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XII JORNADAS DE INVESTIGACIN Revista Investigacin Cientfica, Vol. 4, No. 2, Nueva poca.

Mayo - Agosto 2008 ISSN 1870-8196

Siempreviva: un espermicida natural y avances de su caracterizacin fitoqumica


Patricia Aurora Estrada Salas Galvn Valencia Virginia Marisol Flores Morales Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas, Universidad Autnoma de Zacatecas. Egalvanmisol@yahoo.com

Resumen
La medicina tradicional adems de valor cultural, a lo largo de la historia ha demostrado su vigencia como apoyo a la salud, sobretodo hoy en da en que las enfermedades asociadas a una forma de vida ms agitada y menos natural son frecuentes, adems de que los precios de las medicinas de patente son prohibitivos y sus efectos secundarios una preocupacin creciente. Sedum praealtum (siempreviva) es un arbusto con frecuencia colgante de 60 cm a 5 m de longitud. Sus hojas ssiles, aplanadas y espatuladas tienen una base angosta y se alternan en espiral, presentan un color verde lustroso con borde rojizo. La poca de floracin ocurre entre el perodo de invierno a primavera brotando flores muy pequeas pentmeras de color amarillo. Esta planta silvestre crece en suelo pedregoso de lugares de clima templadohmedo principalmente entre los 2400 y los 2700 m snm como Hidalgo, Puebla, Tlaxcala y hasta Guatemala; sin embargo, se adapta y crece en cultivo en climas y suelos diferentes [1]. La siempreviva se ha utilizada con fines de ornato y en la medicina tradicional por sus propiedades anti-inflamatoria y analgsica, para enfermedades de los ojos, erupciones cutneas y de regeneracin de tejidos, as como anticonceptivo. Palabras clave: planta medicinal, Sedum praealtum, metabolitos secundarios.

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Objetivo
El objetivo general de este trabajo es contribuir en la caracterizacin fitoqumica de la siempreviva y demostrar la actividad espermiosttica/espermicida de extractos crudos y sus fracciones orgnicas.

Metodologa
El trabajo inici con la recoleccin en septiembre del 2007 de las hojas y tallos de una planta de siempreviva que crece de forma silvestre en las laderas de un cerro ubicado en la salida norte del municipio de Zacatecas. A lo largo de este tiempo, se llev un registro de las caractersticas, cambios morfolgicos y la descripcin botnica general de la planta, lo que permiti la identificacin de la misma. Para la extraccin, las hojas y tallos se cortaron y lavaron con agua destilada, se trocearon y pesaron. Como procedimientos de extraccin se utilizaron la maceracin etanlica y la obtencin del jugo de hojas y tallos. La extraccin alcohlica se realiz durante un mes en etanol al 96%, manteniendo agitacin constante y una atmsfera de N2. Durante este tiempo se vigil la extraccin tomando peridicamente muestras que fueron analizadas por cromatografa en capa fina. Al trmino del proceso, el extracto se filtr y concentr en un rotavapor e inmediatamente se liofiliz para su conservacin. Para la extraccin mecnica del jugo de las hojas se utiliz un extractor comercial y el jugo obtenido fue filtrado y en seguida liofilizado. Como tcnica de separacin se utiliz la cromatografa lquido-slido. Soluciones de los liofilizados del extracto crudo fueron cargados en una columna de 70 cm de altura por 4.5 cm de dimetro rellena con gel de slice 60HF 254 (JT Baker). A travs de la columna se eluy una mezcla de solvente hexano-acetato de etilo iniciando con una proporcin de 4:6 v/v hasta terminar con acetato de 2

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etilo. Finalmente de la columna se eluyeron con etanol absoluto los restantes compuestos adorbidos a la fase slida. El avance de la extraccin, as como el control del contenido de las fracciones obtenidas en cromatografa de columna se sigui por cromatografa en capa fina sobre placas de gel de slice 60HF 254 (JT Baker). Con esta misma tcnica cromatogrfica se identificaron cualitativamente grupos de compuestos del extracto etanlico y del jugo de Sedum praealtum aplicando reveladores cromgenos especficos para alcoholes (sulfato srico amoniacal), alcaloides (revelador de Dragendorff y permanganato de potasio), aminocidos flavonoides (ninhidrina), compuestos carbonlicos (2-4 dinitrofenilhidracina), (Benedict) [2]. La capacidad espermicida/espermiosttica del extracto crudo etanlico, de las fracciones y del jugo de siempreviva fue evaluada en 5 muestras de semen humano de voluntarios sanos con una edad promedio de 20 aos, a quienes se les pidi un perodo de abstinencia sexual de entre 48 a 72 horas. Brevemente, el semen humano eyaculado se recolect en vasos de polietileno estriles y se les realizaron las pruebas bsicas de una espermatobioscopia. Cada muestra se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos en promedio para su licuefaccin, procediendo entonces con los exmenes. Los valores de referencia corresponden a los recomendados en el manual de la OMS [3], entre ellos: el volumen (3-5 ml), pH (de 7.2 a 8.0), consistencia (por cada libre aspirada con una pipeta, debe formarse una gota bien definida y no formar un hilo de ms de 2 cm de longitud), apariencia (color gris opalescente), densidad (50 a 150 millones por mililitro), aglutinacin (escala semicuantitativa desde sin aglutinacin , hasta alta +++) movilidad (se definen cuatro categoras: A para progresivos rpidos, B para progresivos lentos, C para no progresivos y D para inmviles) y la viabilidad (en una tincin de eosina al 0.5% en solucin salina, no ms del 50% de los espermatozoides/campo debern teirse).. Slo sujetos con valores normales en las anteriores pruebas fueron 3

(amoniaco y cloruro frrico), glucsidos (antrona), azcares y sus derivados

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incluidos en el ensayo. Las muestras fueron completadas a un volumen final de 10 ml con medio salino Keyhani-Storey [4] (113 mM KCl, 12.5 mM KH2PO4, 2.5 mM K2HPO4, 2.5 mM MgCl2 y 20 mM Tris a pH 7.4). El liofilizado del extracto crudo y las fracciones purificadas 1,2,4,5 fueron reconstituidos con 1 ml del medio salino Keyhani-Storey. Para solubilizar el jugo y la fraccin 3 se agreg etanol al 70%. A partir de cada una de estas suspensiones se tomaron volmenes de 0, 25, 50, 100, 150 y 200 que se aforaron a 250 con el medio Keyhani-Storey, se mezclaron y se les agreg a cada tubo 250 de la suspensin de espermatozoides que entonces fueron incubados a 37 C durante 3 horas. Pasado este tiempo, se repitieron las pruebas de motilidad, viabilidad y aglutinacin como previamente se describi.

Resultados
Para los estudios descritos en la metodologa se proces un total de 144 gr de hojas de siempreviva, obtenindose 1.2 gr del polvo liofilizado que presentaba un color verde-caf. El rendimiento fue del 0.8 % respecto del peso inicial de las hojas. Despus de la separacin del extracto crudo por cromatografa en columna se obtuvieron una serie de fracciones que en base a los patrones de corrimiento en la cromatografa en capa fina fueron agrupadas en 5 fracciones. Cada una de ellas presentaba una tonalidad diferente: la primera de color naranja, la segunda de color amarillo claro, la tercera de un rojo marrn, la cuarta un color caf oscuro, la quinta y ltima fraccin eluda con etanol de color verde oscuro. A pesar de las diferencias en la apariencia, los resultados de la identificacin cualitativa por cromatografa en placa y reveladores cromognicos, demostraron la presencia de compuestos del tipo alcoholes, compuestos carbonlicos, flavonoides, glucsidos y alcaloides (aunque en poca cantidad) tanto en el extracto crudo como en el jugo y en las 5 fracciones. nicamente el extracto crudo etanlico y el jugo fueron positivos a la presencia de azcares y 4

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aminocidos, observndose en mayor cantidad en el jugo. En ninguno de los casos la prueba para esteroides fue positiva. Al evaluar el efecto que el extracto crudo etanlico, sus 5 fracciones y el jugo de las hojas tienen sobre la movilidad, vitalidad y aglutinacin de espermatozoides humanos, se observ un mayor efecto espermicida con el jugo seguido del extracto crudo etanlico. Incluso para las concentraciones mas bajas (de 25 y 50 l) se observ que el nmero de espermas inmviles y no progresivos se incrementaba, efecto que fue dependiente de la concentracin del liofilizado. Los liofilizados tambin provocaron efectos en la aglutinacin; para concentraciones mas bajas hubo aglutinaciones del tipo cabeza-cabeza, colacola, y en las concentraciones de 100, 150 y 200 l hubo aglutinacin de espermatozoides. A nivel microscpico se observ cambio particularmente en la morfologa de la cola de los espermas, perdiendo movilidad y aprecindose enrollamiento de la cola a medida que aumentaba la concentracin del extracto etanlico y del jugo de la hoja, y en menor grado cuando se trataba de las 5 fracciones.

Conclusiones
Se tiene conocimiento de la aplicacin en la medicina tradicional de Sedum praealtum desde la poca pre-colonial [5]. Sin embargo, hasta la dcada de los 80s se iniciaron los estudios cientficos que avalaran las propiedades empricamente atribuidas a ella [6-9]. El primer trabajo de ellos por Garca Pinedo y colaboradores describe el efecto anticonceptivo del extracto crudo acuoso de siempreviva. La administracin en ratas de una solucin del liofilizado de sedum por va vaginal previo al coito, disminuy la tasa de fertilidad. De acuerdo con sus resultados el efecto de la planta se debi a la inmovilizacin de los espermatozoides sin que se modificara significativamente su viabilidad. Un segundo efecto del extracto crudo acuoso de siempreviva fue el reportado por Taboada y colaboradores en 1992 [10] quienes dan evidencia 5

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del efecto aglutinante/inmovilizante que en comn tienen 17 diferentes especies de la familia de las Crassulaceae, entre ellas la siempreviva. En concordancia con el estudio anterior, en el trabajo de Taboada tampoco se reporta efecto sobre la viabilidad de los espermatozoides. Ms recientemente, Silva Torres y colaboradores en el ao 2003 reportaron su estudio en el que evaluaron la actividad espermicida del extracto etanlico de esta planta en un modelo animal. Para ello, soluciones intravaginales a diferentes concentraciones del extracto fueron administradas en ratones hembras, para posteriormente permitir el apareamiento. A partir de un frotis vaginal se verific la presencia y viabilidad de los espermatozoides. Por otro lado el efecto que sobre los rganos reproductores de la hembra pudiera tener el extracto se evalu con tcnicas histoqumicas. Los resultados de este estudio indicaron un efecto txico del extracto etanlico de siempreviva sobre la viabilidad de los espermatozoides y ningn efecto sobre el endometrio o el ciclo ovrico de las hembras. Todos estos trabajos han carecido del estudio fitoqumico; hasta el momento slo de Melo y colaboradores reportaron la identificacin de 4 compuestos del tipo flavonoides glicosilados: kaempferol 3-O-_-rhamnopyranosyl-(12)3-O-_-rhamnopyranosylkaempferol 3-O-_glucopyranoside-7-O-glucopyranoside, kaempferol

(12)-_-glucopyranoside-7-O-_-rhamnopyranoside, glucopyranoside-7-O-_-rhamnopyranoside [9].

rhamnopyranoside-7-O-_-rhamnopyranoside(kaempferitrin), y kaempferol 3-O-_Finalmente, incluso hoy en da en algunas comunidades de la zona centro de Mxico se contina empleando la decoccin acuosa de las partes areas de Sedum praealtum en forma de lavado vaginal como un eficiente agente anticonceptivo. Este hecho exhorta una investigacin ms profunda de los componentes activos y los efectos biolgicos de esta planta, sobretodo si se recuerda que los qumicos espermicidas disponibles en la actualidad son detergentes o agentes tensoactivos, inhibidores enzimticos o agentes alquilantes que inhiben la movilidad y metabolismo de los espermatozoides, 6

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pero que sus efectos son poco especficos, teniendo actividad sobre casi cualquier clula con la que entren en contacto. En el presente trabajo tratando de aislar y caracterizar los metabolitos de Sedum praealtum responsables de la actividad espermiosttica/espermicida/aglutinante se opt por estudiar los extractos orgnicos de esta especie. Adems de probar soluciones del jugo obtenido directamente de las hojas, se compar con el efecto del extracto crudo etanlico y 5 fracciones separadas del anterior, las cuales fueron evaluadas en semen humano. Todas las soluciones evaluadas demostraron ejercer un efecto sobre los espermatozoides humanos, pero particularmente el jugo y el extracto etanlico crudo. Este mayor efecto pudiera relacionarse con la mayor concentracin y diversidad de metabolitos que fueron evidenciados cualitativamente con los cromatogramas revelados con indicares especficos. De esta manera reportamos la presencia de alcoholes, compuestos carbonlicos, flavonoides, glucsidos y alcaloides mayormente en el extracto crudo y el jugo pero tambin presente en las 5 fracciones. Los azcares y aminocidos slo se observaron en el extracto crudo etanlico y el jugo. La presencia de alcaloides y aminocidos se reportan por primera vez en Sedum praealtum. Sin embargo una identificacin ms especfica de los compuestos deber realizarse.

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Bibliografa
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