Identificar el primer tubo de cada hilera con el nmero correspondiente al suero problema.

3.

Destinar una de las hileras a la prueba de tubo y marcarla con una T. Marcar con una M la otra hilera en la que se har la prueba de 2ME.

4. Con una pipeta de 0,2 mI se mide


0,08 mI de suero (primera dilucin) manteniendo la pipeta en posicin vertical sobre la pared interna del tubo, depositar en el fondo del mismo los 0,08 mI. Utilizando el mismo procedimiento, echar 0,04 mI de suero en el segundo tubo, 0,02 mI en el tercero, 0,01 mI en el cuarto y 0,005 mI en el quinto tubo.

5.

Repetir el procedimiento descrito para depositar las mismas cantidades de suero en la segunda hilera de tubos.

6.

gregar 1 mi de solucin de 2-ME a cada tubo de las hileras marcadas con M (prueba de 2MB), agitar y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.

406

7.

Agregar 2 mI de antgeno fenolado a cada tubo de las hileras marcadas con T (prueba de tubo); agitar.

8.

Aadir 1 ml de antgeno para 2-MB a los tubos marcados con M, agitar.

9.

Incubar los tubos por 48 horas a 37C en estufa.

LECTURA

Las muestras deben ser observadas en el aglutinoscopio, con luz indirecta y fondo opaco:

Reaccin positiva La mezcla suero-antgeno es clara y se presentan grumos que no se rompen con una agitacin suave.

Reaccin incompleta La mezcla suero-antgeno es parcialmente clara y la agitacin suave no rompe los grumos, si la aglutinacin es mayor del 50% se reporta como positiva.

Reaccin negativa La mezcla suero-antgeno no es clara y la agitacin suave no revela rumos.

Se reporta como ttulo aquella dilucin ms alta en que se haya producido una reaccin completa, tanto para la prueba en tubo como la de 2MB.

407

Si se quiere conocer el ttulo final del suero por el mtodo de tubo se prepara una dilucin 1/16: 0, 1 mI suero problema ms 1,5 mI de suero fisiolgico o suero negativo. A continuacin, se procede como el mtodo anteriormente descrito. La lectura ser:

FENMENO DE ZONA O PRO ZONA


El fenmeno de zona se observa en la prueba en tubo. El fenmeno de zona es la ausencia de aglutinacin o presencia de aglutinacin parcial en las diluciones bajas y aglutinacin completa en las diluciones altas. Est usualmente asociado con sueros que contienen un alto ttulo de aglutininas. Con este tipo de reaccin se debe reportar la dilucin positiva ms alta como ttulo final, e indicar las diluciones en las cuales ocurre el fenmeno de zona.

CONTROL DE CALIDAD DE LAS PRUEBAS


Uno de los mayores problemas que existe en el diagnstico serolgico es la calidad de los antgenos que se usan en la prueba. En el control de antgenos de Brucella se debe tener en cuenta los siguientes datos:

408

DATOS GENERALES
Anotar en una ficha: El laboratorio productor del antgeno. El tipo de antgeno. La cepa utilizada. La fecha de expiracin. El volumen de antgeno por frasco. El nmero de frascos y si viene con gotero o no.

ASPECTO DEL ANTGENO


Anotar el color del antgeno comparndolo con el antgeno de referencia, si tiene presencia de grumos o si cuando se deja reposar el antgeno se depositan impurezas en el fondo del frasco.

PUREZA
Hacer una coloracin de Gram debiendo observarse slo la presencia de cocobacilos gramnegativos.

ESTERILIDAD
Sembrar una gota del antgeno en: Un tubo de agar tripticase soya. Un tubo de caldo dextrosado con indicador de Andrade.

Un tubo con agar Saboraoud. Observar por 7 das. No deben crecer grmenes en ninguno de los medios.

CONTROL DE pH Medir el pH, tanto del antgeno de prueba como del antgeno estndar, utilizando un potencimetro o papeles indicadores de pH, debiendo estar dentro de un rango adecuado para el antgeno que se prueba.

409

TODOS SEROLGICOS N EL DIAGNOSTICO DE SALMONELOSIS

PRINCIPIOS GENERALES
La serologa del gnero Salmonella constituye el complemento necesario para l diagnstico de la fiebre tifoidea.

El gnero Salmonella tiene principalmente dos clases de antgenos: El antgeno "O" o antgeno somtico termoestable. El antgeno "H" o antgeno flagelar termolbil.

A partir de la segunda semana, el paciente que sufre de fiebre tifoidea, contiene anticuerpos en la sangre, que pueden ser identificados probando el suero del paciente contra antgenos de salmonelas, los cuales pueden ser demostrados por la reaccin de Widal.

La reaccin de Widal incluye: Aglutinacin en placa Procedimiento ampliamente utilizado por su simplicidad. Aglutinacin en tubo Debe utilizarse para confirmar la presencia de anticuerpos demostrados por la prueba en placa y para cuantificar su ttulo.

410

AGLUTINACIN EN PLACA
Se encuentra en el comercio antgenos de O y H de Salmonella para realizar la rueba. Este mtodo es rpido y exacto.

Es preciso agitar bien el vial de antgeno, antes de usarlo, para garantizar una uspensin unifonne y lisa. No deben congelarse.

Almacenar los viales con antgeno a 2 - 8C.

MATERIALES
Antgeno de Salmonella typhi H Y O. Materiales para obtencin de suero del paciente. Pipetas serolgicas de 0,2 ml Placa de vidrio grande (20 x 20 cm) dividida con lpiz de cera y regla en cuadrados (2,5 - 1,27 cm) de preferencia, 5 hileras de 6 cuadrados. Un aplicador o un palito de dientes.

MTODO l.
Depositar en los cuadrados de cada hilera o en cada lmina, las siguientes medidas del suero del paciente: 0,08,0,04,0,02,0,01 Y 0,005 ml.

2.

Aadir a cada medida del suero 0,03 mI de suspensin de antgeno.

3.

Mezclar cada compuesto antgeno-suero con un aplicador o un palito de dientes, comenzar con la dilucin de suero de 0,005 mI Y continuar hasta la dilucin de 0,08 ml.

4.

Rotar (oscilar) la placa de vidrio suavemente 15 - 20 veces (durante 2 minutos). Proceder a la lectura inmediatamente.

411

LECTURA E INFORME l. 2.
Observar la presencia de grumos, indicativo de aglutinacin. Los grados de aglutinacin se interpretan con la siguiente escala:

3.

Las diluciones de suero sobre la placa corresponden a las siguientes diluciones en tubo (aglutinacin en tubo): 0,08 mI de suero 1/20 0,04 mI de suero 1/40 0,02 mI de suero 1/80 0,01 mI de suero 1/160 0,005 mI de suero 1/320

4.

Ttulo del suero El ttulo del suero que se informa corresponde a la ltima dilucin del suero en que se produce una aglutinacin de por lo menos 2+ (50%).

5.

Ejemplo de clculos.

412

AGLUTINACIN EN TUBO
En esta prueba, el suero del paciente se diluye de manera seriada en tubos de ensayo.

MATERIALES
Obtencin del suero del paciente. Cloruro de sodio al 0,85% formalizado (0,5 mI de formaldehdo por 100 mI de solucin salina). Antgeno de Salmonella O o H. Tubos 12 x 75 mm de fondo redondo. Gradillas. Pipetas serolgicas de 1 mI y 5 mI. Bao mara. Fuente de luz adecuada.

MTODO l.
Colocar 8 tubos enumerados en una gradilla para cada suero a probar. Con la pipeta medir 0,9 ml de cloruro de sodio al 0,85% Y depositarIo en el tubo 1 de cada hilera.

2.

3.

Con la pipeta medir 0,5 ml de cloruro de sodio al 0,85% Y depositarIo en cada uno de los tubos restantes (tubo 2 al tubo 8). Agregar 0,1 mI del suero del paciente al tubo 1. Mezclar bien el tubo 1. Transferir 0,5 mI del tubo 1 al tubo 2. Mezclar a fondo.

4. 5. 6.

413

7.

Seguir llevando 0,5 ml del tubo 2 al tubo 3 y as sucesivamente hasta el tubo 7. Desechar los 0,5 ml del tubo 7 despus de mezclar a fondo.

8.

El tubo 8 es el tubo de control del antgeno.

9.

Aadir 0,5 ml del antgeno (Salmonella O o H) a cada uno de los 8 tubos.

10. Agitar cada uno de los tubos para mezclar el antgeno y el suero.

11. Poner los tubos en un bao mara de acuerdo con lo siguiente:


Antgeno de salmonella O, de 16 - 18 horas a 50C. Antgeno de salmonella H, 1 hora a 50C.

Es importante en esta prueba usar el tiempo y la temperatura recomendada y asegurarse que el bao mara est en un lugar libre de vibraciones mecnicas.

12. Las diluciones resultantes van desde 1/ 20 hasta 1/1 280, respectivamente.

LECTURA E INFORME l. Utilizando una lmpara fluorescente contra un fondo negro, registrar el grado
de aglutinacin de la siguiente forma:

414

2.

La aglutinacin de los antgenos ("O", "H") tiene las siguientes caractersticas: Antgeno somtico "O" Se caracteriza por una aglutinacin compacta, gruesa, la cual tiende a ser difcil de dispersar. Antgeno flagelar "H" Tiene una aglutinacin floculante y fina. Debe tenerse cuidado de no agitar una reaccin de antgeno "H" demasiado, mientras se examina.

3.

Ttulo del suero El ttulo del suero que se informa corresponde a la ltima dilucin del suero en que se produce una aglutinacin de por lo menos 2+ (50%).

4.

Se considera que 1/160 de ttulo para el antgeno "O" es diagnstico de Fiebre Tifoidea, pero es todava ms importante demostrar que este ttulo va aumentando en pruebas sucesivas 1 - 2 semanas despus.

5.

Ejemplo de clculos

415

CONTROL DE CALIDAD DE AMBAS PRUEBAS


Para una mejor interpretacin de las pruebas en placa y en tubo, siempre incluir un suero de control positivo y negativo.

Tanto los sueros controles positivos como los negativos se diluyen en la misma proporcin que el suero del paciente y se procesan exactamente de la misma forma siguiendo el procedimiento anteriormente descrito para la prueba en placa y en tubo.

Un antgeno se considera que es de buena calidad si no aglutina con el suero control negativo y reacciona a un ttulo de 1/80 o ms con el suero control positivo.

LIMITACIONES
La principal limitacin es su interpretacin. El diagnstico definitivo no se hace slo con el resultado del laboratorio; tiene que ser hecho por un mdico, tomando en cuenta la historia clnica y el estado fsico del paciente.

La aglutinacin en placa solamente es para descarte rpido de la enfermedad, cualquier cuantificacin y Confirmacin del diagnstico se hace con la prueba de aglutinacin en tubo.

Presentan aglutinaciones falsas positivas los pacientes con enfermedad heptica activa crnica y en individuos vacunados contra la tifoidea.

416

CAPITULO XI

RED DE LABORATORIOS
RED DE LABORATORIOS435 OBJETIVOS.................................................. 435 Mtodos ................................................452 UBICACIN DE LOS LABORATORIOS DE LA RED SEGN NIVEL DE COMPLEJIDAD..... 436 UNIDADES RECOLECTORAS..................... 436 Siembra y envo de muestras ...............455 Laboratorios locales ............................. 436 Laboratorios intermedios ...................... 437 Laboratorio de referencia regional........ 439 Laboratorio de referencia nacional ....... 439 CONTROL DE CALIDAD.............................. 440 Principios generales ............................. 440 Control de calidad para enfermedades de importancia epidemiolgica ............. 440 ENVO DE MUESTRAS................................ 445 Principios general ................................. 445 Tipos de muestras que se envan ........ 446 Procedimiento de envo de muestras ... 446 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE MUESTRAS DE SUERO .............................. 449 Materiales............................................. 449 Obtencin y envo del suero................. 449 ENVO DEL CULTIVO DE BK A UN LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL O NACIONAL ................................................456 Principios generales..............................456 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE SECRECIN URETRAL ...............................457 Materiales .............................................457 Siembra y envo de muestras ...............457 REGISTRO DE LAS MUESTRAS, REGISTRO DEL LABORATORIO E INFORMES DIARIOS Y MENSUALES ................................................460 Principios generales..............................460 Numeracin de muestras ......................460 Los registros del laboratorio..................461 Los informes diario y mensual ..............461 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE HECES PARA EXAMEN BACTERIOLGICO ...........455 PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE HECES PARA LA DETECCIN DE PARSITOS......452

417

RED DE LABORATORIOS
La Red de laboratorios se define como el conjunto de laboratorios de salud pblica agrupados por niveles de complejidad de acuerdo con los servicios que prestan, su infraestructura, equipamiento, etc., en: Unidades recolectoras. Laboratorio local. Laboratorio intermedio. Laboratorio de referencia regional. Laboratorio de referencia nacional.

En este contexto, la concepcin de red de laboratorios sirve para la descentralizacin de pruebas ya estandarizadas hacia los laboratorios de referencia regionales, a fin de lograr el fortalecimiento de los servicios de salud y mejorar la calidad de atencin a la poblacin. Su organizacin es responsabilidad de las Sub-Regiones de Salud y del MINSA. Administrativamente los laboratorios regionales dependen de la Regin de Salud.

OBJETIVOS l.
Establecer normas de las acciones de los laboratorios de la Red en: Servicios. Capacitacin. Supervisin. Control de calidad. Coordinar y promover actividades de capacitacin y transferencia tecnolgica en los laboratorios de la Red de acuerdo al nivel de complejidad. Desarrollar de los laboratorios de la Red para que contribuyan a mejorar la vigilancia de las enfermedades trasmisibles y para evaluar los programas de prevencin y control de las mismas.

2.

3.

418

UBICACIN DE LOS LABORATORIOS DE LA RED SEGN NIVEL DE COMPLEJIDAD

UNIDADES RECOLECTORAS
Lo constituyen los Puestos de Salud 1 y 11, que son unidades recolectoras de muestras e informacin.

Participa en la Red remitiendo al laboratorio local (centros de salud 1 y 11) informacin, las muestras para ser procesadas y para acciones de control de calidad de la recoleccin.

Los procedimientos de laboratorio que realiza incluye la obtencin de muestras.

LABORATORIOS LOCALES
Agrupa a los laboratorios de los Centros de Salud I y II.

Cuenta con infraestructura fsica, equipos, materiales y reactivos, as como profesionales de salud para el trabajo en laboratorio de los siguientes procedimientos: Hemograma completo. Hemoglobina. Hematocrito. Tiempo de coagulacin. Tiempo de sangra. Grupos sanguneos y Rh. Compatibilidad sangunea. Diagnstico del embarazo. VDRL/RPR.

419

Aglutinaciones para salmonelosis y brucelosis. Orina completa. Sedimento urinario. Examen directo de secreciones. Gram de secreciones. BK de esputo y de orina. Parasitolgico (por concentracin). Examen directo de heces. Graham. Gota gruesa. Benedict en heces.

Efecta las pruebas de muestras recolectadas o remitidas por los Puestos de Salud I y II.

Remite muestras para pruebas especiales a ser efectuadas por el Laboratorio Intennedio (Centro de Salud de Referencia).

Adems, realiza la capacitacin, supervisin, evaluacin y control de calidad de los procedimientos de obtencin de muestras de las unidades recolectoras (Puestos de Salud I y II).

Participa en la Red elevando al Laboratorio Intennedio (Centro de Salud de Referencia) la infonnacin para fines de vigilancia y partes de las muestras para acciones de control de calidad.

LABORATORIOS INTERMEDIOS
Agrupa a los laboratorios de los Centros de Salud de Referencia.

Cuenta con estructura fsica, equipos, materiales y reactivos as como profesionales de salud para el trabajo en laboratorio de los siguientes procedimientos, adicionalmente a los efectuados por los Centros de Salud:

420

Velocidad & ~dimentacin de eritrocitos (VSE). Prueba de HIV ELISA. Test de Hepatitis B. Identificacin de Leishmania. Hemocultivo. Urocultivo. Coprocultivo. Cultivo de secreciones. Cultivo de BK. Protenas sricas. Bilirrubinas. Glucosa en sangre. rea srica. Creatinina srica. Transaminasas sricas. Electrlitos sricos.

Efecta las pruebas de muestras recolectadas o remitidas por Puestos y Centros de Salud.

Remite muestras para pruebas especiales a ser efectuadas por el Laboratorio de Referencia Regional.

Ejerce la capacitacin, supervisin, evaluacin y control de calidad de los laboratorios locales.

Participa en la Red elevando al Laboratorio de Referencia Regional informacin para fines de vigilancia y partes de las muestras para acciones de control de calidad.

Organiza la logstica de los insumos de laboratorio y efecta el mantenimiento de los equipos de laboratorio.

421

LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL


Es el ms complejo a nivel regional.

Produce informacin y ofrece servicios confirmatorios de apoyo a la vigilancia epidemiolgica. Est a cargo de un profesional de salud especializado.

Cuenta con infraestructura fsica, equipos, material, reactivos y recursos humanos para el diagnstico de bacterias, virus, hongos y parsitos de las muestras remitidas por el nivel intermedio.

Ejerce la capacitacin, supervisin evaluacin y control de calidad al laboratorio intermedio.

Remite muestras para pruebas especiales a ser efectuadas por el Laboratorio de Referencia Nacional.

LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL


El Laboratorio de Referencia Nacional es coordinado por el Instituto Nacional de Salud (INS).

Cuenta con infraestructura y tecnologa avanzada para la investigacin, control de calidad y diagnstico definitivo de muestras enviadas por el Laboratorio de Referencia Regional.

Promociona, organiza y supervisa la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, en coordinacin con los gobiernos regionales.

Capacita en las nuevas tecnologas desarrolladas en los laboratorios de referencia nacional para que sean difundidas peridicamente a los laboratorios de referencia regional, y de ste a los dems integrantes de la Red. Descentraliza funciones y transfiere atribuciones del nivel central hacia las Regiones para mejorar la capacidad de respuesta al usuario, con inmediata toma de decisin en su propio mbito. Pero al mismo tiempo la informacin obtenida debe ser centralizada en el Laboratorio de Referencia Nacional a fin de tomar decisiones a nivel nacional.

422

CONTROL DE CALIDAD

PRINCIPIOS GENERALES
El control de calidad a cargo de la Red de laboratorios segn el nivel de complejidad, se debe realizar en forma permanente para comprobar que la tcnica empleada en un procedimiento de laboratorio sea la adecuada.

Asimismo, el realizar el control de calidad ayuda a detectar laboratorios de la Red que deben ser capacitados, para uniformizar procedimientos de tcnicas de laboratorio y de notificacin de resultados.

CONTROL DE CALIDAD PARA IMPORTANCIA EPIDEMIOLGICA

ENFERMEDADES

DE

a. Baciloscopa
Consiste en la comparacin de los resultados y evaluacin tcnica indirecta de lminas de baciloscopas preparadas por los laboratorios en su trabajo de rutina.

LMNAS PARA CONTROL


Se debe conservar todas las lminas positivas, hasta un mximo de 25 en un mes.

Por cada lmina positiva que aparezca deber guardarse la negativa que le sigue, si eventualmente aparecieran 2 3 baciloscopas positivas seguidas, conservar las 2 3 negativas siguientes.

Si durante el mes no ha tenido lminas positivas, conservar un 10 % de las negativas.

423

FRECUENCIA DE CONTROL
Mnimo 4 veces al ao a cada uno de los laboratorios de la Red, segn complejidad. Es conveniente efectuar mensualmente este control, durante los primeros 6 meses, a los laboratorios que recin comienzan a realizar baciloscopas o cuentan con personal recin adiestrado.

PROCEDIMIENTO DE LECTURA POR EL LABORATORISTA REVISOR


Debe hacerse desconociendo el informe del laboratorio de origen.

La lectura se efectuar de acuerdo con el procedimiento de diagnstico rutinario.

Simultneamente con la lectura efectuar un anlisis tcnico de las lminas en cuanto a: EXTENDIDO Forma de ejecucin, grosor y regularidad.

TINCIN Observar presencia de defectos caractersticas de la tincin de fondo. de decoloracin, precipitados,

Por ltimo comparar la lectura y evaluacin tcnica con los resultados enviados por el laboratorio de origen.

INFORME DE LA EVALUACIN
Si los resultados entre el laboratorio revisor y el de origen son diferentes en una o ms lminas:

424

Debe realizarse una segunda lectura de la o las lminas con diferencias de resultados, con una observacin minuciosa y ms amplia en cuanto al nmero de campos observados, tratando de agotar las posibilidades de error.

Si persiste la diferencia de resultados, la lmina se cataloga como "discordante" .

Si el 50% o ms de las lminas observadas presenta deficiencias tcnicas, ya sea en cuanto a extendido o tincin, el laboratorio deber ser catalogado como "con observaciones tcnicas".

CONDUCTA A SEGUIR POSTERIOR AL INFORME


El hallazgo de una o ms discordancia determina una supervisin directa al laboratorio en cuestin.

Si por motivos de fuerza mayor no se efecta una visita de supervisin directa, se deber enviar una comunicacin al laboratorio correspondiente que incluya la informacin de las discordancias y las lminas problemas adjuntas.

Si la causa principal de discordancia o diferencias tcnicas es la falta de adiestramiento del personal responsable de la tcnica, se deber proponer la capacitacin respectiva, al director del establecimiento y al equipo de TBC.

REGISTRO DE LA SUPERVISIN TCNICA


Debe llenarse una hoja individual para cada laboratorio de la red donde se consignar: Fecha de solicitud de lminas para chequeos. Fecha de recepcin de las lminas. Resultados del laboratorio de origen y la lectura del laboratorio revisor. Observaciones tcnicas encontradas si las hubo, especialmente si se refieren a extendidos o tincin o bien ambos aspectos.

425

b. Malaria

CONTROL DE CALIDAD DE GOTA GRUESA Y FROTIS


El procesamiento y la lectura de estos exmenes requieren capacitacin previa y permanente.

Para determinar las necesidades de capacitacin y asegurar la calidad del diagnstico existe el sistema de control de calidad de gota gruesa y frotis.

ENVO DE LMINAS DEL LABORATORIO LOCAL AL INTERMEDIO

Personal recin capacitado

Debe enviar al laboratorio intermedio para su evaluacin.

Personal con experiencia

Debe enviar al laboratorio intermedio el 100% de positivas y el 10% de las negativas.

RECOMENDACIONES PARA EL ENVO DE LMINAS


Separar los grupos de lminas positivas de las negativas. Acompaarlas de su ficha correspondiente "Informe mensual: Gota gruesa" del laboratorio. Las lminas deben estar limpias, eliminando todo residuo de aceite de inmersin.

426

El embalaje se har con cartn corrugado y asegurado con pabilo, a fm de evitar el deterioro o rotura de las mismas. Es aceptable para su revisin, el envo de lminas hasta con un retraso de 4 semanas.

CALIDAD TCNICA DE GOTA GRUESA


Calidad: Coloracin del parsito: Citoplasma: Pigmento: 10 - 20 leucocito s por campo. Ncleo, rojo intenso o grosella. Azul cielo o violceo. Amarillo sin brillo.

CALIDAD DEL DIAGNSTICO


Se considera error de diagnstico cuando una lmina que siendo positiva o negativa en el laboratorio local, resulta negativa o positiva respectivamente en el laboratorio intermedio. La observacin microscpica de la revisin estar en relacin directa con la calidad y coloracin de la muestra, teniendo que observar como mnimo 100 campos microscpicos en una muestra bien preparada (10 - 20 leucocitos por campo). Se considera error de especie cuando no presenta concordancia con el diagnstico positivo de especie reportado por el laboratorio local.

CALIDAD PTIMA DE LA MUESTRA DEL FROTIS


Tamao: 3 cm Ubicacin: Del centro al borde externo Adherencia: ptima. Identificacin: Legible (fecha y nmero)

427

ENVO DE MUESTRAS

PRINCIPIOS GENERALES
En el sistema de la Red de Laboratorios se suelen enviar muestras de los laboratorios, segn su nivel de complejidad, a otros ms especializados, con el fin de que efecten exmenes que ellos no estn en condiciones de realizar.

El objetivo es transportar las muestras y no a los pacientes, para efectuar las pruebas, cuando stas no se efectan en el establecimiento de salud en que se est atendiendo y de esta manera facilitar la atencin de los usuarios de los establecimientos.

La remisin de muestras depender de la demanda y de la urgencia de las pruebas.

Los laboratorios intermedios (centros de salud de referencia) remitirn a los laboratorios locales (centros de salud), previa programacin, los medios o material de transporte necesarios para el envo de muestras.

El laboratorio local seguir este mismo criterio con las unidades recolectoras.

Las unidades recolectoras (puestos de salud) sin profesional de salud remitirn para su respectiva lectura, lminas de baciloscopas y malaria, por lo que la frecuencia de remisin puede ser semanal.

Las unidades recolectoras que cuenten con profesional de salud pueden recolectar muestras para otros exmenes que se realizan en los laboratorios locales, en tal caso se debe tener das fijos coordinados, con el laboratorio local para la toma y envo de muestras.

428

TIPOS DE MUESTRAS QUE SE ENVAN

a. Sustancias infecciosas
Son aquellas sustancias que contienen microorganismos vivos o viables transportados en medios de cultivo para diagnstico microbiolgico de bacterias, virus, rickettsias, parsitos, hongos, que pueden causar enfermedades tanto en el hombre como en los animales.

b. Muestras para diagnstico


Son todos los materiales de origen humano o animal que pueden contener sustancias infecciosas, consistentes en secreciones, excretas, sangre, tejidos y lquidos tisulares, enviados con fines de diagnstico.

c. Productos biolgicos
Son productos biolgicos terminados para uso humano o veterinario, por ejemplo, vacunas que se envan para control de calidad.

PROCEDIMIENTO DE ENVO DE MUESTRAS

l.

Las sustancias infecciosas y las muestras para diagnstico que contengan probablemente sustancias infecciosas:

Requieren un triple envase conforme a las recomendaciones de las Naciones Unidas: Un recipiente primario en el que se coloca la muestra. Un recipiente secundario que contiene material absorbente entre l y el recipiente primario en cantidad suficiente para absorber todo el lquido de la muestra en caso de fuga.

429

Una envoltura exterior para proteger el recipiente secundario de las influencias exteriores durante el transporte (por ejemplo: deterioro fsico yagua). De no contar con este envase se puede adaptar envases de plstico de cierre hermtico, cajas de cartn, etc.

2.

Para su identificacin el recipiente de envo debe estar correctamente rotulado con: El nombre o cdigo que identifique al paciente. Fecha de toma de muestra. Tipo de muestra. Examen solicitado. Procedencia.

Nunca rotular la tapa.

3.

Debe estar acompaado de las fichas o formularios, de ese modo el laboratorio receptor podr identificar la muestra y decidir como debe manipularla y examinarla.

4.

Se debe establecer por anticipado arreglos con el transportista y el receptor para tener la seguridad que las muestras se reciban y analicen rpidamente, esto puede hacerse por telfono o telegrama, radio, etc.

430

5.

No debe enviarse ninguna sustancia infecciosa sin acuerdo previo entre el que lo enva, el que lo transporta y el que lo recibe.

6.

APERTURA DE PAQUETES CON MUESTRAS Las muestras se deben desembalar en bandejas. Toda muestra que lleve etiqueta "Peligro de infeccin" o que se reciba por flete o correo areo ser abierto en una cmara de seguridad biolgica.

431

PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE MUESTRAS DE SUERO

Los exmenes serolgicos que requieren de suero tienen por finalid: determinar si ste contiene anticuerpos o antgenos de diversas enfermedad infecciosas.

MATERIALES
Materiales para la extraccin de sangre. Una centrfuga. Un tubo para centrifugacin, de 10 mI, de fondo redondo con tapa rosca o tapn de goma, o un tubo de "vacuntainer" estril, o una jeringa estril y seca. Pipetas de Pasteur estriles. Chupn. Un frasco estril de 10 mI, con tapa hermtica.

OBTENCIN V ENVO DEL SUERO

l.

Extraer 10 mI de sangre de una vena del brazo. Una vez localizada la vena, asegrese que haya una buena canalizacin que garantice un fluido rpido y fcil de la sangre; una puncin incorrecta aumenta la posibilidad de hemlisis.

432

2.

Sacar la aguja de la jeringa con ayuda de una pinza y eliminarla en un recipiente con desinfectante. Depositar la sangre en el tubo para la centrifugacin; para evitar la hemlisis presione lentamente el mbolo de modo que la sangre fluya por la pared interna del tubo. Tapar ste inmediatamente.

3. Dejar que la sangre coagule a la


temperatura ambiente. Despus de un lapso de 30 minutos a 2 horas, pero no ms, centrifugar la sangre a 2 500 revoluciones por minuto durante 10 minutos.

4.

Si no tiene centrfuga, la sangre se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el cogulo se separar del suero.

5. Destapar el tubo. Aspirar el suero


con una pipeta Pasteur respectivo chupn. y su

433

6.

Depositar el suero en el frasco estril de 10 mI. Colocar inmediatamente la tapa rosca en el frasco. Los tubos no deben llenarse totalmente, con el fin de evitar que se destape el tubo.

7.

Debe poner posteriormente en prctica los principios generales para envo de muestras.

8.

Asegurarse que el tiempo de transporte no sea mayor de 3 das.

9.

La mayor parte de sueros se pueden conservar en el congelador de la refrigeradora a -2C o temperaturas inferiores, por lo menos durante 1 mes.

434

PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE HECES PARA LA DETECCIN DE PARSITOS

Cuando fuera necesario enviar al laboratorio de referencia muestras de heces para que se identifiquen parsitos que son difciles de reconocer, se utilizan los preservantes siguientes: Solucin de formaldehdo al 10% para hacer preparaciones lquidas. MIF (Merthiolate-iodine-formol) para hacer preparaciones lquidas. Alcohol polivinlico (APV), para hacer tinciones permanentes.

MTODOS a. Uso de la solucin de formaldehdo al1 0%

1.

Preparar una mezcla de 1 parte de heces y 3 partes de solucin de formaldehdo.

2. Con un agitador de vidrio disgregar


completamente las heces.

3. Las muestras se preservan por


tiempo indefinido si el frasco se cierra hermticamente.

4.

Se preservan huevos y quistes de parsitos.

435

b. Uso de MIF

l.

Mezclar en un tubo o frasco pequeo: 4,4 mI de solucin de MIF con 0,3 mI de solucin yodada de Lugol.

2.

Agregar una porcin de heces aproximadamente 2 mI.

3. Con un agitador de vidrio disgregar


completamente las heces.

4.

Se preservan todas las formas de parsitos, incluso las formas vegetativas de amebas. Las muestras se preservan por tiempo indefinido.

c. USO de alcohol polivin1ico (APV)

EN UN FRASCO l.
Vierta en un frasco, aproximadamente 30 mI de fijador APV hasta que llene las tres cuartas partes de su capacidad. Aadir heces hasta llenar la ltima cuarta parte de la capacidad del frasco.

436

2.

Disgregar completamente las heces con un agitador de vidrio.

3.

Se preservan todas las formas de parsitos, por tiempo indefinido.

EN UN PORTAOBJETO l.
Para observar amebas y flagelados colocar una pequea porcin de la muestra de heces en un extremo del portaobjetos. Agregar a esta porcin 3 gotas de APV.

2. Con un agitador de vidrio extender


con cuidado esta mezcla hasta la mitad del portaobjeto.

3.

Dejarlo secar durante 12 horas. (preferible a 37C).

4.

Se preservan, as preparados hasta por tres meses. La tincin se aplicar al recibidos en el laboratorio de referencia.

437

PROCEDIMIENTOS PARA ENVO DE HECES PARA EXAMEN BACTERIOLGICO

A veces es necesario enviar muestras de heces al laboratorio de referencia con el fin de realizar un cultivo para: Detectar vibriones de clera. Identificar otras bacterias (salmonella, shigella, etc.).

Para ambos casos se puede usar la misma forma de transporte, en el medio de Cary y Blair.

SIEMBRA Y ENVO DE MUESTRAS

EN EL MEDIO DE TRANSPORTE CARY Y BLAIR


Se conservan hasta 4 semanas numerosos tipos de bacterias entricas.

Mientras no se use este medio de transporte se deber guardar a la temperatura ambiente durante 8 - 12 semanas, en frascos o tubos hermticamente cerrados.

l.

Una vez obtenida la muestra de heces depositar el hisopo con la muestra en un frasco que contenga medio de Cary y Blair (hasta 3/4 partes de su capacidad).

2.

En estas condiciones de transporte, el microorganismo patgeno permanece viable hasta por 4 semanas a temperatura ambiente.

438

ENVO DEL CULTIVO DE BK A UN LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL O NACIONAL

PRINCIPIOS GENERALES
El envo de cultivos al laboratorio de referencia tiene por objetivo: Realizar estudios de sensibilidad a medicamentos antituberculosos. Tipificacin de mycobacterias.

Para el envo de cultivos, estos deben cumplir los siguientes requisitos: Deben estar acompaados de sus respectivas fichas debidamente llenadas. Tener anotado en el tubo un nmero de identificacin y la fecha de siembra. No tener menos de 30 ni ms de 60 das contados a partir de la fecha de siembra. El nmero de colonias por tubo no deber ser menor de 10 colonias claramente diferenciadas. El medio no deber estar alcalinizado (color amarillo), acidificado (color azul oscuro) ni contaminado con hongos. El tubo de cultivo no deber contener lquido ni el medio licuado. Para el transporte de cultivos deber tomarse en cuenta todas las medidas de bioseguridad necesarias. Asimismo, debern protegerse los cultivos durante su transporte del calor excesivo y de la luz solar. Poner una etiqueta con la direccin correcta del laboratorio de referencia.

439

PROCEDIMIENT0S PARA ENVO DE SECRECIN URETRAL

Cuando fuera necesario enviar muestras de secrecin uretral para diagnosticar enfermedades de transmisin sexual a un laboratorio de referencia se usar un medio de transporte. El medio de Transgrow- Tg. El medio de transporte de Stuart.

MATERIALES
Medio de transporte y crecimiento de Transgrow - Tg o de Stuart. Asa bacteriolgica o hisopo con la muestra.

SIEMBRA Y ENVO DE MUESTRAS

a. El medio de transporte Transgrow - Tg


Un frasco de 30 mI, contiene 8 mI del medio slido (en un lado del frasco) y est lleno con una mezcla de aire (90%) Y bixido carbnico (10%). Cada frasco deber permanecer abierto el menor tiempo posible para evitar que escape el gas. Colocar el frasco en posicin vertical. Desenroscar la tapa del frasco. Sosteniendo el frasco tan verticalmente como sea posible (para evitar que escape el gas) frotar el hisopo con la muestra en toda la superficie del medio slido, de un extremo del frasco al otro, comenzando por el fondo. Colocar la tapa en el frasco inmediatamente.

l. 2.

440

3.

Enviar el frasco a temperatura ambiente.

4.

Esta preparacin se conserva hasta 3 das, sin embargo, es conveniente que se enve cuanto antes. Este medio de transporte tambin es adecuado para meningococos.

5.

b. El medio de transporte semislido de Stuart


El medio de transporte semislido de Stuart se almacena en frascos de 5 mI con tapa.

1.

Sostener el hisopo con la muestra con una pinza estril (flameada).

2. Introducir el hisopo en el frasco que


contiene el medio de transporte. Cortar la porcin excedente de la varilla del hisopo con tijeras estriles (flameadas).

3.

Enroscar la tapa en el frasco inmediatamente.

4.

El tiempo de conservacin a temperatura ambiente es de 6 horas.

441

c. Medio de transporte en pipeta Pasteur

1.

Aspirar la muestra de secrecin al interior de una pipeta de Pasteur estril taponada con algodn.

2.

Colocar la pipeta dentro de un tubo vaco estril protegiendo los extremos de la pipeta con algodn.

3.

El tiempo de conservacin a temperatura ambiente es de 6 horas.

442

REGISTRO DE LAS MUESTRAS. REGISTRO DEL LABORATORIO E INFORMES DIARIOS Y MENSUALES

PRINCIPIOS GENERALES

Se debe hacer una relacin numerada de todas las muestras y resultados del laboratorio. De esta manera: Se evita el riesgo de confundir muestras. Se puede localizar fcilmente los resultados.

El laboratorio debe contar con:

Fichas impresas de exmenes de laboratorio que acompaen a las muestras. Un registro donde se anoten los detalles concernientes a las muestras y los resultados obtenidos. Planillas para elaborar informes mensuales.

NUMERACIN DE MUESTRAS
A cada muestra, tan pronto como se reciba, se le asignar el nmero que le corresponda al anotarlo en el registro. Ese mismo nmero debe anotarlo inmediatamente en: La ficha de la solicitud. El recipiente de la muestra. Cada tubo de ensayo que se emplee con la muestra. Cada portaobjetos que se utilice con la muestra.

De esta manera se evitarn las confusiones.

443

LOS REGISTROS DEL LABORATORIO

REGISTRO DE PRUEBAS EFECTUADAS Y REMITIDAS


Los registros comprenden cuadernos de notas con pginas numeradas y cubiertas resistentes. Se anotar a cada muestra el nmero correspondiente en el registro para ese tipo de muestra. Asimismo, se colocar datos especficos como nombre y apellidos del solicitante, fecha de recepcin de muestra y remisin de resultados, etc. Es preferible contar con registros separados para los diferentes anlisis. Por ejemplo: Registro de hematologa. Registro de orina. Registro de parasitologa. Registro de bacteriologa, etc.

LOS INFORMES DIARIO Y MENSUAL


Ayudan a llevar la cuenta de las actividades de los laboratorios y es til para: Solicitar insumos. Elaborar presupuesto. Conocer la ganancia y demanda mensual de los laboratorios, as como el nivel de exoneracin de pago. Toda esta informacin es til para el responsable del laboratorio, para su administracin. Es de gran ayuda para el sistema de Red de laboratorios ya que notifica el nmero de resultados positivos referente a diversas enfermedades transmisibles. En el captulo de anexos se presentan la hoja de informe diario y mensual, as como las fichas para informe mensual de tuberculosis, malaria, etc. que deben ser remitidas segn corresponda.

444

CAPITULO XII

ANEXOS
ANTICOAGULANTES.................................. 465 EDTA.................................................... 465 Heparina............................................... 465 Anticoagulante de Wintrobe ................. 466 Citrato de sodio .................................... 466 Precauciones al usar anticoagulantes .. 466 REACTIVOS V SOLUCIONES..................... 467 Agar sangre al 6% ................................ 467 Agua amortiguada ................................ 467 APV (Alcohol polivinfllco) ..................... 467 Caldo Infusin cerebro corazn (BHI) .. 468 Cary y Blair, medio de transporte ......... 468 Drabkin, para dilucin........................... 469 Fenol acuoso al 5% .............................. 469 Formaldehrdo, solucin al1 0% ............ 470 Formo ................................................... 470 Giemsa, colorante ................................ 470 Glemsa diluido, colorante Leishman, colorante ............................. 471 Lugol (Solucin yodo - yodurada)......... 471 Medio bifslco Usmaru (NNN modificado) ................................. 472 MIF (Merthlolate - lodine - Formol) ....... 472 NNN, medio de cultivo.......................... 473 Preparacin de los reactivos para la tlncin Gram ........................................ 473 Preparacin de los reactivos para la tincln Zlehl y Neelsen ......................... 474 Prueba de Identificacin de carbohidratos para neisseeria gonorrhoeae................ 475 Prueba de la oxidasa............................ 476 Prueba de superoxol ............................ 476 Reactivos usados para el mtodo de la glucosa oxidasa.................................... 477 Reactivos usados para medir creatinina en plasma o suero ..................................... 477 Reactivos usados para medir fosfatasa alcalina ................................................. 478 Reactivos usados para medir potasio en sangre .................................................. 479 Reactivos usados para medir sodio en sangre .................................................. 482 Reactivos usados para medir transaminasas en sangre ..................... 483 Reactivos usados para medir rea en sangre .................................................. 484 Solucin amortiguadora para VDRL ..... 485 Solucin amortiguadora tamponada..... 486 Solucin de citrato trisdico (38 g/l) (3,8%)....................................... 486 Solucin de citrato y formaldehdo ....... 486 Solucin de cloruro de sodio (0,85%)(solucin salina isotnica) ........ 486 Solucin de sulfato de zinc (Faust)....... 487 Solucin salina al 0,9% ........................ 487 Solucin salina al 10% ..........................487 Solucin salina ms antibiticos (antibitico concentrado).......................487 Solucin yodurada de Lugol al 1 %.......488 Wright, colorante ...................................488 ESQUEMA DE INOCULACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS QUE PROVOCAN DIARREA .................................489 IDENTIFICACIN DEL GNERO SHIGELLA.....................................................490 IDENTIFICACIN DE ECHERICHIA COLI ...490 USO DE DISCOS PARA ANTIBIOGRAMAS 491 RED DE LABORATORIOS-FLUXOGRAMA DE MUESTRAS ..................................................492 RED DE LABORATORIOS -FLUXOGRAMA DE RESULTADOS ..............................................493 REGISTROS DE MUESTRAS PARA INVESTIGACIN BACTERIOLGICA EN TBC .........................................................494 INFORME MENSUAL DE BACILOSCOPA y CULTIVO.......................................................495 LIBRO DE REGISTRO DE MUESTRAS PARA INVESTIGACIN DE MALARIA POR GOTA GRUESA ...................................496 INFORME MENSUAL DE GOTA GRUESA ..497 HOJA DE INFORME MENSUAL DE LABORATORIO ............................................498 BIBLLOGRAFIA ...........................................501 GLOSARIO DE TRMINOS .........................505 INDICE ALFABTICO ..................................507 ILUSTRACIONES EN COLOR .....................513 Glbulos rojos o eritrocitos....................513 Glbulos blancos o leucocitos...............514 Plasmodium vivax(Frotis)......................515 Plasmodium ovale (Frotis) ....................515 Plasmodi'.HTI falclparum (Frotis) ..........516 Plasmodium malariae (Frotis) ...............516 Plasmodium vivax (Gota gruesa) ..........517 Plasmodium falciparum (Gota gruesa)..517 Preparacin de heces en fresco............518 Entamoeba histolytica ...........................518 Entamoeba coll .....................................519 Endollmax nana ....................................519 Giardia lamblla ......................................520 Frotis de heces Hematoxilina .............521 Mycobacterium tuberculosis..................522 Neisseria gonorrhoeae..........................488 Huevos de fasciola heptica .................522 Huevos de helmintos.............................523 Huevos de scaris lumbricoides............523 Estructuras que se confunden con huevos y/o larvas de parsitos ..........................524

445

ANTICOAGULANTES

EDTA
Son sales sdicas y potsicas del cido etilendiaminotetractico (EDT A). Se utiliza 0,2 mI de esta solucin en frascos de 2 mI o una gota para 5 mI de sangre. Poner a secar en estufa a 37C hasta que se observe un polvo blanco. Se utiliza para: Recuento de plaquetas en cmara. Efectuar dosaje de hemoglobina, hematocrito. Efectuar recuento de glbulos rojos y blancos. Identificacin de grupos sanguneos.

Sus ventajas son: Impide la formacin de "artefactos" incluso despus de un reposo prolongado. Conserva la sangre hasta 2 - 3 horas a temperatura ambiente y hasta 24 horas si es refrigerada a 4 C.

HEPARINA
Los tubos con heparina se pueden obtener en el comercio. Se utiliza 0,1 - 0,2 mg para 1 mI de sangre. Es el mejor anticoagulante para prevenir la hemlisis y para las pruebas de fragilidad osmtica. No se usa para el recuento de leucocitos, ni para extensin de sangre porque produce un fondo azul en las preparaciones de Wright.

446

ANTICOAGULANTE DE WINTROBE
Se prepara disolviendo 1,2 g de oxalato de amonio y 0,8 g de oxalato de potasio en agua destilada diluyendo con 100 mI. Se utiliza 0,1 mI de esta solucin por 1 ml de sangre. Poner a secar en estufa a 37C hasta que se observe un polvo blanco. Se usa para el recuento plaquetario porque permite la formacin de agregados plaquetarios.

CITRATO DE SODIO
Se prepara disolviendo 3,8 g de citrato de sodio en agua destilada diluyendo hasta 100 ml. Se usa para el estudio de la velocidad de sedimentacin (1 parte de citrato para 4 partes de sangre), para efectuar pruebas de tiempo de protrombina, de trombina, de tromboplastina determinacin de fibringeno (combina 1 parte de citrato para 9 partes de sangre).

PRECAUCIONES AL USAR ANTICOAGULANTES


Mezclar inmediatamente despus de depositar la sangre en el tubo con anticoagulante, invirtiendo el tubo o frasco varias veces con suavidad y uniformidad. No agitar el contenido. Usar recipientes limpios y secos antes de aadir el anticoagulante. Los residuos de detergente disuelven los glbulos rojos. Las EDTA son estables a temperatura ambiente, pero el citrato de sodio y la heparina se deben conservar en la refrigeradora, son poco estables en climas clidos. Usar las proporciones correctas. Utilizar recipientes y tubos graduados o colocar etiquetas en ellos de modo que el borde superior de stas quede al nivel de la cantidad de sangre que se requiera.

447

REACTIVOS Y SOLUCIONES
AGAR SANGRE AL 6%
1. Medio agar base de sangre (comercial) Agua destilada Sangre de cordero desfibrinada pH final 40 g. 1 000 ml. 60 ml. 6,8+/0,2

Mezclar bien la media base en el agua destilada y calentar agitando frecuentemente hasta que hierva durante un minuto para disolver completamente el medio. Usar la autoclave a 121 C durante 15 minutos. Cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 45 - 50C, aadir la sangre desfibrinada de cordero, agitar para obtener una mezcla uniforme y repartir 20 mI en placas Petri estriles. Controlar su esterilidad durante 24 horas a 37C.

2. 3.

4.

AGUA AMORTIGUADA
Ortofosfato dis6dico anhidro (NazHP04) Ortofosfato monopotsico (KH2P04) 4 g. 5 g.

Mezclar bien, disolver 1 g de la mezcla en 1 litro de agua destilada y ajustar al pH 7,2

APV (ALCOHOL POLlVINILlCO)

SOLUCIN 1
cido actico glacial Glicerol Bicloruro de mercurio al 6% 2 V cido actico glacial al 5 % Alcohol etI1ico al 95% 1 V 5,0 1,5 60,0 4,5 30,0 ml ml ml ml ml

448

SOLUCIN SCHAUDINN
Solucin Schaudinn 93,5 mI.

SOLUCIN 2
Alcohol polivinlico (APV) 5,0 g.

Preparar la solucin 1 y agregar caliente la solucin Schaudinn a 75C. Agregar el APV, mientras se agitan las soluciones en forma constante.

CALDO INFUSIN CEREBRO CORAZN (BHI)


l. Infusin de cerebro de ternera Infusin de corazn de vacuno Peptona proteosa Dextrosa Cloruro de sodio Fosfato de sodio dibsico Agua destilada pH final 200 g. 250 g. 10 g. 2 g. 5 g. 2,5 g. 1000 ml 7,4 +/-0,2

Mezclar los ingredientes en agua destilada y calentar agitando frecuentemente hasta que hierva durante un minuto para que se disuelva por completo. Distribuir 8 ml del medio en tubos tapa rosca de 16 x 125. Usar el autoclave a 121C durante 15 minutos. Controlar la esterilidad del medio durante 24 horas a 37C.

2. 3. 4.

CARV Y BLAIR, MEDIO DE TRANSPORTE


Fosfato disdico Cloruro de sodio Tioglicolato de sodio Agar Agua destilada pH final 1,1 g. 5,0 g. 1,5 g. 5,0 g. 991,0 ml 8,4.

449

l. 2.

Colocar todos los ingredientes en un baln con el agua destilada. Se calientan en bao mara hasta que la solucin est clara (no se permite que hierva). Enfriar hasta 50C. Agregar 9 mI de solucin de cloruro de calcio al1 % recin preparado y se ajusta el pH a 8,4 con hidrxido de sodio (NaOH) ION. Colocar cantidades de 5 a 7 mI del medio de transporte preparado en tubos de 13 x 100 mm, estriles, con tapa de rosca (aflojado). Colocar los tubos conteniendo el medio de transporte a 100C en bao mara, hirviendo durante 15 minutos. Enfriar y apretar las tapas despus de la esterilizacin a vapor.

3. 4.

5.

6.

DRABKIN, PARA DILUCIN


El lquido de Drabkin para dilucin se puede preparar con tabletas reactivas que se adquieren directamente del fabricante, que se acompaan de las instrucciones pertinentes.

FENOL ACUOSO Al 5%
cido fnico (cristales) Agua destilada 1 100 Kg. ml

SOLUCIN STOCK
Al cido fnico, agregar 100 ml de agua destilada y calentar10 en bao mara, obteniendo 1 100 ml de fenol acuoso.

450

SOLUCIN DE TRABAJO
Tomar 55 ml de la solucin stock y completar con 945 ml de agua destilada, obteniendo 1 000 ml de fenol acuoso al 5%. Conservar en un frasco de color mbar.

FORMALDEHDO, SOLUCIN AL 100/0


Solucin comercial de formaldehdo, por lo menos al 37% ("formalina") Agua destilada 100 ml 300 ml

El formaldehdo es corrosivo y txico.

FORMOL
El formol comercial contiene aproximadamente 40% de peso de formaldehdo. Se le considera como formalina al 100% Y partiendo de l se hacen las diluciones que se requieran.

GIEMSA, COLORANTE

SOLUCIN STOCK (SOLUCIN MADRE)


l. Colorante Giemsa en polvo Alcohol metI1ico Glicerina 0,75 65, 35,0 g. ml ml

Disolver el colorante Giemsa en un frasco oscuro con perlas de vidrio, agregar el alcohol metlico y la glicerina. Agitar el frasco hasta lograr una mezcla homognea. Mantener el frasco tapado por 3 das. Usar despus del tercer da, previa filtracin del preparado.

2. 3. 4.

451

GIEMSA DILUIDO, COLORANTE


Solucin stock (Giemsa, colorante) Agua destilada o buffer fosfato (PBS) 1 9 ml. ml.

Mezclar antes de usar. BUFFER FOSFATO (PBS) Fosfato dibsico de Sodio (Na2HP04) 6 g. 5 g. Fosfato monobsico de Potasio (KH2P04) Mezclar las sales, pesar 1 g de la mezcla y distribuir en tubos. Disolver el contenido de cada uno de los tubos en un litro de agua destilada. El pH final es de 7,2.

l. 2.

LEISHMAN, COLORANTE
Colorante de Leishman Metanol c.s.p. 1,5 1000 g. ml

Enjuagar con metanol un frasco limpio. Colocar en su interior perlas de vidrio limpias y secas. Aadir el colorante y el metanol, hasta disolver bien. As el colorante estar listo para su uso. Es importante impedir la humedad durante su elaboracin y su posterior conservacin.

LUGOL (SOLUCIN YODO - YODURADA)


Yodo metlico Yoduro de potasio Agua destilada 5 10 100 g. g. ml

l. 2.

Preparar de la misma manera que la solucin yodurada de Lugol. Conservar en un frasco oscuro.

452

MEDIO BIFSICO USMARU (NNN MODIFICADO)


Agua destilada c.s.p. Agar sangre base Antibitico concentrado Sangre de conejo desfibrinada estril 100 4 1 15 ml g ml ml

l. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Diluir el agar sangre en 100 mI de agua destilada y usar el autoclave. Dejar enfriar a temperatura ambiente. Sacar 15 mI de agar y agregar 15 ml de sangre desfibrinada, cuando el medio est a 56C. Agregar 1 ml de antibitico concentrado. Homogenizar y repartir aproximadamente 1 mI del medio en tubos de 13 x 100. Colocar los tubos en plano inclinado y dejar enfriar. Controlar a 37C por 24 horas. Guardar los tubos a 4C hasta el momento de su uso. Se recomienda usar tubos conservados en refrigeracin hasta por 15 das. Pasados los 15 das preparar nuevos medios de cultivo.

MIF (MERTHIOLATE - IODINE FORMOL)


SOLUCIN MADRE Tintura de tiomersal, 1: 1000 (Merthiolate) Solucin de formaldehdo (N 1) Glicero Agua destilada 200 25 l5 250 ml ml ml ml

l. 2.

Mezclar y conservar en un frasco oscuro hasta 3 meses. Preparar solucin yodurada de Lugol, 50 g/l (5%) Yodo Yoduro de potasio (KL)

5 10

g. g.

Agua destilada c.s.p. 100 ml. Preparar de la misma manera que la solucin yodurada de Lugol (N2). Guardar en un frasco oscuro por un mes.

453

3.

Cuando se vaya a usar, mezclar: Solucin madre de tiomersal Solucin yodurada de Lugol (5%) 50 gil 9,4 0,6 ml ml

NNN, MEDIO DE CULTIVO


Bacto agar Cloruro de sodio Agua destilada Sangre desfibrinada de conejo Solucin stock de antibiticos 1,4 0,6 90 13,5 1 g. g. ml ml ml

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS PARA LA TINCIN GRAM


VIOLETA CRISTAL Solucin A Violeta cristal (certificada) Alcohol de 95 Solucin B Oxalato de amonio Agua destilada 0,8 80 g. ml 2 20 g. ml

l.

Mezclar las dos soluciones A y B. Guardar la mezcla por 24 horas antes de usar. Filtrar en un frasco para tincin con un filtro de papel. Esta solucin puede durar 2 3 aos. SOLUCIN DE LUGOL PARA TINCIN GRAM Yodo Yoduro de potasio (KI) Agua destilada 1 2 300 g. g. ml

2.

l.

Pulverizar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio secos.

454

2.

Aadir el agua destilada poco a poco, algunos mililitros cada vez, y mover hasta que el yodo y el yoduro se disuelvan. Verter esta solucin en un frasco de vidrio oscuro y mezclado con el resto de agua destilada. SOLUCIN DE SAFRANINA Solucin madre Safranina O (certificada) Alcohol de 95 o Solucin de trabajo Solucin madre Agua destilada c.s.p. 2,5 100 10 90 g. ml ml ml

3.

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS PARA LA TINCIN ZIEHL Y NEELSEN


FENOL ACUOSO Fenol cristalizado Agua destilada

l.

Agregar al fenol cristalizado el agua destilada. Calentar en bao mara hasta la completa disolucin y enfriar. El fenol acuoso se mantiene lquido. FUCSINA FENICADA Fucsina bsica Alcohol de 95 Fenol acuoso Agua destilada c.s.p. 3 100 55 1000 g. ml ml ml

l. 2.

Disolver por agitacin la fucsina bsica en alcohol de 95 o. Agregar el fenol acuoso, agitar y agregar agua destilada hasta completar 1 litro. Dejar reposar por 24 horas y luego filtrar.

455

AZUL DE METILENO Azul de metileno Alcohol de 95 Agua destilada c.s.p. 1 100 1000 g. ml ml

l.

Disolver por agitacin el azul de metileno con el alcohol de 95 . Agregar agua destilada hasta completar 1 litro. Dejar reposar por 24 horas. Filtrar antes de usar. SOLUCIN DECOLORANTE cido clorhdrico Alcohol de 95 30 970 ml ml

2.

Con la pipeta dejar escurrir el cido clorhdrico por las paredes del matraz, que contiene el alcohol, agitar suavemente hasta completar la mezcla. Los reactivos deben conservarse en un frasco de color mbar. Se recomienda preparar los colorantes para un consumo no mayor de un mes. Todos los reactivos deben filtrarse cada vez que sean transferidos a los pequeos frascos cuentagotas que se emplean para la tincin. Esto es especialmente necesario para la fucsina fenicada.

PRUEBA DE IDENTIFICACIN NEISSEERIA GONORRHOEAE

DE

CARBOHIDRATOS

PARA

MEDIO BASE AGAR CISTINA TRIPTICASA El medio base agar cistina tripticasa contiene (Difco o BBL): Triptosa Cistina - L Cloruro de sodio Sulfito sdico Agar Rojo de fenol ph final 20 0,5 5 0,5 2,5 g. g. g. g. g.

0,017 g. 7,3 +/0,2 a 25C

456

Agua destilada Esterilizados por filtracin.

1 000 ml.

Carbohidratos (0,5 1 %): glucosa, lactosa, maltosa, sacarosa y fructosa.

1. 2. 4. 5. 6.

Disolver el medio en el agua destilada. Aadir los carbohidratos al medio base. 3. Repartir en tubos pequeos. Inocular las colonias del agar chocolate a los tubos con carbohidratos, por puntura profunda. Incubar 18 - 24 horas a 37C en aerobiosis (sin CO2). Realizar la lectura mediante el cambio de color del indicador rojo de fenol. Se considera positiva la produccin de cido cuando el indicador rojo de fenol ha cambiado de rojo a amarillo.

PRUEBA DE LA OXIDASA

1. 2. 3. 4.

Preparar el reactivo N,N,N,N, tetrametil-p-fenilendiamine al1 %, en un tubo o en un frasco color mbar. Humedecer un pedazo de papel filtro con el reactivo preparado. Tomar una porcin de la colonia sospechosa con un palito de madera o un alambre de platino. Colocarlo haciendo una estra sobre el papel de filtro, esperar la reaccin 30 segundos. Si la reaccin es positiva el papel tomar un color azul violceo, y si es negativa no habr cambio de color en el papel.

PRUEBA DE SUPEROXOL
PRUEBA DE LA CATALASA USANDO PERXIDO DE HIDRGENO AL 30%

1. 2.

Depositar una gota del perxido de hidrgeno en una lmina portaobjeto. Con el asa de siembra colocar una porcin de la colonia sobre la gota.

457

3.

Observar inmediatamente. La presencia de burbujas indicar que la prueba es positiva.

REACTIVOS USADOS PARA EL MTODO DE LA GLUCOSA OXIDASA


SOLUCIN DE FOSFATO MONOSDICO 0,5 M NaH2P03 Agua destilada pH final 76 g 1000 ml 7,0 ajustar con hidrxido de sodio.

REACTIVO ENZIMA-COLOR Glucosa oxidasa Peroxidasa O-dianisidina en alcohol de 95 o (al 1 % ) 125 5 0,5 mg mg ml

Preparado para 100 ml de solucin de fosfato. Una vez preparado debe conservarse en el refrigerador.

REACTIVOS USADOS PARA MEDIR CREATININA EN PLASMA O SUERO


SOLUCIN ALCALINA DE PICRATO Hidrxido de sodio al 10 por 100 p/v Solucin saturada de cido pcrico 2 10 ml ml

Mezclar la solucin de hidrxido de sodio con la solucin saturada de cido pcrico. El color del picrato a1calino no debe ser ms de 2 veces intenso que el de la solucin de cido pcrico.

458

SOLUCIN PATRN CONCENTRADA DE CREATININA Creatinina pura 1 g

cido clorhdrico N/l0 c.s.p. 1000 ml Disolver ambos ingredientes y completar 1 litro con el mismo solvente.

SOLUCIN PATRN DE CREATININA Solucin patrn concentrada de creatinina Agua destilada 1 100 ml ml

Esta solucin debe prepararse cada semana.

REACTIVOS USADOS PARA MEDIR FOSFATASA ALCALINA


BUFFER pH 10,5 Glicocola Cloruro de magnesio NaOH 0,1 N Agua destilada c.s.p. 7,5 95 85 1 000 g. mg. ml. ml.

l.

Mezclar los dos primeros ingredientes; luego aadir el NaOH 0,1 N Y completar a 1 000 ml con agua destilada. En caso necesario ajustar el pH con NaOH 0,1 N o con HCl 0,1 N. Como conservador se agrega unas gotas de cloroformo. Es estable un ao en el refrigerador. SUSTRATO 0,012 M

l.

Disolver 400 mg de p-nitrofenilfosfato disdico tetrahidratado en agua destilada y completar hasta 100 ml. Es estable 8 semanas en el congelador. HIDRXIDO DE SODIO 0,02 N Disolver 800 mg de NaOH y completar con agua destilada hasta 1000 ml.

459

SOLUCIN TESTIGO DE P-NITROFENOL p-nitrofenol NaOH 0,1 N Agua destilada c.s.p. 0,0835 g 6 100 ml ml

l. 2.

Mezclar el p-nitrofenol con el NaOH 0,1 N. Diluir en matraz de 100 ml hasta 90 ml con agua destilada y aadir gota a gota HCI 1 N hasta que la solucin adquiera un tinte amarillo plido. Completar a 100 ml con agua destilada. Es estable un ao en el refrigerador.

3.

SOLUCIN TESTIGO DE TRABAJO 0,06 mM/ml

l.

Diluir 1 ml de la solucin testigo de p-nitrofenol con NaOH 0,02 N hasta 100ml. Esta solucin debe prepararse antes de su uso.

REACTIVOS USADOS PARA MEDIR POTASIO EN SANGRE

REACTIVO DE COBALTONITRITO DE SODIO Solucin A Nitrato de cobalto cido actico glacial Agua destilada Solucin B Nitrato de sodio Agua destilada 120 180 g ml 25 12,5 50 g ml ml

460

l. 2. 3.

Para la solucin A, disolver el nitrato de cobalto en agua destilada, luego se agrega el cido actico glacial. Para la solucin B, disolver en otro matraz el nitrato de sodio en agua destilada. Agregar 210 ml de la solucin B a la totalidad de la solucin A. Agitar bajo campana hasta que se ha eliminado el xido nitroso y filtrar. Este reactivo se conserva en el refrigerador y dura aproximadamente un mes.

SOLUCIN SEMISATURADA DE ACETATO DE SODIO Acetato de sodio trihidratado Agua destilada calentada 45C 130 100 g ml

l.

2.

Agregar al acetato de sodio trihidratado al agua destilada calentada previamente a 45C. Agitar bien y colocar la mezcla en la estufa a 37C durante la noche. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente dejando que sedimente el precipitado. Diluir con otros 100 ml de agua destilada.

SOLUCIN LAVADORA SATURADA CON COBALTONITRITO DE SODIO YPOTASIO K2S04 Agua destilada Solucin semi saturada de acetato de sodio Reactivo de cobaltonitrito de sodio 70 100 25 12,5 mg ml ml ml

l.

2. 3.

Disolver K2S04 en el agua destilada. Agregar lentamente la solucin semisaturada de acetato de sodio y el reactivo de cobaltonitrito de sodio. Mezclar bien. Dejar reposar por 30 minutos. Filtrar lavando el precipitado 2 veces con alcohol etlico de 70 y una vez ms con alcohol de 95, saturando luego con alcohol etlico de 10 con el precipitado, y dejar el resto de ste en el fondo del frasco sin descartarlo. Para su uso tomar una pequea porcin del lquido sobrenadante de ese frasco y filtrar antes de utilizado.

461

REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU Tungsteno de sodio Molibdato de sodio cido fosfrico a185% cido clorhdrico concentrado Sulfato de litio Bromo Agua destilada 100 25 50 100 150 23 750 g g ml ml g gotas ml

l. 2.

Usar un erlenmeyer de 2 litros. Colocar el tungsteno de sodio y el molibdato de sodio con 700 ml de agua destilada. Agitar y, una vez disuelto el contenido, agregar el cido fosfrico al 85% y el cido clorhdrico concentrado. Hervir esta mezcla durante 10 minutos. Aadir el sulfato de litio, 50 ml de agua destilada y 2 3 gotas de bromo; se hierve la mezcla durante 15 minutos para separar el exceso de bromo, se enfra, se diluye hasta 1 litro. Filtrar. El reactivo debe tener color amarillo, sin tinte verdoso. Se conservar en el refrigerador. Si durante su conservacin adquiere un color verdoso, hay que tratarlo nuevamente con bromo.

3.

4.

REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU PARA EL USO Se debe preparar antes de su uso diluyendo un volumen de la solucin anterior con 2 volmenes de agua destilada.

SOLUCIN TESTIGO DE POTASIO 0,2 mglml Disolver 446 mg de K2S04 en 1000 ml de agua destilada.

462

REACTIVOS USADOS PARA MEDIR SODIO EN SANGRE


REACTIVO DE ACETATO DE URACILO Y ZINC

Solucin A Acetato de uracilo cido actico glacial Agua destilada Solucin B Acetato de zinc cido actico glacial Agua destilada 15 0,5 25 g ml ml 5 1 25 g ml ml

l.

Para la solucin A, disolver el acetato de uracilo en el agua destilada hirviendo que a la que se agreg el cido actico glacial. Para la solucin B, disolver en otro matraz el acetato de zinc en agua destilada hirviendo, a la que se agreg el cido actico glacial. Mezclar ambas soluciones mientras hiervan y calentar nuevamente hasta el punto de ebullicin. Dejar en reposo durante una noche y luego filtrarla. Mezclar la solucin filtrada con igual volumen de alcohol de 95 o, dejarlo durante 2 das en el refrigerador, al cabo de los cuales se filtra. El reactivo as preparado es estable a temperatura ambiente.

2.

3.

4.

SOLUCIN TESTIGO DE SODIO CON 0,64 mg de Na/ml Disolver 162 mg de NaCl en un matraz de 100 ml Y completar a volumen con agua destilada.

463

REACTIVOS SANGRE

USADOS

PARA

MEDIR

TRANSAMINASAS

EN

BUFFER DE FOSFATOS 0,1 M pH 7,4 Fosfato disdico Fosfato monopotsico pH final 210 40 7,4 ml ml

Mezclar ambas soluciones. Ajustar el pH con NaOH o HCL y aadir algunas gotas de cloroformo como conservador.

SOLUCIN PIRUVATO DE SODIO 2 mM/L PARA CALIBRACIN Disolver 22 mg de piruvato en c.s.p. 100 mL de buffer de fosfatos. Preparar el mismo da de su utilizacin.

SOLUCIN NaOH 0,4N Disolver 16 g de NaOH en lentejas en 1 litro de agua destilada.

SUSTRATO PARA OXALACTICA) Acido d-I-asprtico

TGO

(TRANSAMINASA

GLUTMICO

2,66 30 20,5 100

g mg ml ml

Acido alfa-cetoglutrico NaOH 1N Solucin buffer de fosfatos de pH 7,4 c.s.p

l.

Disolver ambos cidos en un erlenmeyer con NaOH IN hasta su disolucin completa. Transferir la solucin a un matraz de 100 ml lavando el erlenmeyer y completando a volumen con solucin buffer de fosfatos de pH 7,4. Aadir una gota de cloroformo como conservador y guardar a 4C.

2.

3.

464

SUSTRATO PARA TGP (TRANSAMINASA GLUTMICO PIRVICA) d-1-alanina cido alfa-cetoglutrico NaOH IN Solucin buffer de fosfatos de pH 7,4 c.s.p 78 30 0,5 100 g mg ml ml

l.

Disolver los primeros ingredientes en un erlenmeyer con NaOH IN hasta su disolucin completa. Transferir la solucin a un matraz de 100 ml lavando el erlenmeyer y completando a volumen con solucin buffer de fosfatos de pH 7,4. Aadir una gota de cloroformo como conservador y guardar a 4C. REACTIVO CROMGENO

2.

3.

l. 2.

Disolver 20 mg de 2-4 dinitrofenilhidrazina en HC1 1N y completar a 100 ml. Conservar en un frasco oscuro a 4C.

REACTIVOS USADOS PARA MEDIR REA EN SANGRE


REACTIVO DE FENOL (Rectivo 2) Fenol cristalizado Nitroprusiato de sodio Agua destilada c.s.p. 50 0,25 g g

1000 ml

Una vez praparado se guarda en un frasco oscuro en el refrigerador. REACTIVO DE HIPOCLORITO ALCALINO (Reavtivo 3) NaOH Hipoclorito de sodio

Agua destilada c.s.p. Guardar en un frasco oscuro en el refrigerador.

465

SOLUCIN TESTIGO DE REA rea H2S04 concentrado Agua destilada 1 0,14 500 g ml ml

l. 2. 3.

Disolver la rea en 250 ml de agua destilada, agregar el H2S04 concentrado. Completar a 500 ml con agua destilada. Guardar en el refrigerador. Es estable durante un ao.

SOLUCIN TESTIGO DE REA DE 60 mg/100 ml.

l.

Diluir la solucin stock con agua destilada acidificada, a fin de obtener una solucin de 60 mg/l00 ml de rea. Guardar en el refrigerador. Es estable varios meses.

2.

SOLUCIN AMORTIGUADORA PARA VDRL


Formaldehdo neutro de calidad analtica Fosfato disdico (Na2HP04) anhidro Fosfato monopotsico (KH2P04) Cloruro de sodio Agua destilada pH final 0,5 ml

0,093 g 0,170 g 10 1000 g ml

6,0+/-0,1

l.

Disolver las sales en agua destilada, primero el disdico, a continuacin el fosfato monopotsico y por ltimo el cloruro de sodio. Agregar la solucin de formaldehdo. Conservar en un frasco con tapa de rosca o tapn de vidrio.

2. 3.

466

SOLUCIN AMORTIGUADORA TAMPONADA


Hidrofosfato disdico (Na2HP042H20) Fosfato de potasio dihidrogenado (KH2P04) Agua destilada pH final 3,76 2,10 1000 7,2 g g ml

Para coloraciones de Giemsa, Leishman.

SOLUCIN DE CITRATO TRISDICO (38 g/l) (3,8%)


Citrato trisdico anhidro (behidrato o pentahidrato) Agua destilada c.s.p. 3,8 100 g. ml.

1. 2.

Usar 1 ml de la solucin para 4 ml de sangre. Conservar la solucin en una refrigeradora.

SOLUCIN DE CITRATO y FORMALDEHDO


Citrato de sodio Solucin comercial de formaldehdo, por lo menos al 37% (formalina) Agua destilada 1,0 ml 100,0 ml 3,0 g

El formaldehdo es corrosivo y txico.

SOLUCIN DE CLORURO DE SODIO (0,85%) (SOLUCIN SALINA ISOTNICA)


Cloruro de sodio Agua destilada c.s.p. 8,5 g

1000 ml

467

SOLUCIN DE SULFATO DE ZINC (FAUST)


Densidad 1 180. Disolver 300 g de sulfato de zinc (ZnSO4 7H20) en c.s.p. para 900 ml de agua destilada. Comprobar la densidad en un densmetro.

l.

2.

SOLUCIN SALINA AL 0,9%


Aadir 900 mg de cloruro de sodio a 100 ml de agua destilada.

SOLUCIN SALINA AL 10%


Aadir 1 O g de cloruro de sodio a 100 ml de agua destilada.

SOLUCIN SALINA CONCENTRADO)


MS

ANTIBITICOS

(ANTIBITICO

Sulfato de estreptomicina Penicilina sdica Agua destilada.

0,5 0,5 10

g g ml

l. 2. 3.

Mezclar y agitar hasta lograr una total dilucin. Filtrar con membrana 0,22 m. Usar 1 ml de solucin para 100 ml de solucin salina.

468

SOLUCIN YODURADA DE LUGOL AL 1 %


Yodo Yoduro de potasio Agua destilada c.s.p 1 2 100 g g ml

1. 2.

Disolver el yoduro de potasio en unos 30 ml de agua destilada. Agregar el yodo y mezclar hasta disolverlo. Aadir el resto de agua destilada (70 ml) Y mezclar bien. Conservar la preparacin en un frasco oscuro.

3.

WRIGHT, COLORANTE
Colorante de Wright Glicerol Metanol 0,3 3,0 97,0 g ml ml

Tener igual cuidado que con el colorante Leishman (ver pgina 471).

469

470

471

(*) Tambin Gram negativos

472

473

474

475

476

477

478

479

480

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484

GLOSARIO DE TRMINOS
BEAKER
Son recipientes cilndricos y cortos, con una depresin en el margen de la boca. Se usan para facilitar la mezcla de una solucin dada. Son de variadas medidas.

MATRACES Y ERLENMEYER
Son recipientes volumtricos de gran utilidad para la preparacin de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc. Los matraces se diferencian de los erlenmeyer, por tener base esfrica con fondo plano. En ambos el cuello termina en un reborde. Son de diferentes medidas.

C.S.P
"Cantidad suficiente para...".

EMBUDOS
Pueden ser de vidrio, porcelana o plstico. Se usan para transvasar lquidos en frascos de boca angosta. Existen de diferentes tamaos.

MECHEROS DE BUNSEN
Son de metal con una tuerca movediza en su extremo, para medir la intensidad de la llama.

PERLAS DE VIDRIO
De 4 - 6 mm de dimetro. Se emplean para desfibrinar sangre y pulverizar en la preparacin de antgenos.

FIOLAS
Recipientes para cantidades de medidas exactas. Se emplean en la preparacin de reactivos y soluciones de concentraciones conocidas.

PIPETAS
Son usadas para medidas de lquidos en pequeos volmenes.

FRASCOS GOTEROS
Son frascos de vidrio de color transparente claro, color mbar o caramelo. Tienen en la boca dos canales, uno frente a otro, por uno de los cuales sale lquido almacenado gota a gota. La tapa tambin tiene un canal y termina en un pico por donde cae el lquido. Se usan para colocar diversos lquidos de uso frecuente y en pequeas cantidades.

PIPETAS PASTEUR
Se emplean para la toma de pequeos inculos de siembra. Estn confeccionados de varillas de vidrio, de dimetro de 0,5 - 0,8 rnm. La calidad de vidrio debe facilitar el reblandecimiento a la accin directa de la llama del mechero, para conseguir por estiramiento la capilaridad deseada, es decir, es una pipeta con porcin capilar.

MANGOS DE KOLLE
Estn hechos de metal con una cubierta de ebonita aislante del calor. En el extremo proximal presenta una tuerca para insertar el alambre de platino o asa de siembra. Se utilizan para tomar muestras y hacer siembras de microorganismos.

PLACAS PETRI
Estn compuestas de dos piezas redondas de vidrio, de los cuales la ms grande hace de tapa. Las ms usadas son las de 150 x 100 rnm de dimetro. Se emplean para aislamiento y cultivo de microorganismos.

485

PROBETAS
Son recipientes cilndricos con base ancha, de paredes gruesas graduadas. Se usan para medir lquidos en la preparacin de cualquier solucin. Tienen capacidades de 100 a 1 000 mI.

TUBOS DE CENTRFUGA
Son de vidrio de paredes gruesas, graduados de medidas variables, pueden ser cnicos o cilndricos.

TUBOS DE PRUEBA TRPOD E


Son de metal, de preferencia de fierro. Son muy buenos soportes de recipientes sometidos al calentamiento. Hay de varias alturas y dimetros. Deben ser de vidrio, con o sin reborde. Las medidas son variables y se dan en rnm, considerndose el largo del tubo por el dimetro de la boca. Se utilizan para cultivos, soluciones, etc.

486

NDICE
Alcohol etlico, 33 Agua oxigenada, 34 Aglutinoscopio, 67 Antibiograma principios generales, 354 mtodo, 354 lectura, 354 Anticoagulantes precauciones, uso, 466 Agar sangre al 6%, 467 Agua amortiguada, 467 Alcohol polivinlico (APV), 467 Autoclave componentes, 55 procedimientos, 57

informe, 186 Brucelosis prueba de aglutinacin rpida en placa, 416 prueba de Rosa de Bengala, 419 prueba en tubo, 420 control de calidad, 423

C
Cloramina, 32 Centrfugas componentes, 62 manual, 63 elctrica, 63 Creatinina en plasma o en suero, 374, 477 Control de calidad baciloscopa, 440 malaria, 443 Citrato de sodio, 466 trisdico, 486 formaldehdo, 486 Cary y Blair, 468 Caldo infusin cerebro corazn (BHI), 468

B
Bioseguridad concepto, 15 niveles, 17 reglas importantes, 18 material recomendado, 24 Balanza de platillos, 60 analtica, 60 Baciloscopa preparacin, 178 coloracin, 182 lectura, 186

D
Desinfeccin mtodos, 26 desinfectantes qumicos, 31 Desechos

487

incineracin, 38 entierro, 39 Drabkin, para dilucin, 469

Giemsa colorante, 470 diluido, colorante, 471 Gota gruesa obtencin, 87, 286 (ver Sangre) coloracin de 1 a 10 lminas, 279 coloracin de ms de 10 lminas, 280 coloracin en bloque, 280 examen microscpico, 287, 286 densidad parasitaria, sistema de cruces, 289 por microlitro de sangre, 290 Gonorrea examen directo, 356 cultivo, 358 identificacin, 361 prueba de carbohidratos, 475 prueba de la Oxidasa, 476 prueba de Superoxol, 476 Glucosa mtodo de la glucosa oxidas a, 477

E
Esterilizacin mtodos, 27 Espectofotmetro, 66 Estufa, 29 Esputo recipientes, 40, 175 obtencin, 175,318 Embarazo mtodo del tubo de ensayo, 235 mtodo del portaobjetos, 235 EDTA, 465

F
Formaldehdo solucin al 10%, 470 Fenol acuoso al 5%, 469 Formol, 33,470 Frotis microorganismo, 324 Plasmodium, 284, 285 preparacin, 318 Fosfatasa alcalina, 478

H
Heces recipientes, 40, 241 obtencin, 239 examen directo, 265 examen de tincin con yodo, 266 examen con solucin salina, 266 examen de huevos de oxiuros, 269 mtodo de la cinta adhesiva, 269 mtodo de concentracin, 270 mtodo de flotacin de Faust, 270

G
Glutaral, 33 Gram preparacin, 473 tincin, 321,473

488

mtodo de sedimentacin de Ritchie, 272 examen bacteriolgico, 243 procedimiento de envo, 452 sangre oculta, 306 Hemocultivo principios generales, 350 lectura, 352 microorganismo s aislados, 353 Hemoglobinmetro de Sahli, 68 Heparina, 465 Hipoc1orito sdico, 32

solucin yodo-yodurada, 471

M
Material de vidrio nuevo, 70 sucio, 69 Microorganismos por grupos de riesgo, 16 Microscopio componentes, 47 conservacin, 51 Mycobacterium tuberculosis cultivo, 188 Lowenstein-Jensen, 191 Ogawa acidificado, 194 prueba de sensibilidad, 201 envo del cultivo, 456 Medios de cultivo principios generales, 329 medios nutritivos simples, 332 medios nutritivos enriquecidos, 334 medios selectivos, 335 medios de transporte, 339 siembra en medios de cultivo, por inoculacin, 342 por estra, 342 por dispersin - agotamiento, 34 3 por puntura, 343 lectura e informe de muestra cultivada, 344 una

I
Incubadora, 65 Informe diario y mensual, 461

L
Leishmaniasis obtencin de muestra, 293 biopsia, 296 aspirado, puncin-aspiracin, 30 2 linfa, 293 examen directo, 299, 298 cultivo, 301, 299 lectura e interpretacin, 303 intradermoreaccin, Leishmanina, 30 3 Leishman colorante, 471 Lugol

489

medio NNN, 473 medio USMARU (NNN modificado),472 MIF (Merthiolate - lodine - Formol), 472

Plasmodium vivax, 287, 285 Plasmodium fa lcipa rum , 287, 285, 29 2 Plasmodium malarie, 287, 285

O
Orina recipientes, 207 obtencin, 205 frotis, 209 tincin, 211 gravedad especfica, 226 medicin de pH, 229 uso de tabletas, 231 Red

Trichuris trichiura, 250, 257 Trichomonas hominis, 261 Taenia solium, 248, 257 Taenia saginata, 247, 257 Strongyloides stercoralis, 256 Potasio, 383 Potencimetro, 65

R
de laboratorios objetivos, 435 ubicacin por nivel de complejidad, Unidades recolectoras, 436 Laboratorios Locales, 436 Laboratorios Intermedios, 437 Laboratorio de Referencia Regional, 437 Laboratorio de Referencia Nacional, 439 Registro de muestras, 460 Rotador,6 8

P
Parsitos Amebas de vida libre. 260 Ancylostoma duodenale,250, 252 Ascaris lumbricoides.246, 253 Balantidium coli,264, 261 Diphyllobothrium latum,254 Entamoeba histolytica.259, 263 Entamoeba coli,263, 259 Enterobius vemicularis,255 Fasciola heptica,255 Giardia lamblia,260, 264 Hymenolepis nana, 255 Leishmaniasis,293 Necator americanus, 250, 252

490

S
Salmonella aglutinacin en placa, 427 aglutinacin en tubo, 429 control de calidad, 432 Sangre recipientes para toma de muestras, 77 obtencin de sangre venosa, 80 obtencin de gota gruesa, 87 obtencin de sangre capilar, 90 extensiones, 91 tincin de extensiones, 96 clulas sanguneas, 102 hemograma, 103 leucocitos o glbulos blancos recuento, 122 eritrocitos o glbulos rojos recuento, 126 hematocrito, 131 hemoglobina, 136 tiempo de coagulacin, mtodo Lee y White, 145 tiempo de sanga, mtodo de Duke, 142 tipificacin de grupos sanguneos, 148 velocidad de sedimentacin, 167 Sedimentos urinarios elementos microscpicos, 213 preparacin, 224 Solucin amortiguadora,

para VDRL, 485 tamponada, 486 cloruro de sodio 0,85%, 486 salina, isotnica, 486 0,9%, 487 10%, 487 ms antibiticos, 487 sulfato de zinc, 487 yodurada de lugol 1 %, 488 Suero obtencin y envo de suero, 449 Secreciones obtencin, vaginal, 316 uretral, 314 farngeas, 311 tica, 313 procedimiento de envo, 457 Trichomonas, examen directo, 275 Sfilis examen directo, 390 VDRL, 392 RPR (Reagina plsmatica rpida), 401 Sodio,

T
Transaminasas en sangre, 376 TGO, transaminasa glutmico oxalactica, 483 TGP, transaminasa glutmico pirvica, 484

491

U
rea mtodo de Chaney y Marbach, 372 Urocultivo mtodo, 348 lectura e interpretacin, 348

W
Wintrobe, anticoagulante, 466 Wright, colorante, 488

Y
Yersinia pestis obtencin de muestra, 363 procesamiento de muestra,365 Yodopolividona, 33

V
Virus de la Inmunodeficiencia Humana ELISA indirecto, 407 ELISA competitivo, 408 ELISA con antgeno de captura, 410 Virus de la hepatitis B test de ltex, 411

Z
Ziehl y Neelsen reactivos, preparacin, 474

492

GLBULOS ROJOS O ERITROCITOS

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