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CINTICA ENZIMATICA

I.

INTRODUCCIN La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios conformacionales ocurren durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados residuos aminocidos en el mecanismo cataltico. Algunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar anlogos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido). Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados. Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARN, respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica en el limitado nmero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras,

II.

aunque sus mecanismos de reaccin y sus cinticas pueden ser estudiados y clasificados por los mismos mtodos. MARCO TEORICO

La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la concentracin de sustrato hasta que la enzima se satura. La reaccin qumica catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto.1 Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

Ensayos enzimticos

Curva de progreso de una reaccin enzimtica. La pendiente representa, en el perodo inicial, la velocidad de la reaccin. La zona de la meseta representa el equilibrio de la reaccin (no confundir con la saturacin). Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica.2 Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido en producto. Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis.3 Estos estudios estn dando una nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de enzima.

En la figura de la derecha se puede observar la tpica evolucin de una curva obtenida en un ensayo enzimtico. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reaccin, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma de curva asinttica en la grfica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos suelen estar estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rpida de lquidos permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a ser inferior a un segundo.4 Este tipo de ensayos rpidos son esenciales para medidas de la cintica del estado estacionario, discutida ms abajo. La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es decir, en la zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es posible medir toda la curva de la reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimticas es denominada anlisis de la curva de progreso.5 Esta aproximacin es muy til como alternativa a las cinticas rpidas, cuando el perodo inicial es demasiado rpido para ser medido con precisin. Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva de dicha actividad. pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica. Concentracin salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentracin de sales del medio es crucial para una ptima actividad enzimtica. Una elevada concentracin o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentracin de iones para mantener su carga y su estructura. Reacciones con un sustrato Las enzimas que presentan un mecanismo de nico sustrato incluyen isomerasas, tales como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas intramoleculares, tales como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa.6 Sin embargo, existen ciertas reacciones enzimticas de nico sustrato que no pertenecen a esta categora de mecanismos, como es el caso de la reaccin catalizada por la catalasa. La catalasa

reacciona inicialmente con una molcula de perxido de hidrgeno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras liberar el producto (agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda molcula de sustrato. Aunque durante la reaccin solo participa un sustrato, la existencia de un intermediario enzimtico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en la categora de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido ms adelante. Cintica de Michaelis-Menten Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catlisis no muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la concentracin de sustrato. Si la velocidad inicial de la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad mxima (Vmax), que no sobrepasar en ningn caso, independientemente de la [S].

Mecanismo de unin de nico sustrato para una reaccin enzimtica. k1, k-1 y k2 son las constantes cinticas para cada una de las etapas de la reaccin. El modelo de cintica michaeliana para una reaccin de nico sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reaccin qumica bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formndose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para una reaccin unimolecular puede ser bastante complejo, existe una etapa enzimtica limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica nica cuya constante es k2. (Ecuacin 1) k2 tambin llamado kcat o nmero de recambio, hace referencia al mximo nmero de reacciones enzimticas catalizadas por segundo. A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] tambin aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reaccin hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reaccin depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeos cambios en la [S]. Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda

la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reaccin (v k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeos cambios en la [S]. En este caso, la concentracin total de enzima ([E]tot) es aproximadamente igual a la concentracin del complejo ES:

Representacin grfica de la curva de saturacin de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin. La ecuacin de Michaelis-Menten describe como la velocidad de la reaccin depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximacin del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuacin:

(Ecuacin 2) Esta famosa ecuacin es la base de la mayora de las cinticas enzimticas de sustrato nico. La constante de Michaelis Km se define como la concentracin a la que la velocidad de la reaccin enzimtica es la mitad de la Vmax. Esto puede verificarse sustituyendo la concentracin de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la etapa limitante de la velocidad de la reaccin es lenta comparada con la disociacin de sustrato (k2 <<< k1), la

constante de Michaelis Km ser aproximadamente la constante de disociacin del complejo ES, aunque sea una situacin relativamente rara. La situacin ms comn, donde k2 > k1, es denominada cintica de Briggs-Haldane. La ecuacin de Michaelis-Menten an se mantiene bajo estas condiciones ms generales, como puede derivarse de la aproximacin del estado estacionario. Durante el perodo inicial, la velocidad de la reaccin es ms o menos constante, indicando que la [ES] tambin se mantendr constante:

De esta forma, la concentracin de ES viene dada por la siguiente expresin:

Donde la constante de Michaelis Km se define as:

Con lo cual, despus de operar todos los factores, obtenemos una frmula general para la velocidad de la reaccin que coincide con la ecuacin de Michaelis-Menten:

La constante de especificidad kcat / Km mide la eficiencia con la que una enzima convierte un sustrato en producto. Utilizando la definicin de la constante de Michaelis Km, la ecuacin de Michaelis-Menten podra escribirse de la siguiente forma:

Donde [E] es la concentracin de enzima libre. As, la constante de especificidad se convierte en una constante bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona con sustrato libre para formar producto. Esta constante viene definida por la frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una solucin, y ronda aproximadamente un valor de 1010 M-1 s-1 a 25 C. Curiosamente, este mximo no depende del tamao del sustrato o de la enzima. La proporcin de las constantes de especificidad para dos sustratos es una comparacin cuantitativa de la eficiencia de la enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuacin de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando [S] << Km) tambin proporciona la constante de especificidad.

Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten

La grfica de Lineweaver-Burke o del doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad. La grfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentracin de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, poda llegar a ser realmente difcil estimar los valores de la Km y la Vmax en las grficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten, dando como resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la cintica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia , se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinticas. La grfica de Lineweaver-Burk o representacin de doble recproco es la forma ms comn de mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo de representacin es una lnea recta cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el mnimo valor posible es 1/[S] = 0, que correspondera a una concentracin infinita de sustrato, donde 1/v = 1/Vmax. El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolacin de datos experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las grficas de Lineweaver-Burke

distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la Vmax y de la Km. Un modelo lineal mucho ms exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones cientficas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por mtodos ms fiables basados en anlisis de regresin no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del anlisis. Cinticas no Michaelianas

Curva de saturacin de una enzima alostrica, donde se puede apreciar una cintica sigmoidea. Algunas reacciones enzimticas dan lugar a curvas sigmoideas, al ser representadas en una curva de saturacin, lo que suele indicar una unin cooperativa del sustrato al centro cataltico de la enzima. Esto quiere decir que la unin de una molcula de sustrato influye en la unin de las molculas de sustrato posteriores. Este comportamiento es el ms comn en las enzimas multimricas, que presentan varias zonas de interaccin con el sustrato. El mecanismo de cooperacin es semejante al observado en la hemoglobina. La unin de una molcula de sustrato a una de las zonas de interaccin altera significativamente la afinidad por el sustrato de las dems zonas de interaccin. Las enzimas con este tipo de comportamiento son denominadas alostricas. La cooperatividad positiva tiene lugar cuando la primera molcula de sustrato unida incrementa la afinidad del resto de zonas de interaccin. Por el contrario, la cooperatividad negativa tiene lugar cuando la primera molcula de sustrato unida reduce la afinidad de la enzima por nuevas molculas de sustrato.

Como ejemplos de enzimas con cooperatividad positiva tenemos la aspartato transcarbamilasa bacteriana y la fosfofructoquinasa, y con cooperatividad negativa, la tirosil ARNt-transferasa de mamferos. La cooperatividad es un fenmeno bastante comn y puede llegar a ser crucial en la regulacin de la respuesta enzimtica a cambios en la concentracin de sustrato. La cooperatividad positiva hace que la enzima sea mucho ms sensible a la concentracin de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a variar en gran medida aunque se mueva en rangos muy estrechos de concentracin de sustrato. Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que la enzima sea insensible a pequeos cambios en la concentracin de sustrato. La ecuacin de Hill suele ser utilizada para describir cuantitativamente el grado de cooperatividad en cinticas no michaelianas. El coeficiente de Hill (n) indica cuntas de las zonas de unin de sustrato de una enzima afectan a la afinidad de la unin del sustrato en el resto de las zonas de unin. El coeficiente de Hill puede tomar valores mayores o menores que 1:

n < 1: indica cooperatividad negativa. n > 1: indica cooperatividad positiva.