UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Facultad de Ingeniera Geolgica, Minera, Metalrgica y Geogrfica E.A.P. DE INGENIERIA GEOLOGICA

BALOTARIO EXAMEN DE APTITUD PROFESIONAL 2007-I

CURSO: MICROSCOPIA ELECTRONICA APLICADA A LA GEOLOGA 1) Cules son los factores por los que est limitada la resolucin?. Indique y Justifique cada una de ellas. 2) Comparacin entre la microscopia ptica, microscopia electrnica de barrido y la microscopia electrnica de transmisin. Ventajas, desventajas, y limitaciones de cada una de ellas. 3) Describa cada una de las partes de la unidad ptica electrnica del Microscopio Electrnico de barrido y para que sirve y desarrolle los tipos de imgenes que se obtienen en la microscopia electrnica de barrido. CURSO: GEOLOGA DE LOS HIDROCARBUROS 1. CUALES SON LOS METODOS GEOFISICOS UTILIZADOS EN LA EXPLORACIN POR HIDROCARBUROS 2. CUALES SON LOS PRINCIPALES REGISTROS DE RESISTIVIDAD, CUAL ES LA UTILIDAD DE ESTOS REGISTROS. 3. QUE INFORMACION NOS PROPORCIONAN LAS MUESTYRAS LATERALES O (SWC) O MUESTRAS DE PARED.

CURSO ALTERACIONES HIDROTERMALES 1.- EL AGUA DE LAS SOLUCIONES HIDROTERMALES. 2.- INCLUSIONES FLUIDAS. 3.- LA DEPOSTACIN DEL METAL

Microscopio ptico: el microscopio consta de un tubo en cuyos extremos se sitan dos lentes 1) Ocular, lente prxima al ojo 2) Objetivo, lente cercana al objeto de estudio Platina: plataforma donde se coloca el portaobjetos con la muestra. La fuente luminosa es la luz natural, normalmente bombilla, antiguamente se usaban espejos. Tambin hay lentes que condensan la luz. Todo el soporte se denomina esttico. Hay dos tipos de tornillos que van a permitirnos un perfecto enfoque: tornillo micromtrico y tornillo macromtrico. El nmero de aumentos total es el producto de los aumentos del ocular y objetivo. Los objetivos, normalmente 4, se colocan en el revlver, con aumentos generalmente de 3, 10, 30 y 100. El aumento del ocular suele ser x10 o x15. Todas las lentes tienen algn defecto, son las conocidas aberraciones. Tipos de aberraciones: - Esfrica: no es posible enfocar homogneamente por toda la superficie. - Cromtica: aparecen alteraciones en el contorno de los objetos observados. 1) Microscopio ptico de luz ordinaria. La calidad de la imagen observada depende de varios parmetros, pero sobre todo del poder de resolucin = capacidad del microscopio de ver la distancia entre dos puntos del objetivo. A mayor calidad del microscopio mayor poder de resolucin. El poder de resolucin depende del ngulo de la luz incidente y de otro factor. Existen varios tipos en funcin de la orientacin de la luz que utilizamos, y dependiendo tambin del tipo de microorganismo que queramos observar: - Microscopio ptico de campo claro: el ms utilizado, observamos en l un fondo luminoso, color claro pero en el organismo tenemos un ligero color oscuro (vemos las sombras). Si la luz no encuentra obstculos en su camino, se divisa el campo claro. - Microscopio ptico de campo oscuro: al contrario, el fondo es de color oscuro pero lo que observamos, es decir, el microorganismo est claro. Se consigue colocando en el condensador una anilla que permite el paso de unos rayos de luz que sern enviados, reflejados, de tal manera que si no encuentran nada no entran en el objetivo, no se ve nada. Microscopio ptico de contraste de fases: Las estructuras internas de las clulas presentan diferentes ndices de refraccin, y tambin diferente al medio que les rodea, con lo cual es con estas diferencias con las que funciona el microscopio de contraste de fases. Se emplean objetivos de fase y condensadores especiales, que hacen lo contrario que los normales. Lla luz ordinaria al pasar por este condensador se desfasa si no encuentra nada en su camino, campo claro. Pero si estas ondas desfasadas se

encuentran con algo, se desfasan an ms en funcin del ndice de refraccin. Este fenmeno no es un campo oscuro, es gris pero con diferentes tonalidades en funcin de la estructura. Para el caso de las bacterias, al haber pocos orgnulos este microscopio resulta muy poco til. En cambio, con las levaduras o los hongos filamentosos se produce una mejora notable en la observacin. La utilizacin ms comn para cada uno de estos tipos es la siguiente: - CAMPO CLARO: su ampliacin mxima til son 1000-2000. La muestra, aparece teida o no del color del colorante utilizado. Se usa generalmente para ver caractersticas morfolgicas de bacterias, hongos, algas y protozoos. - CAMPO OSCURO: su ampliacin mxima til son 1000-2000. La muestra aparece brillante, sobre un fondo oscuro (generalmente no se tie). Se usa para ver microorganismos que muestran alguna caracterstica morfolgica en estado vivo y en suspensin. (flagelos o cpsida por ejemplo). - FLUORESCENCIA: su ampliacin mxima til son 1000-2000. En la muestra se ven bacterias brillantes y coloreadas, con el color del compuesto fluorescente. Estos compuestos transforman la luz, aumentan la longitud de onda para que podamos ver la luz ultravioleta, que es la que los activa. El ms utilizado es el microscopio de campo claro, pero con objetivos que produzcan el contraste de fases, pudiendo alternar esta posibilidad con gran facilidad. 2) Microscopio ptico de luz ultravioleta. Caractersticas y funcionalidad. Inconveniente: la luz ultravioleta no es visible por el ojo humano. Para poder verla se hace incidir sobre una pantalla o si no por excitacin fotogrfica. Pero sobre todo se utilizan sustancias qumicas que absorben la energa de la luz ultravioleta y emiten radiaciones que pueden ser vistas, colorantes fluorescentes. Existen clulas que de por s son fluorescentes. Microscopio Electrnico: la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (para mejorar el paso de los electrones, en el tubo se ha hecho el vaco). Importante: Permite la observacin de las estructuras interiores de las clulas. Sirve para visualizar virus. Tiene una resolucin de 10 A (se pueden ver cosas muy pequeas, incluso molculas). Fuente luminosa: Haz de electrones lanzado por un can en el que se establece una diferencia de potencial, entre el ctodo y el nodo. El chorro de electrones pasa a travs de la muestra a observar, que est colocada en una rejilla (d << 3 mm). Los electrones chocan con la muestra y se desvan, y estas desviaciones son recogidas por la pantalla. La imagen que vemos, la observamos a travs de una pantalla que es excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo parecido a la televisin). Las imgenes las recogemos mediante una placa fotogrfica que es impresionada directamente por los electrones. El haz tiene una longitud de onda muy pequea, por esto la resolucin es tan pequea: pequeo poder de resolucin. Problema: los electrones tienen poco poder de penetracin en el medio normal, por lo que para permitir/facilitar el desplazamiento, hay que realizar el vaco en el medio tubo a travs del que se desplazan. Existen condensadores/electroimanes que dirigen la direccin del haz. Es un

tubo acoplado a todo un sistema para realizar el vaco. Luego hay una pantalla de TV. Cmara fotogrfica. Hay diferentes tcnicas para los diferentes tipos de microscopio electrnico: - Microscopio electrnico de transmisin, sirve para observar estructuras internas de la clula. Mtodo de corte fino: consiste en cortar las bacterias y observar las estructuras internas de ellas. Para la realizacin de estos cortes, el material a estudiar hay que laminarlo en rodajas muy finas (cortes) y colocarlas sobre una rejilla metlica (equivalente al portaobjetos en el microscopio ptico). Para realizar estos cortes, antes tenemos que realizar una serie de manipulaciones en la muestra: FIJACIN: mantener la clula muerta pero con las caractersticas intactas. Lo ms parecido posible a lo natural. Se usan compuestos qumicos, como gluteraldehdo, permanganato potsico y tetrxido de osmio. - INCLUSIN: en una sustancia dura que nos permita luego cortar. Se usan resinas con dos componentes: EPOXI, que hay que mezclar y esperar a que polimerice. Pero para incluir, debemos realizar otro paso: DESHIDRATACIN: sacar todo el agua, para poder ser sustituido por resinas, que son solubles en alcohol/acetona. Sumergimos la clula en disoluciones de alcohol, cada vez > [alcohol] < [agua]. 60% 70% 80% ... hasta 100% resina. Ahora se espera media hora o una hora, de reposo. Una vez que la tenemos llena de alcohol, la llenaremos de resinas que s que son solubles en agua. La operacin es la misma, se hace gradualmente, con disoluciones de resinas cada vez > [resina], para que esta resina polimerice. Tratamiento trmico (24h - 60C). Se obtiene as un cilindro (de resina polimerizada) en cuyo interior est la muestra. Cortamos con un ultramicrotomo en lminas muy finas y ya podemos observar las estructuras de la clula sin problemas. (dicho microtomo realiza cortes nicamente visibles a la lupa). La muestra se hace pasar por la cuchilla (de vidrio o diamante) realizndose cortes muy pequeos, y se colocan sobre la rejilla metlica = portaobjetos. Esta rejilla se pone en el centro del tubo del microscopio, de modo que los electrones atraviesan la muestra, en funcin de la opacidad obtenemos una imagen con tonalidades grises. Un inconveniente de este procedimiento es que la muestra no es muy duradera, ya que, con el paso de los electrones se va deteriorando poco a poco. Para favorecer y remarcar estas diferencias de coloracin, se pueden usar: TINCIONES, con metales pesados (acetato de plomo). Se fijan a diferentes estructuras celulares, y estos metales pesados no permiten el paso de los electrones, por lo tanto, tenemos un mayor contraste. Microscopio electrnico de Barrido, los electrones no atraviesan la muestra, sino que son reflejados y recogidos por un amplificador: transmitidos a la televisin y la cmara de fotos.

Tiene un mayor poder de resolucin que el anterior, vemos cosas ms grandes. Vemos la estructura externa de las clulas a observar: no hay cortes, pero si necesitamos hacer fijaciones (en cambio, no es necesario deshidratar). El proceso que realizamos es la metalizacin, depositamos sobre la superficie la capa metlica que refleja los electrones, entonces la imagen es la de la superficie de las clulas. La imagen que obtenemos es similar a la del sombreado, pero en este caso suelen darnos imgenes en tres dimensiones.

El Tamao de las Clulas y los diversos microscopios Tamaos de clulas, virus, y otras cosas pequeas: La biologa es un rea muy rica visualmente. Sin embargo muchas de las estructuras y eventos biolgicos ms interesantes son ms pequeos de lo que el ojo humano puede ver

sin ayuda. En realidad el ojo humano tiene una resolucin de cerca de 100 m. En el cuadro de abajo note que de todas las estructuras listadas, solamente la clula vegetal est; escasamente dentro de nuestra resolucin.

El Microscopio ptico

El microscopio ptico tiene un limite resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m ). Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 m). Las

clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar vivas o fijadas y teidas.

El Microscopio Electrnico de Transmisin(MET) El microscopio electrnico de transmisin (MET) tiene un limite de resolucin de cerca de 2 nm. Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET mira a replicas de clulas muertas, despus de haber sido fijadas y teidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a travs de una fina seccin del espcimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.

El Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)

El microscopio electrnico de barrido (MEB) tambin tiene un limite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a clulas muertas, despus de haber sido fijadas y teidas con iones de metales pesados. Con esta tcnica los electrones son refractados sobre la superficie del espcimen.

Resolucin: Una buena resolucin supone que dos puntos adyacentes de una imagen pueden percibirse separados uno del otro. Si una imagen tiene una resolucin pobre, los dos puntos parecern uno solo. Naturalmente, una imagen con poca resolucin aportar pocos detalles. Por ejemplo, un aparato de televisin con alta resolucin proporciona una imagen ntida, mientras que en un televisor con pobre resolucin se ve borroso. Un mayor aumento no mejora la resolucin. As, una pantalla grande de TV, si ste tiene pobre resolucin, simplemente produce una imagen borrosa de mavor tamao. A diferencia del contraste, que es una propiedad del objeto que se est estudiando, la resolucin es una propiedad del sistema de lentes del microscopio. Se denomina poder de resolucin de un microscopio a la menor distancia entre dos puntos adyacentes que pueden ser percibidos por separado uno del otro (ver la descripcin de apertura numrica, ms adelante). Cuanto ms cercanos estn los puntos que pueden ser distinguidos entre si, ms detalles podrn ser observados y por tanto sern visibles objetos ms pequeos. El poder de resolucin depende de tres factores: (1) el tamao de la primera lente de aumento llamada lente objetivo, (2) la longitud de onda de la luz empleada en la iluminacin del espcimen (objeto a ser visualizado), y (3) el indice de refraccin del material que se encuentre entre la lente objetivo y el espcimen. Se debe tener en cuenta que un poder de resolucin de 4 nm es mayor que uno de 5 nm. Las lentes de mayor tamao tienen mayor poder de resolucin. Esto se debe a que las lentes grandes permiten que las atraviese un cono de luz mayor. Por tanto, se puede

incrementar el poder de resolucin -que es siempre la meta- aumentando el tamao de la lente objetivo. Sin embargo, en la prctica, el tamao de esta lente en un microscopio siempre est limitado. Cmo influye la longitud de onda de la luz de la fuente del microscopio en el poder de resolucin? Recordemos que la luz se difracta (se desva) cuando pasa a travs de pequeas ranuras o cerca del borde de un objeto opaco y emerge como un semicrculo. Cuando dos puntos se encuentran cercanos uno de otro, producen frentes de onda que tienden a unirse y, por tanto, parecen uno solo, El resultado es una prdida de detalle. Una solucin es iluminar el espcimen con una longitud de onda ms corta. Por ejemplo, la luz azul proporciona mayor poder de resolucin que la luz roja. Sin embargo, el incremento en el poder de resolucin logrado no es grande. Para aumentarlo por un factor considerable, se usan ondas electromagnticas con una longitud de onda mucho ms corta que la de la luz visible. Esto explica el alto poder de resolucin del microscopio electrnico, que explicaremos ms adelante. El tercer factor que influye en el poder de resolucin es el ndice de refraccin del material existente entre la lente objetivo y el espcimen. Como hemos dicho anteriormente, el ndice de refraccin y la velocidad de la luz depende de la diferencia de densidad entre dos materiales. Un material con alto ndice de refraccin disminuye la velocidad de la luz, lo cual incrementa la resolucin. Normalmente, el material existente entre el objetivo y la preparacin es el aire. El aire posee un ndice de refraccin de aproximadamente 1,0. Algunas lentes objetivo, denominadas lentes de inmersin, se utilizan sumergidas en aceite (poniendo aceite entre la preparacin y el objetivo). Utilizando aceite de inmersin, un fluido viscoso que posee un ndice de refraccin de 1,5, se aumentar considerablemente la resolucin Adems no se perder luz por reflexin fuera de la superficie de la lente objetivo, debido a que el aceite de inmersin y el cristal poseen el mismo ndice de refraccion, Dos de los factores que determinan el poder de resolucin -el tamao de la lente y el uso del aceite de inmersin- son propiedades intrnsecas de la lente. Una medida de esos dos factures, denominada apertura numrica (AN), viene grabada en un lado de la lente objetivo del microscopio. Conociendo la AN y la longitud de onda de la luz de la fuente de un microscopio, se puede calcular la distancia (d) entre dos puntos que pueden observarse como entidades separadas:

Por ejemplo, si la longitud de onda de la luz azul usada es 450 nm y el valor de la AN es 0,65 (valor normal para una lente de inmersin de alta calidad), la distancia ser igual a 346 nm [450/(2 x 0,65) = 346)], es decir, aproximadamente la tercera parte del tamao de una clula bacteriana de dimensiones medias. Esto significa que no se podrn observar muchos detalles internos en una bacteria.
El microscopio electrnico utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual debe mantenerse el vaci. El ctodo est constituido por un filamento de tungsteno, que al calentarse elctricamente emite los electrones, los cuales son atrados hacia el nodo por una diferencia de potencial de 50.000 a 100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el objeto que se observa, cuya preparacin exige tcnicas especiales. Los electrones chocan contra la

preparacin, sobre la cual se desvan de manera desigual. Con el objetivo se enfoca la imagen, que es ampliada por la lente de proyeccin. Para variar los aumentos en el microscopio electrnico basta variar la distancia focal de la lente proyectora. Como los electrones no impresionan la retina del ojo humano, debe recogerse la imagen del microscopio electrnico en una pantalla fluorescente, la cual posee una superficie impregnada con fsforo o sulfuro de cinc. La imagen obtenida en esta pantalla puede fotografiarse. Se acostumbra utilizar el trmino microfotografias para las fotografas tomadas a travs del microscopio ptico y micrografa o electromicrografia para las que se toman en el microscopio electrnico. Los aumentos mximos conseguidos en el microscopio electrnico son del orden de 2.000.000 (dos millones de aumento!) mediante el acoplamiento al microscopio electrnico de un amplificador de imagen y una cmara de televisin. En resumen, el microscopio electrnico consta esencialmente de: a. Un filamento de tungsteno (ctodo) que emite electrones. b. Condensador o lente electromagntica, que concentra el haz de electrones. c. Objetivo o lente electromagntica, que ampla el cono de proyeccin del haz de luz. d. Ocular o lente electromagntica, que aumenta la imagen. e. Proyector o lente proyectora. que ampla la imagen. f. cPantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano. Tipos de Microscopios Electrnicos Existen varios tipos de microscopios electrnicos, que cada da se perfeccionan ms. El microscopio electrnico de transmisin que utiliza un haz de electrones acelerados por un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una seccin muy fina de la muestra, sean tejidos, clulas u otro material. El microscopio electrnico de barrido se utiliza para el estudio de la morfologa y la topografa de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los 20.000 voltios. Las lentes magnticas utilizan un haz muy fino de electrones para penetrar repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en la pantalla de un monitor. El microscopio electrnico mixto tiene propiedades comunes con el de transmisin y con el de barrido y resulta muy til para ciertas investigaciones. Hay otros microscopios analticos que detectan seales caractersticas de los elementos que constituyen la muestra. Con estos poderosos instrumentos, que utilizan el flujo de electrones y las radiaciones electromagnticas as como la aplicacin de tcnicas histoqumicas y bioqumicas, adems del empleo de marcadores radiactivos, se han logrado grandes avances en la biologa celular. Medicin a travs del Microscopio