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EL DESCUBRIMIENTO DEL DNA Friedrich Miescher descubre la molcula que est concentrada en el ncleo de las clulas en 1869. La extrae de clulas blancas en el pus de heridas que queda en vendajes de heridos. Dado que la encontr solamente en los ncleos, Miescher denomin a este compuesto nuclena. P. A. Levene (1925) analiz los componentes del DNA. Encontr que contena cuatro bases nitrogenadas: citosina, timina, adenina, y guanina; el azcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Levene concluy: ! ! que la unidad bsica (nucletido) estaba compuesta de una base nitrogenada enlazada a un azcar y que el fosfato tambin estaba enlazado azcar. lamentablemente tambin concluy errneamente que las bases estaban en cantidades iguales y, que un tetranucletido (cadena de 4 nucletidos) era la unidad repetitiva de la molcula.

NUCLETIDO El nucletido es la unidad fundamental (monmero) del cido nucleico (polmero). Existen cuatro nucletidos que componen el DNA. Cada nucletido se compone de una pentosa (desoxiribosa en el DNA), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Las bases nitrogenadas son purinas (anillos dobles) las cuales son adenina (A) y guanina (G), y pirimidinas (anillos sencillo) denominadas citosina (C) y timina (T). Es importante notar que la base est enlazada al carbono uno de la pentosa, en el carbono tres (3 ) hay un grupo hidroxilo y en el carbono cinco (5 ) un grupo fosfato.

EXPERIMENTOS - De qu se compone el material gentico? En el 1908, A. Garrod propuso que algunas enfermedades humanas resultan de defectos en enzimas especficas necesarias para realizar una reaccin bioqumica. Sugiri que la enzima defectuosa era producto de un gen defectuoso heredado al nacer. La pregunta qued planteada: qu es un gen? de qu est compuesto? Frederick Griffith (1928) realiz una serie de experimentos con la bacteria Estreptococos pneumoniae, que causa neumona. Griffith estudi las diferencias entre una cepa de la bacteria que produca la enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cpsula. Esta se conoce como cepa S de smooth. La cepa R, de rugosa no tiene cpsula y no causa la enfermedad. Griffith inyect las cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la cepa R no lo haca. Luego comprob que la cepa S, muerta

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por calentamiento, no causaba neumona cuando se la inyectaba. Sin embargo cuando combinaba la cepa S muerta por calentamiento, con la cepa R viva, e inyectaba la mezcla a los ratones los ratones contraan la neumona y moran. Las bacterias que se aislaban de los ratones muertos posean cpsula. Por un proceso desconocido, la cepa R se transformaba en una cepa patognica. Griffith postul la existencia de un factor de transformacin como responsable de este fenmeno. En los aos 40, Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCarty continuaron el experimento de Griffith. Purificaron el factor de transformacin y lo identificaron como la molcula de DNA. Su evidencia era fuerte pero no pudo destruir la firme creencia de que el material hereditario eran las protenas.

En 1952 Alfred D. Hershey y Martha Chase realizaron una serie de experimentos destinados a dilucidar si el DNA o las protenas eran el material hereditario. Utilizaron como modelo experimental a bacterifagos. Los bacterifagos son virus que atacan a las bacterias. Los bacterifagos consisten en DNA con una cubierta de protenas. Infectan una clula inyectndole su DNA el cual toma control de la maquinaria de la bacteria que comienza a fabricar nuevos virus. Como los fagos tienen solo DNA y Protenas, eran la herramienta ideal para resolver la naturaleza del material hereditario. Marcando el DNA y las protenas con istopos radioactivos el experimento demostrara cual de ellos entraba en la bacteria. Dado que el DNA contiene fsforo (P) pero no azufre (S), ellos marcaron el DNA con Fsforo-32 radioactivo. Por otra parte, las protenas no contienen P pero si S, y por lo tanto se marcaron con Azufre-35. Hershey y Chase encontraron que el S-35 queda fuera de la clula mientras que el P-32 se lo encontraba en el interior, demostrando contundentemente que el material gentico se compone de DNA.

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LAS BASES DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL DNA (DOBLE HLICE) Watson y Crick recopilaron y analizaron la informacin sobre el DNA que se haba estado acumulando durante 80 aos y armaron el rompecabezas siendo los primeros en describir la estructura del DNA. Algunas de las piezas del rompecabezas ms importantes son: o o o Composicin del DNA Desarrollo de la tecnologa de cristalografa por rayos-X Erwin Chargaff 1950- demuestra la relacin entre las bases: "la cantidad total de purinas (adenina y guanina) siempre es igual a la de pirimidinas (citosina y timina), es ms hay tanta adenina como timina y tanta guanina como citosina" Estos datos sern particularmente importantes para Watson, pues a raz de ellos confirma la complementariedad de las bases: la adenina slo puede aparearse con la timina, y la guanina slo con la citosina. Regla de Chargaff A = T, C = G, A + G = T + C Linus Pauling, en 1950, identifica como describen la hlice alfa en protenas y sugieren que la forma del DNA puede ser parecida. Maurice Wilkins y Rosalind Franklin obtienen imgenes de la difraccin por rayos X del DNA. El patrn sugiere una estructura helicoidal, de 2 nanmetros de ancho.

o o

Watson y Crick Proponen el siguiente modelo basados en la cristalografa e informe de Franklin : El DNA consiste de una doble hlice. En analoga con una escalera, los pasamanos estn compuestos por las azcares y los fosfatos y cada escaln por un par de bases nitrogenadas. Cada lado de la escalera corre de forma antiparalela. El apareamiento de las bases es A-T y C-G. Las bases estn unidas por puentes de H. A se aparea con T mediante dos puentes de hidrgeno C se aparea con G mediante tres puentes de hidrgeno

Cada escaln se compondran de un par de bases nitrogenadas unidas por puentes de H. " La informacin en una de las cadenas de DNA predice la informacin de la otra cadena. (apareamiento de bases por complementariedad) " Para replicar el DNA, los puentes de H que mantienen las bases complementarias unidas se rompen y las cadenas se separan. " La mitad complementaria sirve de molde o templado para la otra mitad. " El resultado final es dos molculas idnticas.

Watson y Crick proponen tambin un posible mecanismo de replicacin.

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MODELO SEMICONSERVATIVO REPLICACIN DEL DNA Matthew Meselson y Franklin W. Stahl disearon el experimento para determinar el mtodo de la replicacin del DNA. Tres modelos de replicacin eran posibles: 1. Replicacin conservativa durante la cual se producira un DNA completamente nuevo durante la replicacin. 2. La replicacin semiconservativa se originan dos molculas de DNA, cada una de ellas compuesta de una hebra de DNA original y de una hebra complementaria nueva. 3. La replicacin dispersiva implicara la ruptura de las hebras de origen durante la replicacin que, de alguna manera se reordenaran en una molcula con una mezcla de fragmentos nuevos y viejos en cada hebra de DNA. El experimento de Meselson-Stahl consiste en cultivar la bacteria Escherichia coli en un medio que contenga nitrgeno pesado (15Nitrgeno que es ms pesado que el istopo ms comn, 14Nitrgeno). La primera generacin de bacterias se hizo crecer en un medio que nicamente contena 15Nitrgeno como fuente de N. Por qu los investigadores estn utilizando nitrgeno?

La bacteria se transfiri luego a un medio con 14N. Los resultados comprobaron la replicacin semiconservativa. El DNA extrado de las bacterias luego de cultivarlas por una generacin en 14N tendra un peso intermedio entre el DNA extrado del medio con 15N y el del extrado de medio con 14N.

Analiza los resultados esperados para los tres modelos, dibuja las molculas de DNA producto de la primera, segunda y tercera replicacin para cada uno de los modelos.

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Replicacin del DNA La replicacin es el proceso por el cual sintetizan nuevas molculas de DNA. Se hace una copia idntica de cada cromosoma. Este proceso es semiconservativo y bidireccional. El mecanismo es similar tanto en procariotas como en eucariotas. La replicacin del DNA, que ocurre una sola vez en cada generacin celular, necesita de muchos nucletidos. La sntesis de estos requiere una gran cantidad de energa celular (recuerde que luego de la fase S del ciclo celular las clulas pasan a una fase G a fin de, entre otras cosas, recuperar energa para la siguiente fase de la divisin celular). La replicacin del DNA ocurre en el ser humano a una velocidad de 50 nucletidos por segundo, en procariotas a 500/segundo. La replicacin requiere nucletidos, mltiples enzimas y factores proteicos. Ocurre en tres etapas: Iniciacin " Desenrrollamiento y apertura de la doble hlice el origen de replicacin (ORI). " La doble hlice se abre, mediante la DNA helicaza se mueve por la hebra templado en direccin de 5-3. " Las protenas que se enlazan a la cadena sencilla, SSBP, vuelven recta la cromatina y la mantienen abierta. " Topoisomerasa evitan el supercoiling , liberan la tensin que se genera al abrir la hlice ms all de los puntos de bifurcacin. Una vez que se abre la molcula, se forma una regiones conocidas como "burbujas de replicacin" en ella se encuentran los puntos de bifurcacin o replication forks.

Alargamiento o extensin " Un primer de RNA (secuencia iniciadora de alrededor de 10 nucletidos de RNA) complementario a la secuencia expuesta es generado por la RNA primaza (polimerasa de RNA). Este le provee a la DNA polimerasa un terminal 3 al cual puede aadir nucletidos. " La DNA polimerasa III sintetiza las cadenas complementarias a cada una de las cadenas viejas. Por la accin de la DNA polimerasa los nuevos nucletidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucletido correspondiente de la cadena de origen (A con T, C con G). " La sntesis de las cadenas ocurre de dos formas: una es continua (lder) y otra es discontinua (rezagada).

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" La cadena lder requiere un solo primer. La DNA polimerasa III aade nucletidos al terminal 3 que provee el primer. Ms adelante la DNA polimerasa I y otras enzimas, remueven el primer de RNA y lo sustituyen con nucletidos de DNA.

" La cadena rezagada se sintetiza en fragmentos (cada uno de unos 1000 nucletidos) conocidos como fragmentos de Okazaki. La misma requiere muchos primers o secuencias iniciadoras. A medida que abre la burbuja, la primaza sintetiza un primer, la DNA polimerasa III entonces comienza a aadir nucletidos al terminal 3 hasta que se encuentra con el terminal 5 de parte de la cadena nueva previamente sintetizada (esta puede ser la lder que comenz en el origen u otro fragmento de Okazaki). Hace falta un primer por cada fragmento de Okazaki. Al igual que para la cadena rezagada, con ayuda de otras enzimas, la DNA polimerasa I remueve el primer de RNA y coloca nucletidos de DNA en su lugar. " La DNA ligaza une a la cadena en crecimiento. " En procariotas abren una sola burbuja de replicacin, mientras que los eucariotas mltiples. El DNA se replica en toda su longitud por confluencia de las "burbujas".

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" Durante la replicacin del DNA, la DNA polimerasa tiene la capacidad de corregir errores (edita, proofreads ) a medida que ocurre la replicacin. " Errores por apareamiento incorrecto enzimas especializadas. errores que escapan la polimerasa. Son corregidos por

" Las clulas tienen mecanismos para monitorear y reparar el DNA. El DNA puede sufrir cambios espontneos o daos por agentes qumicos o fsicos (emisiones radioactivas, rayos X, luz ultravioleta.) " Ej. la radiacin ultravioleta produce dmeros de timina, estos se reparan mediante el proceso de reparacin por excisin de nucletidos. " Segmento daado se remueve por medio de enzimas conocidas como nucleasas. " Polimerasas de DNA colocan nucletidos en la regin de forma complementaria a la cadena no afectada. " Ligaza une el fragmento nuevo con los viejos. " Qu tiene de particular la replicacin de los extremos de cromosomas eucariotas? Por qu? ! TELMEROS terminales de cromosomas eucariotas. Contienen secuencias repetitivas en los extremos del DNA, 5 TTAGGGTTAGGG 3 En cada ciclo de replicacin se acortan a menos que la clula exprese la enzima telomerasa. o Se acortan 50-100 nucletidos de terminal 3 de la cadena en cada replicacin

TELOMERASA o o Alarga los telmeros en las clulas que la expresan. Son clulas que se dividen repetidamente clulas embrionarias, clulas tallo, organismos unicelulares.

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EJERCICIOS 1. Paree los nombres de los siguientes cientficos con su contribucin en el estudio del ADN. ____T.H. Morgan ____James Watson y Francis Crick ____Frederick Griffith ____Oswald Avery, McCarty y MacLeod ____Alfred Hershey y Martha Chase ____Erwin Chargaff ____Linus Pauling ____Maurice Wilkins y Rosalind Franklin

a) Generaron la primera cristalografa de rayos X que evidenci que la estructura del DNA era una doble hlice. b) Primero en probar que los genes se encuentran en los cromosomas c) Presentaron el modelo de la estructura actual del DNA y sugirieron el mecanismo de replicacin del DNA. d) Estableci una regularidad en la razn de los nucletidos en el DNA. Not que la composicin de nucletidos en el DNA era variable entre especies. e) Describi el fenmeno de la transformacin, cambio en genotipo y fenotipo por la asimilacin de ADN externo (paso de DNA de bacterias patognicas a bacterias no patognicas). f) Descubri que el material causante de la transformacin de las bacterias era el DNA y no RNA o protenas. g) Utilizaron istopos radioactivos y viruses que atacan bacterias (bacterifagos) para finalmente probar que el material gentico causante de la herencia era el DNA. h) Present el primer modelo estructural del DNA.

2. Haz un diagrama del modelo de DNA de Watson y Crick rotula sus partes. a. Bases nitrogenadas (incluya purinas y pirimidinas) b. Puentes de hidrogeno c. Grupos fosfatos d. Azcar-Pentosas e. Enlaces fosfodiestericos f. Grupos funcionales en terminales 3 y 5

Cul es la unidad monomrica del DNA en qu se diferencia del RNA?

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3. Dibuja el posible resultado de los experimentos de Meselson y Stahl si la replicacin ocurre de forma semi-coservativa, conservativa o dispersiva. 4. Llena los siguientes blancos a. Los nucletidos consisten de ___________. b. Las purinas son __________ y ___________; mientras que las pirimidinas son ________, _________ y _________ esta ltima no se encuentra en el DNA. c. El modelo de Watson y Crack establece que el DNA esta formado por dos __________. d. Meselson y Stahl demuestran que la replicacin de DNA es de tipo _____________ y esto quiere decir que ________________________. e. La replicacin del DNA ocurre en direccin ___________________. f. El acortamiento de los telmeros contribuye a _________________.

5. Una vez aislado un fragmento de DNA humano, se analizaron las proporciones de bases nitrogenadas encontrndose: A: 27%; G: 35%; C: 25% y T: 13%. Cul ser la proporcin de bases de la cadena complementaria? 6. En una muestra de ADN aislada de una determinada especie de organismo eucariota, la timina representaba el 14% de la totalidad de bases. Predecir el porcentaje del resto de las bases en la muestra. 7. Se cultivan bacterias E. coli en un medio con 15N (nitrgeno pesado) durante cierto tiempo para que todo el DNA est formado por dos hebras de 15N (15N-15N) ms pesadas. A continuacin se cultivan las bacterias en nitrgeno 14 (14N) ms ligero durante 30 minutos, lo que dura un ciclo de replicacin. Se asla el DNA y se centrifuga. Indica qu resultados se obtendrn y por qu. Aydate haciendo diagramas. 8. Identifica las molculas envueltas y describe su funcin en la replicacin del DNA en el siguiente diagrama

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9. Asuma que el diagrama representa el origen de replicacin. Dibuje la posible localizacin de los primers (iniciadores) y a partir de estos dibuje la cadena lder y la cadena rezagada, identifique los terminales y la direccin de la replicacin. .

10. Explica el diagrama a continuacin: a. Por qu la replicacin del DNA no es continua en ambas cadenas? b. Qu molculas intervienen en este proceso? c. Dibuja el otro lado de la burbuja

11. Ordena en orden cronolgico e identifica que eventos son nicos de la sntesis de la cadena lder (L) y cuales son nicos de cadena rezagada ( R ). ____Doble hlice se desenrolla. ____Primaza coloca Iniciadores de RNA para fragmentos de Okasaki. ____Alargamiento del fragmento (DNA Polimerasa III) ____Reemplazo del iniciador de RNA (DNA polimerasa I) ____Enlace de los fragmentos (Ligaza) ____Actan las helicazas

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____Actan topoisomeraza y protenas SSBP ____Iniciador de RNA (iniciador) se une al origen de replicacin ____Alargamiento (DNA polimerasa III) ____Reemplazo del Iniciador (DNA Polimerasa I) ____Enlace cadena lder con cadena rezagada (ligaza) ____Estabilizar cadena sencilla

12. Paree las siguientes molculas con su respectiva funcin a. Ligaza de DNA b. Primaza DNA c. polimerasa III d. Topoisomerasa e. Helicasa f. DNA polymerasa I g. Protenas que se enlazan a la cadena sencilla 13. Dibuja en la figura a continuacin las hebras de DNA que se replicarn.