ELABORACIN DE FROTIS SANGUNEO

CAPTULO

COLORACIN DE FROTIS SANGUNEOS: Las tinciones hematolgicas se pueden clasificar segn diferentes criterios: 1- Atendiendo al grado de vitalidad de las clulas a colorear: -Coloraciones vitales o supravitales: Se realiza sobre clulas vivas. Son colorantes vitales, el azul de metileno, el naranja de acridina, y el verde jano. - Coloraciones no vitales: Se realiza sobre clulas muertas por lo cual es necesario un proceso de fijacin previo. 2- Atendiendo a la utilizacin de un solo colorante (monocroma), o al uso de varios colorantes (policromasia). En este tipo de coloraciones se encuentran las coloraciones tipo Romanowsky. Para la coloracin de extendidos de sangre perifrica y de la mdula sea se utilizan los colorantes tipo ROMANOWSKY. Estos consisten en una mezcla de eosinato de azur de metileno, eosinato de azul y de violeta de metileno. El azur de metileno es un derivado por oxidacin de azul de metileno, se forma en las mezclas de eosina y azul de metileno as como tambin espontneamente en las sales viejas de azul de metileno. El azul de metileno colorea selectivamente la cromatina y las sustancias azurfilas. El violeta de metileno es tambin un derivado del azul de metileno y se obtiene igual que el azur, a este se debe la coloracin metacromtica de granulaciones basfilas. Los colorantes de tipo ROMANOWSKY son inactivos cuando estn disueltos en alcohol metlico actuando previamente como un fijador. Si agregamos agua de la dilucin, precipitan y al pasar del estado de solucin al de precipitacin es cuando actan con la particularidad de volverse otra vez inactivos cuando han precipitado totalmente. Como las propiedades de coloracin dependen de una disociacin balanceada del complejo neutro, el pH del alcohol metlico y del agua son de gran importancia. El alcohol metlico absoluto no debe contener trazas de acetona ni de cido actico y el agua debe ser neutra o usarse un amortiguador neutro ligeramente cido.

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A las coloraciones de tipo ROMANOWSKY pertenecen Giemsa, Wright, Leishman y la coloracin de Peppenheim, que es una asociacin de dos colorantes.

COLORACIN DE WRIGHT.
El colorante de Wright, se encuentra en el comercio bajo dos formas: en polvo para que la solucin colorante sea preparada en el laboratorio o la solucin ya preparada. Preparacin de la solucin colorante: a) Colocar 1g. de colorante de Wright en un mortero limpio y seco. b) Medir 600cc de alcohol metlico libre de acetona y vaya aadiendo pequeas cantidades de ste en el mortero triturando el polvo, transfiriendo el sobrenadante a un frasco mbar limpio y seco, aada ms alcohol metlico y repita la operacin hasta que todo el polvo se haya disuelto completamente en los 600cc de alcohol metlico. c) Se deja madurar durante 15 das por lo menos. uso diario. Mantenga los frascos bien tapados para evitar la evaporacin de alcohol o la entrada de vapor de agua. Preparacin de la solucin amortiguadora: Buffer de Fosfatos a pH 6,4: Fosfato Monobsico de Potasio anhidro (K H 2 PO4 )....................6.63 g. Fosfato dibsico de sodio anhidro (Na2 HPO4 )............................2.56 g Agua destilada............................................................................ 1000 cc. Buffer de Fosfato a pH 6,7 Fosfato monobsico de potasio anhidro (KH 2 PO4 ).....................5.13 g. Fosfato dibsico de sodio anhidro (Na2 HPO4).............................. 12 g. Agua destilada..............................................................................1000 cc. Tcnica de coloracin: d) De esta solucin filtre pequeas porciones en frascos gotero para el

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a) Coloque las laminillas o lminas con el frotis hacia arriba en una bandeja de coloracin. b) Cubra el frotis bien seco con la solucin de WRIGHT. c) Se deja actuar durante dos minutos. En esta etapa se fija el frotis a la laminilla por desnaturalizacin de las protenas con el alcohol metlico. d) Sin derramar el colorante se agrega igual nmero de gotas de agua neutra o de buffer, que las aadidas anteriormente. Este segundo tiempo vara de 3 - 5 minutos y es la etapa de coloracin. e) Se sopla para que se mezcle bien el agua y la solucin colorante. Cuando se ha mezclado bien se observa en la superficie un brillo metlico. f) Se lava con agua destilada hasta que no queden restos de colorante y se deja secar bien al aire. g) Una vez seco los frotis, se debe eliminar la tincin de la parte posterior de la preparacin pasando con cuidado una gasa impregnada con alcohol. NOTA: Puede suceder que cuando se utilice un nuevo lote de colorante varan los tiempos de fijacin y coloracin, as como tambin las cantidades relativas de colorante y de buffer. Resultados de la coloracin de Wright: En una buena tincin, la preparacin debe presentar un color rosado a simple vista. Microscpicamente se observa: a) Los hemates de color rosa. b) Los ncleos de los leucocitos azul prpura. c) El citoplasma de los leucocitos neutrfilos maduros, de color rosado plido. d) En otras clulas el color del citoplasma puede variar desde los tonos azules muy oscuros de las clulas plasmticas y de los eritroblastos basfilos, hasta el tono azul celeste de los linfocitos. e) El citoplasma de los monocitos se colorea de azul gris.

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f)

Las granulaciones se definen muy bien:

Neutrfilas se ven de color lila.

Eosinfilas, rojo anaranjada. Basfilas, azul-negro o violeta.

Azurfilas, prpura-rojiza.

Defectos de coloracin: a) Coloraciones excesivamente azules: - Resultan del lavado insuficiente, - Extendidos muy gruesos, - Tiempo de coloracin excesivo - Alcalinidad muy alta del amortiguador, del agua o del colorante. - Colorante muy concentrado, - Tiempo de secado insuficiente Para mejorar el color puede emplearse menos colorante o ms diluyente, o bien reducir el tiempo de tincin y aumentar el tiempo del lavado. b) Coloraciones excesivamente rojas: - Resultan de acidez excesiva del colorante, del amortiguador o del agua. - Extensin muy fina, - Colorante diluido, - Tiempo insuficiente de tincin, - Excesivo tiempo de lavado - Agua de lavado con cloro c) Coloraciones plidas: - Resultan del lavado excesivo o falta de tincin adecuada.

Desventajas de la coloracin de Wright: a) Una de las dificultades que plantea el empleo del colorante de Wright es que trata de una solucin alcalina donde la concentracin

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del colorante se modifica en forma contina por oxidacin progresiva del lcali. b) Otra desventaja son las alteraciones en la concentracin del disolvente (alcohol metlico) por evaporacin del colorante cuando se agrega agua durante la tincin. Elementos que pueden inducir a error: Presencia de precipitados de colorante: - La accin prolongada del colorante deja restos - Falta de filtracin del colorante. - Utilizacin de portaobjetos sucios o engrasados Presencia de artefactos en la muestra: - Una accin prolongada del anticoagulante, puede entre otras cosas ocasionar: a- Vacuolas en el citoplasma de los monocitos. b- Segmentacin nuclear c- Agregacin de plaquetas alrededor de los leucocitos. d- Espiculacin de hemates. e- Clulas fragmentadas - Utilizar portaobjetos sucios, puede ocasionar: a- Micro burbujas b- Partculas que se confunden con plaquetas c- Precipitados de clulas microbianas que pueden dar imgenes falsas.

COLORACIN DE GIEMSA:
Preparacin del colorante: Azur II Eosina 3 g Azur II .. .. 0.8 g Glicerina pursima ..................................... 125cc Alcohol metlico puro ................................. 375cc El alcohol metlico es el disolvente, la glicerina permite aumentar la concentracin del colorante, evitando as los inconvenientes que podran

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provenir de la extrema volatilidad del alcohol metlico. En el momento de usarla se debe diluir esta solucin en agua neutra o soluciones buffer de pH. 6,4 a 6,8. Preparacin de la solucin Buffer: Fosfato disdico (Na2 HPO4)................................... 0.6 g 0.4 g Fosfato monopotsico (KH2 PO4)..............................

Agua destilada........................................................... 100 cc. Para preparar la solucin de trabajo, se diluyen 10 cc de la solucin stock y se llevan a 500 cc con H2O destilada. En caso de no tener solucin buffer puede usarse agua neutra, para obtenerla se mezclan partes iguales de agua destilada ( cida) y de agua de chorro (alcalina). Para comprobar que qued neutra se le agrega 1 gota de solucin alcohlica de rojo neutro al 1% a cada litro de agua, la presencia de un pH neutro se pone de manifiesto por la aparicin de una coloracin anaranjada. Si se observa un color rosado el agua est cida y se podr neutralizar con unas gotas de solucin diluida de Carbonato de Sodio. Si por el contrario el indicador revela una coloracin amarilla, el agua est alcalina y podr agregrsele unas gotas de cido actico diluido hasta neutralizarla. Tcnica de la coloracin: a) La solucin de trabajo de Giemsa se prepara a partir de la solucin madre as: Coloque en una copa graduada 2 cc de buffer o de agua neutra y agregue por cada cc de buffer medido una gota de la solucin madre de Giemsa (tambin puede agregarse 2 gotas por cada cc de buffer dejando actuar el colorante la mitad de tiempo). b) Se procede a fijar el frotis agregndole unas gotas de metanol suficiente para cubrir las lminas. Djelo actuar por 3 minutos. Tambin puede usarse alcohol absoluto dejndolo actuar 5 minutos. c) Terminada la fijacin se bota el alcohol sobrante o se deja que se evapore.

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d) Se cubre la lmina con la solucin Giemsa diluida y se deja actuar por 30 minutos. Si se agreg 2 gotas de Giemsa por cada cc de buffer se deja actuar por 15 minutos. e) Lave la lmina y djela absorbente. Resultados: La solucin de Giemsa colorea muy bien la cromatina y las granulaciones acidofilas y basfilas. secar colocndola sobre papel

COLORACIN DE WRIGHTGIEMSA:
Se han obtenido muy buenos resultados combinado estas dos coloraciones teniendo la ventaja de que los frotis se conservan coloreados por mucho mas tiempo. Tcnica: a) Coloracin de Wright. b) Despus de lavar la lmina se le agrega Giemsa diluido dejndolo actuar por 20 minutos. c) Lavar.

MONTAJE DE LA PREPARACIN: Una vez que los frotis sanguneos han sido coloreados y estn secos se procede a montarlos para la observacin microscpica: Si los frotis se han realizado en cubreobjetos se colocan stos sobre un portaobjeto y entre ambos se coloca aceite de inmersin. Si los frotis se han realizado en portaobjetos se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin y entre ambos una gota de aceite de inmersin. En cualquiera de los dos casos anteriores debe utilizarse suficiente aceite y extenderlos completamente evitar burbujas de aire. entre el portaobjeto y cubreobjetos a fin de

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Cuando se va a realizar la observacin microscpica con objetivo de inmersin (100 X), se coloca una gota de aceite de inmersin encima del cubreobjetos.

EXAMEN MICROSCPICO DEL EXTENDIDO DE SANGRE Uno de los exmenes ms importante en el estudio de la sangre lo constituye la observacin microscpica detallada del extendido de sangre ya que permite hacer un estudio cualitativo de los diferentes elementos celulares. Lo primero que debe hacerse es observar la preparacin con objetivo seco de menor aumento as podemos tener una visin panormica del extendido y comprobar si el frotis es satisfactorio en cuanto a distribucin de los elementos y en cuanto a coloracin. Una vez juzgado el frotis como satisfactorio se elige una de las mejores reas para hacer un examen mas detallado primero a mediano aumento y luego con lente de inmersin. Se examina sistemticamente los glbulos rojos, los glbulos blancos y las plaquetas anotando cualquier alteracin cualitativa que se observe as como tambin la posible presencia de clulas extraas a la sangre o de parsitos intra o extracelulares. 1) Glbulos rojos: a) Tamao (microcitosis, macrocitosis. normocitosis) y variacin de este (ANISOCITOSIS), los eritrocitos normales tienen aproximadamente 7 micras de dimetro. b) Forma (esferocitos, ovalocitos, clulas en diana, etc.) y variaciones de sta (POIQUILOCITOSIS) c) Intensidad del color de los glbulos, que nos da una idea de su contenido en hemoglobina ya que sta es el principal componente coloreable de los eritrocitos. d) Variaciones del color (basofilia difusa, policromatofilia). Presencia de estructuras coloreables intraeritrocitarias (anillos de Cabot, corpsculos de Howell-Jolly) as como la presencia de glbulos rojos inmaduros

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nucleados (normoblastos eritoblastos) los cuales confundirse con los glbulos blancos. 2) Glbulos blancos:

NO deben

Para la identificacin de los distintos tipos de leucocitos es necesario examinar cuidadosamente cada clula, observando las siguientes caractersticas : a) Tamao de la clula en comparacin con el de otra clula observadas en el mismo frotis. b) Examinar el ncleo, observando:

Su posicin dentro de la clula: central o excntrico Su forma: redondo, arrionado, en cayado, si es o no segmentado y
nmero de segmentos.

Su color. Estructura de la cromatina: malla fina, laxa, medianamente gruesa o

gruesa

Si presenta nuclolos no.

c) Examinar al citoplasma, observando:

Cantidad relativa en comparacin al tamao celular y al tamao del

ncleo: escaso, moderado, abundante .

Coloracin: azul, rosa , etc. Si se observa zona clara perinuclear o no. Si presenta o no granulaciones, su nmero aproximado, su color y
su distribucin. 3) Plaquetas: a) Lo primero que debe comprobarse es su presencia o ausencia en el extendido y hacer una apreciacin aproximada de su nmero. b) Luego se observa su morfologa y su tamao. Normalmente son corpsculos de 2 a 3 micras de dimetro con una parte granular central de color prpura y un citoplasma hialino rosa en la periferia. En algunos casos, pueden observarse variaciones muy marcadas en el tamao de

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las plaquetas (ANISOCITOSIS plaquetaria) y en otros casos plaquetas muy grandes (MACROTROMBOCITOS). Ocasionalmente, se pueden observar en sangre perifrica fragmentos de megacariocitos.

BIBLIOGRAFA 1.- Balcells, A. La Clnica y el Laboratorio. 11. Edicin. 1.978 2.- Casas, A. Laboratorio Clnico. Hematologa. Interamericana. Mc.GrawHill. 1994. 3.- McKenzie, Shirlyn B., Hematologa Clnica. 2da Edicin. Editorial Manual Moderno. Captulo 27. 2.000 4.- Sonnenwirth - Jarett. Mtodos y Diagnsticos de Laboratorio . Editorial Mdica Panamericana. Tomo 1. 1983. 5.- Serrano, Josefa M. (2.005). Fundamentos y Tcnicas de Anlisis Hematolgicos y citolgicos. Editorial Masson S.A 6.- Vives Joan LL. (2.001). Manual de tcnicas de Laboratorio en Hematologa. Editorial Masson S.A