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Universidad de Santiago de Chile Facultad Tecnolgica Depto.

Ciencias y Tecnologa de los Alimentos Bioqumica de los Alimentos I

Laboratorio N4 Electroforesis de DNA

Autores: Alejandra Bravo Cyntia Parra Consuelo Henrquez Profesor Ctedra: Mara Anglica Ganga. Profesor de Laboratorio: Dr. (c) Waldo Daz Vsquez Ayudante: Macarena Llanos Fecha: Jueves 08 de Agosto del 2013

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RESUMEN Sometimos a electroforesis a una muestra de ADN plasmidial correspondiente a Escherichia coli (E. coli), previamente sometida a procesos de rompimiento de membrana celular, denaturacin, precipitacin y centrifugacin. Por medio de un gel de Agarosa 0,8% se coloca la muestra y su estndar correspondiente en una de las celdas para que por medio de un gradiente de electricidad fluya por medio del gel. Se obtuvieron distintos desplazamientos y con estos se confeccion una recta para determinar el tamao de la muestra problema (1,646 pb), confirmando la tcnica para determinar el tamao molecular de un ADN plasmidial desconocido. INTRODUCCION El ADN (cido Desoxirribonucleico) es un polinucletido con una secuencia especfica de unidades, constituido por un grupo fosfato, una base nitrogenada (purina o pirimidina) y un azcar desoxirribosa; adems es un portador gentico (Lehninger, 2009). La electroforesis es una tcnica que consiste en la separacin de molculas a travs de una matriz tamponada como el gel de agarosa que es un polisacrido formado por galactosa alfa y galactosa beta. Los cidos nucleicos pueden ser separados y visualizados mediante la tcnica. El gel cumple la funcin de tamiz celular, separando las molculas a travs de un campo elctrico, segn su peso y carga elctrica, en el caso del ADN es el grupo fosfato el responsable de entregar carga negativa a la molcula en pH neutro, por lo cual esta migrara hacia el ctodo. (Duina Posso Duque, 2009) OBJETIVOS Extraccin de los plsmidos bacterianos desde un medio de cultivo de E. Coli. Preparacin de un gel de Agarosa, donde se cargarn y visualizarn las muestras de los plsmidos, determinarles un peso molecular aproximado. MATERIALES Y MTODOS Guantes, micropipetas, tubos Eppendorf, cultivo de E. Coli, Buffer de resuspencin, buffer de lisis, bao de agua, buffer de neutralizacin, centrifugadora, etanol, buffer
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TE, gel de agarosa, cmara de electroforesis, buffer TAE 1X, buffer de carga, bromuro de etidio, estndar( / ECO RI / HIND III ). METODOS Extraccin de DNA plasmidial de E. Coli La muestra de cultivo de E. Coli fue entregada lista para para comenzar a tratarla. Se suspende el pellet bacteriano usando 250ul de buffer de resuspencin, el cual contiene ARNsa (permite destruccin del ARN), realizada la lisis, se transfiere la muestra a tubos de 1,5 ml (previamente etiquetados). Se agrega a la suspensin 250 ml de buffer de lisis (tiene como funcin destruir la pared celular y membrana bacteriana) y se incuba por 10 min en un bao de agua que est a 75C. Posteriormente agregar 350 ml de Buffer de neutralizacin (forma precipitado de macromolculas), agitar suavemente y llevar la muestra a la centrifuga (13000 RPM) durante 10 min. Despus de retirar la muestra de la centrifuga se rescata nuevamente el sobrenadante y agregar etanol frio hasta completar el volumen del tubo e incubar por 10 min a -20C. Finalmente centrifugar la muestra (13000 RPM) durante 10 min, descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50ul de Buffer TE, posteriormente realizamos electroforesis. Electroforesis de cidos nucleicos Tomar 20 ul de la solucin plasmidial y agregarle 5 ul de buffer de carga, cargar los 25 ul totales en cada uno de los bolsillos del gel. Someter a electroforesis a 100 volts durante 30 minutos. Posteriormente el gel debe ser teido en una solucin de bromuro de etidio y revelada en un transiluminador. Com la fuerza impulsora es proporcional a la carga elctrica, el parmetro que rige el avance (aceleracin = fuerza/masa) es realmente la relacin carga/masa. La electroforesis separa los fragmentos de cido nucleico segn su tamao o longitud, expresado en nucletidos (si son de hebra sencilla) o en pares de bases (si son de doble hebra, caso comn del DNA). Por esto, posible establecer una curva de calibrado que relacione la movilidad con la longitud en pb. Para conseguir una recta se suele representar tamao frente a 1/movilidad (como en el grfico).

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RESULTADOS Tamao Molecular (pb) Movilidad (cm) Movilidad Relativa (1/Mov.) 5148/4973 6 0,16 4268 5,7 0,17 3530 5,5 0,18 2027 4,5 0,22 1904 4,2 0,23 831 2,3 0,43 1,646 0,7 1,43 Tabla n1: Desplazamiento estndar Lambda/Eco RI/Hind III y muestra problema. Figura N2: Imagen Electroforesis de DNA

Figura N3: Grfico Movilidad Relativa v/s Tamao Molecular. DISCUSIN La extraccin de DNA plasmidial contaba con tres muestras, cada una la realiz una integrante del grupo, esta parte del procedimiento era muy importante ya que se deba tener mucho cuidado al momento de extraer las
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partes sobrenadantes despus de centrifugarlos, ya que con estas se deba trabajar. El procedimiento del gel fue muy corto ya que slo contbamos con una cmara de electroforesis, se llev a cabo de forma horizontal. Sembramos en primer lugar el estndar (Lambda/Eco RI/Hind III) y despus las muestras, antes de cada vez que cada grupo sembrara sus muestras se volva a sembrar el estndar, en nuestro grupo las dos ltimas muestras se perdieron es posible que por mal sembrado. Quedamos con slo una muestra para determinar su peso. Posteriormente se compar una foto real, con una foto de la electroforesis obtenida para reconocer los estndares que se obtuvieron y se marcaron. Con estas medidas se confeccion un grfico de desplazamiento (mm)/pares de bases (pb) el cual con nuestros datos nos entreg un r2= 0,685 con el cual no se puede trabajar ya que su exactitud no es la adecuada. Eliminamos los datos ms dispersos y obtuvimos una recta con un r 2= 0,976, el cual pudimos reemplazar el desplazamiento de nuestra muestra y obtuvimos el tamao aproximado del DNA analizado. CONCLUSIN Se logr determinar el tamao de la muestra DNA problema, con la recta obtenida a partir de la electroforesis. El procedimiento demostr la eficacia de la tcnica, a pesar que la metodologa de extraccin puede conllevar ciertos errores de aquel que se encuentre manipulando los instrumentos, obtuvimos un ptimo resultado. REFERENCIAS Nelson, David L. Lehninger Principios de Bioqumica 2009 5 Ed. Editorial Omega

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