LOS MTODOS DE ESTUDIO DE LA CLULA

INDICE 1. Unidades de medida 2. El microscopio ptico (p.1) Observacin de clulas de pulpa de tomate 3. La tincin (p.2) Tincin y observacin de clulas epidrmicas de cebolla 4. El microscopio electrnico (p.3) Anlisis de imgenes de microscopa 5. Mtodos citoqumicos (p.4) Separacin de pigmentos fotosintticos Anexo I : material de laboratorio Anexo II: instrucciones generales Anexo III: relacin de imgenes de microscopa Bibliografa 2 4 7 8 9 10 11 20 21 23 24 25 26

1.UNIDADES DE MEDIDA
cunto mide? Las clulas, salvo excepciones como las yemas de los huevos de las aves, no pueden ser observadas a simple vista y se debe recurrir a la ayuda de los microscopios. Por ese pequeo tamao tampoco se utiliza como unidad de medida el milmetro pues deberamos recurrir a cifras con muchos decimales (lo ms pequeo que podemos ver a simple vista est en torno a 0,1 mm).

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El grfico superior te muestra una comparativa de tamaos as como la resolucin de los microscopios pitos y electrnicos.

Para evitar manejar engorrosas cifras con decimales se utilizan unidades inferiores como la micra ( ) que es la milsima parte del milmetro, (tambin se denomina micrmetro (m)). 1mm = 1000 1000m as, con la micra podremos referirnos al tamao de las clulas y de algunos orgnulos: clula eucariota tpica clula procariota mitocondria 20-30 0,5-1 0,5-1

cuando tenemos que referirnos a detalles de las clulas o de los orgnulos tales como la membrana, la micra resulta demasiado grande y entonces se utiliza una unidad inferior, el nanmetro (nm) que es la milsima parte de una micra : 1 nm = 1000 pero incluso esta unidad puede resultar excesiva si nos adentramos en el nivel molecular y queremos saber distancias entre las molculas de una macromolcula (por ejemplo entre dos bases nitrogenadas del ADN ) o entre dos tomos de una molcula (por ejemplo entre los tomos de oxgeno e hidrgeno del agua). En estos casos se utiliza el ngstrom ( ) que es 10 veces menor que un nanmetro: 1 nm = 10 1 = 10.000 cunto pesa? Por otro lado adems de medir longitudes necesitamos conocer pesos, es decir, necesitamos unidades de masa que sean inferiores al miligramo. La ms utilizada para clulas y orgnulos es el picogramo (pg): 1 pg = 10 12 gramos y para macromolculas el dalton: 1 dalton = 1,66 10-24 tomos de hidrgeno esta unidad se debe a que para expresar la masa de una macromolcula se indica su peso molecular, es decir, el nmero de veces que la molcula tiene ms masa que el tomo de

3 hidrgeno. Como en un gramo hay 6,0231023 tomos de hidrgeno y, por definicin, la masa de un tomo de hidrgeno se denomina dalton, resulta que 1 gramo son 6,02310 23 daltons (por ejemplo el peso molecular de la glucosa es de 180 daltons, y el del agua es de 18 daltons). Otra unidad que se utiliza para macromolculas y pequeas estructuras como los ribosomas es el svedberg (S) que tambin se utiliza como medida de tamao. Esta unidad est relacionada con la velocidad de sedimentacin de las partculas en la centrfuga (esa velocidad ser proporcional al peso de la partcula).

1. Calcula cuanto mide en nanmetros: a) la bacteria Escherichia coli que mide 1 m b) el virus VIH que mide 0,1 m c) una clula epitelial humana que mide 40 m 2. Cul sera el tamao en micrmetros de una bacteria que mide 0,01 cm?
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2. EL MICROSCOPIO PTICO

Aunque seguramente ya has manejado este tipo de microscopio vamos a revisar las partes del microscopio ptico de luz visible y a conocer otros tipos.

Microscopio ptico de luz visible En un microscopio ptico de luz visible se utiliza como radiacin la luz visible que puede enfocarse mediante lentes de vidrio; en l encontramos las siguientes partes: *Fuente de iluminacin que actualmente es una lmpara elctrica colocada al pie del microscopio

4 *Elementos mecnicos que son un conjunto de piezas para sostener la parte ptica y las muestras a observar (tubo ptico, platina, pie y asa) *Elementos pticos que son tres sistemas de lentes: condensador, objetivo y ocular.

**El condensador concentra los rayos de luz sobre la muestra, obtenindose as una mayor iluminacin; suele llevar un diafragma para regular la cantidad de luz y adecuarla a las necesidades de la observacin. **El objetivo recoge los rayos de luz que atraviesan la muestra, y produce una imagen aumentada de la misma. Los microscopios suelen tener varios objetivos, de distintos aumentos, fijados a una pieza giratoria o revlver. **El ocular amplifica la imagen producida por el objetivo, y la enfoca sobre el ojo humano.

Por qu no lo podemos ver todo? El aumento al que podemos ver una imagen resulta de los aumentos debidos al objetivo y al ocular. Por ejemplo, si el objetivo es de 10 aumentos (10x) y el ocular es de 4 aumentos (4x), la imagen observada estar 4x10=40 veces aumentada. Si esto fuera lo nico que influyese podramos pensar que con lentes enormes y de buena calidad conseguiramos un aumento enorme, pero la calidad de un microscopio no slo viene determinada por el nmero de aumentos (lentes), sino tambin por el poder de resolucin o distancia mnima para que dos puntos prximos se vean como puntos diferentes. Esto depende fundamentalmente de la longitud de onda de la luz utilizada: cuanto menor sea sta, mejor es la resolucin, es decir, el poder de resolucin ser menor. As, como el principal factor limitante es la longitud de onda de la luz visible, es imposible construir un microscopio con un poder de resolucin inferior a 0,2 micrmetros. Es decir, si dos estructuras estn separadas a menos de 0,2 micrmetros, aunque utilicemos lentes muy potentes que produzcan muchos aumentos, no se mejorar la resolucin, sencillamente veremos una zona borrosa mucho ms grande. Por otro lado, adems de la longitud de onda, en el poder de resolucin tambin influye el llamado ndice de refraccin del medio, normalmente aire, que se encuentra entre el objetivo y la preparacin. Cuanto mayor sea el ndice de refraccin, ms disminuye la velocidad de la luz y ms aumenta la resolucin; por esta razn los objetivos de inmersin tienen un poder de resolucin mayor, ya que utilizan una sustancia viscosa como el aceite (indice de refraccin=1,5) frente al aire (ndice de refraccin=1).

5 Otros microscopios pticos

Microscopio de contraste de fases. Utiliza luz visible. Se basa en que las diferentes estructuras celulares tienen distinta densidad y, por tanto, vara su ndice de refraccin. Pero las diferencias son muy pequeas y en este tipo de microscopios se utilizan distintos sistemas para aumentarlas y mejorar la imagen. Microscopio de campo oscuro. Se emplea para observar microorganismos; en l un disco opaco bloquea la luz de forma que slo la luz refractada por la muestra alcanza el objetivo y la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro. Microscopio de luz ultravioleta. Utiliza como radiacin la luz ultravioleta que , al tener una longitud de onda menor que la luz visible, proporciona un poder de resolucin de hasta 0,01 micrmetros. Precisa lentes de cuarzo y la imagen se recoge en una pantalla. Microscopios de rayos X Utilizan una radiacin con una longitud de onda menor que la de la luz ultravioleta y son relativamente recientes ya que era preciso conseguir lentes capaces de focalizar los rayos X. Alcanzan un poder de resolucin de 550 angstroms, mayor que el de los microscopios electrnicos, con la ventaja de que permiten mantener las muestras en aire o agua, es decir, en condiciones similares a las naturales.

Microscopios de fluorescencia. Permiten observar clulas o componentes celulares capaces de emitir fluorescencia, bien sea natural o bien por adiccin de una sustancia que tenga esa propiedad. Utilizan una lmpara especial capaz de producir la excitacin de la sustancia fluorescente y un filtro que recoge y transmite las ondas emitidas por la muestra. Seala las partes en el siguiente dibujo:

3. LA TINCIN.
En la prctica anterior has hecho una observacin de clulas sin someterlas a ningn tratamiento. En muchos casos la observacin de una muestra se puede mejorar si aumentamos el contraste entre sus estructuras; una forma de hacerlo es mediante la tincin. Los colorantes que se utilicen dependern de la naturaleza de lo que se quiera observar; por ejemplo, si pretendemos ver cidos nuclicos debemos utilizar un colorante bsico que se unir a ellos, mientras que el citoplasma, de carcter bsico se teir con colorantes cidos. Existen ademas tcnicas de tincin especficas que ponen de manifiesto distintos componentes celulares: *Tcnica del PAS ( cido perydico de Schiff) se utiliza para teir carbohidratos y revela la existencia del glicocliz que aparece de color morado. *La tincin de Feulgen es especfica para el ADN y tie el ncleo de color morado. *Los lpidos se pueden detectar con tetrxido de osmio (color negro) o con rojo de Sudn (rojo). *El almidn se detecta con la solucin de Lugol y aparecer de color violeta. *El colorante llamado verde brillante tie la lignina. Otro tipo son las tcnicas de tincin diferenciales que utilizan al menos dos colorantes distintos; es el caso de la llamada tincin de gram que permite diferenciar bacterias gram + (color azul) de bacterias gram (color rojo).

4. EL MICROSCOPIO ELECTRNICO.

Ideado a principios del siglo XX utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. Como la longitud de onda de los electrones es menor que la de la luz, el poder de resolucin aumenta considerablemente (unos 0,2 nanmetros). El haz debe proyectarse en un sistema al vaco y las lentes de cristal son sustitudas por lentes electromagnticas (electroimanes). Existen dos tipos de microscopios electrnicos: el de transmisin (TEM) y el de barrido (SEM). Microscopio electrnico de transmisin (TEM) Se hace que el haz de electrones incida sobre la muestra; las zonas que permiten el paso de ms electrones se ven claras mientras que las zonas densas se ven oscuras; es decir, se produce una imagen por contraste que es fotografiada u observada en una pantalla fluorescente. La muestra ha de estar totalmente deshidratada y ser muy fina (se realizan cortes con el ultramicrotomo) por lo que resulta imposible observar muestras in vivo; la muestra se coloca sobre una rejilla de cobre que permite el paso de los electrones y para aumentar el contraste se recubre con metales pesados, como el plomo, que hace que las distintas estructuras absorban diferentes cantidades de electrones. Microscopio electrnico de barrido (SEM). En este caso se suelen observar muestras enteras, por ejemplo clulas, sin cortar. La muestra se recubre con un metal pesado, generalmente oro, y el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que la barre reflejndose y recogindose en una pantalla. De esta forma ofrece una imagen tridimensional de la muestra.

(p.3.) ANLISIS DE IMGENES DE MICROSCOPA.

En general, las imgenes con colores corresponden a microscopa ptica pues como ya vimos, se usan colorantes para resaltar estructuras o para diferenciar unas de otras. En microscopa electrnica las imgenes suelen verse en escala de grises aunque en muchos casos se colorean posteriormente con programas informticos.

de qu orgnulo se trata?

Esta microfotograga te muestra distintos lisosomas a qu podra deberse esta diferencia de tamaos?

qu crees que es? (lo viste en una prctica)

En esta imagen tienes retculo endoplasmtico liso, rugoso y mitocondrias.

Y aqu qu observas?

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En esta microfotrografa se ve la traduccin del RNAm

Esta imagen es un macrfago comindose a un estreptococo crees qu es real o esta falseada? qu es eso?!

sabes de que tipo de clulas se trata?

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y esto? Si, tambin es de microscopio electrnico. Te doy una pista: se trata de una bacteria muy famosa......

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Aqu tienes otra clula sangunea, en este caso un neutrfilo, fagocitando de nuevo a un estreptococo.

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Esta imagen est hecha con TEM Qu son?

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esta imagen es del hongo Candida albicans hecha con SEM, muy frecuente en nuestra piel ..entrate dnde..

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de nuevo la famosa bacteria vista con TEM qu proceso observas?

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La imagen superior es de el protozoo fotosinttico Euglena realizada con SEM. Recuerda que la imagen coloreada es falsa, hecha despus. La imagen que nos dar el microscopio ser la segunda.

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qu eso?

puede

ser

Glbulo rojo en un capilar

Idntifica ms partes

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Realizada con TEM (ver siguiente)

Virus entrando
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Estas dos imgenes(17 y 18) realizadas con TEM son del virus de la herpes; en la superior el virus est dentro de una clula. Trata de reconocer alguna estructura de la misma. Identifica tambin las partes del virus.

15 indica que proceso celular observas y que partes reconoces

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Este orgnulo (TEM) es conocido, que no te despiste la forma .

El virus de la polio (TEM), qu material gentico tiene?

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16 esta imagen ya la has visto en una prctica la reconoces?

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esta imagen es de los cromosomas en una fase determinada de la divisin celular qu fase es?

crees que la imagen es de microscopa electrnica?

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la fotografa es de microscopio de fluorescencia es microscopa ptica o electrnica? cmo funciona?

5. MTODOS CITOQUMICOS.

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El objetivo de estos mtodos es la localizacin e identificacin de las sustancias qumicas constituyentes de las clulas, para lo cual hay dos lneas de investigacin: -obtencin de fracciones subcelulares y su posterir anlisis bioqumico, -determinacin de diferentes compuestos qumicos en el interior de la clula. En los mtodos de fraccionamiento celular lo que se hace es destruir la clula por procedimientos mecnicos o qumicos ( trituracin, vibracin ultrasnica, choque osmtico...) y luego se separan los distintos componentes que constituyen la clula. El mtodo ms usado es la ultracentrifugacin diferencial, proceso durante el cual se somete a las clulas destrudas a una serie de centrifugaciones, con fuerzas centrfugas progresivamente mayores, de forma que las partculas se van separando en funcin de su tamao; en cada fase se obtiene un precipitado que se recoge y un sobrenadante que se vuelve a centrifugar. Por este mtodo separamos los distintos componentes celulares que podemos estudiar de forma aislada . La ltima fraccin que se obtiene corresponder a una fase soluble en la que tendremos todo tipo de molculas. Para estudiar esta fase soluble, es decir, para separar distintas biomolculas podemos recurrir a otras tcnicas como la cromatografa y la electroforesis. La cromatografa permite la separacin de biomolculas basndose en la diferente velocidad de desplazamiento de los componentes de una mezcla a travs de un medio determinado. La velocidad de desplazamiento depender de las caractersticas de las biomolculas. Dentro de esta tcnica existen distintas modalidades: -cromatografa en papel: se aplica una mezcla de biomolculas sobre una hoja de papel adsorbente. Uno de los extremos se impregna con un disolvente que avanzar por capilaridad a travs del papel. Aquellas molculas que sean solubles en el disolvente sern arrastradas y avanzarn ms rpido que las que no lo sean obtenindose as una separacin en funcin de la solubilidad. -cromatografa de intercambio inico: la muestra se pasa por una columna con una resina cargada (positiva o negativamente) de forma que las molculas de la muestra interaccionarn con la resina en mayor o menor grado en funcin de su carga y, por tanto, avanzarn a distinta velocidad. Al final podrn recogerse las distintas fracciones separadas en funcin de su carga. -cromatografa de filtracin: se pasa la muestra por una columna de resina porosa sin cargas. Las molculas pequeas avanzarn ms despacio pues tienden a entrar en los poros de la resina, mientras las grandes irn ms rpido. La separacin se hace, por tanto, en funcin del tamao molecular. La electroforesis es una tcnica derivada de la cromatografa que lo que hace es aplicar un campo elctrico a una muestra colocada en la base de una lmina del gel agarosa. La electricidad forzar el desplazamiento de las molculas en funcin de su carga, es decir, se movern al polo positivo o al negativo segn cual sea su carga neta y lo harn a una velocidad que depender de su masa y del nmero de cargas electricas.

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19 ANEXO II:

INSTRUCCIONES GENERALES
Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad.

1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. 2. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. 3. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. 4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin. 5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. 6. No tacar con las manos y menos con la boca los productos qumicos. 7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. 8. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. 9. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared. 10. Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: cido sobre agua. 11. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco. 12. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el Centro. 13. Las pipetas se tomarn de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada de lquido. 14. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal. 15. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos debe evitarse la ebullicin violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullicin rpida, se retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y retirndolo otra vez al producirse una nueva ebullicin, realizando as un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitar dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona. 16. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo despus de haberlos calentado con el fin de evitar roturas. 17. Los cubreobjetos y portaobjetos deben tomarse por los bordes para evitar que se engrasen.

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INDICE 1. Unidades de medida 2. El microscopio ptico (p.1) Observacin de clulas de pulpa de tomate 3. La tincin (p.2) Tincin y observacin de clulas epidrmicas de cebolla 4. El microscopio electrnico (p.3) Anlisis de imgenes de microscopa 5. Mtodos citoqumicos (p.4) Separacin de pigmentos fotosintticos Anexo I : material de laboratorio 2 4 7 8 9 10 11 20 21 23

21 Anexo II: instrucciones generales Anexo III: relacin de imgenes de microscopa Bibliografa 24 25 26