El papel del estrs oxidativo frente el sndrome de la diabetes mellitus Introduccin La oxidacin es un proceso qumico en el que un tomo sede

sus electrones a una molcula oxidante, misma que los captara mediante un proceso llamado reduccin, estos dos procesos suceden simultneamente y son indispensable para los organismos, ya que de esta manera obtienen su energa celular. Los organismos aerobios necesitan oxgeno para mantener una produccin de energa suficiente para poder sobrevivir, esto lo logran mediante reacciones bioqumicas de oxido-reduccin, mismas que producen radicales libres (RL), Especies Reactivas de Oxigeno (EROS), Especies Reactivas de Nitrgeno (ERN), entre otras molculas, que en exceso pueden ser dainas para las biomolculas o incluso participar como intermediarias para la generacin de nuevos RL (3). Los RL al igual que las EROS y las ERN son molculas que contienen uno o mas electrones desapareados en su orbital mas externo, y son capaces de existir en forma independiente, estas molculas propician desbalances en los organismos, por medio de reacciones en cadena, estas reacciones solo pueden ser eliminadas por la accin de otras molculas llamadas sistemas antioxidantes de defensa (3). Los antioxidantes son molculas que neutralizan el dao oxidativo inducido por las especies reactivas, los antioxidantes se clasifican en tres grupos dependiendo de su funcin; en el primero se encuentran los antioxidantes de tipo enzimticos, como la Superxido Dismutasa (SOD), la Glutatin Peroxidasa (GPX) y la Catalasa (CAT), estas enzimas encargan de proteger al organismo contra la formacin de nuevos RL. Entre los sistemas antioxidantes no proteicos, se encuentran dos subgrupos; el primero lo constituyen los antioxidantes hidrofilicos, como la vitamina C, el acido rico, la bilirrubina y la albumina; por otro lado, se encuentra el subgrupo de los componentes alifticos, que se componen de vitamina E, carotenoides y ubiquinonas (5). Finalmente el organismo cuenta con diversas molculas que se encargan de reparar a las biomolculas daadas por los RL, en este grupo se incluyen las proteasas reparadoras de DNA y la metionina sulfoxido reductasa. Cuando los organismos presentan un desbalance entre la produccin de RL y la actividad de los sistemas antioxidantes, este presenta una condicin de Estrs Oxidativo (EOx) (2). Aunque el estrs oxidativo no es una causa directa del aparecimiento de diversas enfermedades y padecimientos en el organismo, se ha demostrado que existe una relacin entre el aumento en la produccin de RL y una disminucin en los sistemas antioxidantes, en pacientes con diversos padecimientos, tal es el caso

del envejecimiento, diabetes Mellitus la insuficiencia renal aguda, hipertensin arterial y cirrosis, por mencionar algunas (1). La diabetes es una enfermedad metablica crnico-degenerativa en la cual el pncreas no produce insulina suficiente o el organismo no la puede utilizar eficazmente. La principal caracterstica de este sndrome es la elevada presencia de glucosa en el torrente sanguneo, lo que se conoce como hiperglucemia (6). Pacientes diabticos han presentado aumentos en la cantidad de RL y disminuciones en las defensas antioxidantes, esto debido a la accin de diversos mecanismos implicados en el incremento del EOx en la diabetes mellitus, tal es el caso de la autooxidacin de la glucosa, la glucacin de protenas, la activacin de la va de los polioles, la disminucin de las defensas antioxidantes y la produccin de EROS y ERN mitocondriales a partir de la hiperglucemia crnica (8). En la diabetes un desbalance entre los EROS y los antioxidantes, propicia la resistencia a la insulina, debido a que en presencia de estrs oxidativo no se estimulan adecuadamente las vas de sealizacin mediadas por esta hormona, adems de presentar cambios qumicos y estructurales inducidos por molculas presentes en el EOx, mismos que le impiden desempear su funcin biolgica (1). Dentro de los modelos para inducir diabetes en roedores se encuentran los que emplean agentes qumicos, como el aloxano, el cido caproico, el cido picrolnico y la estreptozotocina (STZ). Estos compuestos en dosis diabetognicas actan especficamente sobre las clulas pancreticas. (7) Las nitrosoreas, como STZ, fotemustina, clomesone y procarbazine, inducen dao del ADN debido a la alquilacin de sitios especficos de sus bases generando radicales libres, como el NO, durante su metabolizacin, mismos que aumentan el nivel de Eox en el organismo. Para evitar el aumento del estrs oxidativo en los diabticos se ha optado por alcanzar un control metablico ptimo, y por someterse a terapias antioxidantes naturales y artificiales. Aunque nuestro cuerpo es capas de sintetizar sus propios antioxidantes, la produccin de RL suele ser mayor que la de antioxidantes, por lo que resulta indispensable la ingesta de antioxidantes no slo en pacientes diabticos. En la naturaleza podemos encontrar estos sistemas antioxidantes en diversas frutas y vegetales como en las Uvas, Cerezas, Kiwis, Zanahorias, Tomates, Naranjas, Papayas, Lechugas, espinacas, Pimientos, Chiles, por mencionar algunos (3). El chile es una buena fuente diettica de antioxidantes como flavonoides, compuestos fenlicos, carotenoides, cido ascrbico, vitamina A, y capsaicinoides. Los capsaicinoides son molculas encargadas de dar la pungencia en los chiles, el 90% esta compuesto por la capsaicina (CAP) y la dihidrocapsaicina.

En la actualidad se sabe que debido a sus propiedades la capsaicina tiene muchos usos medicinales, ya que es usada como analgsico, antiinflamatorio y como agente inhibidor del cncer, tambin se sabe que esta molcula presenta actividades antioxidantes, mismas que podran ayudar a disminuir las cantidades de RL y por lo tanto los niveles de estrs oxidativo (4). Hiptesis: Si el chile habanero (capsicumm chinense) posee actividad antioxidante entonces podr reducir los niveles de estrs oxidativo presentes en ratas W istar inducidas con diabetes mellitus. Objetivo General: Determinar si el extracto hidroalcohlico de Capsicum chinense tiene un efecto antioxidante que inhiba los niveles de Eox inducido por diabetes mellitus en ratas W istar.

Objetivos: Extraer a partir de Capsicum chinense, un extracto hidroalcohlico con propiedades antioxidantes. Determinar si existe una disminucin del Eox en ratas Wistar con diabetes mellitus. Determinar mediante el ensayo Cometa, el nivel de dao en el DNA de ratas Wistar, provocado por el Eox en presencia de diabetes mellitus, antes y despus de ser suministrado el extracto hidroalcohlico de Capsicum chinense. Determinar mediante la prueba de TBARS, el nivel de lipoperoxidacin provocado por el Eox y la diabetes mellitus en ratas Wistar, antes y despus de suministrarles el extracto hidroalcohlico de Capsicum chinense. Metodologa: Preparacin del extracto hidroalcholico. Los chiles habaneros se lavarn, desinfectarn, pesarn y secarn en una incubadora durante 24 horas a 60C, despus se proceder a molerlo en un molino para finalmente conseguir un macerado de chile habanero. Se realizar una relacin 1:10 g/mL de polvo d e Capsicum chinese sobre etanol al 96%, mismo que se agitar constantemente

durante 24 horas. Posteriormente el extracto se expondr a presin reducida en el rotavapor a 85C para obtener una mejor destilacin, evitando la evaporacin del extracto. El extr acto resultante con un mnimo de solvente se deber meter durante 48 horas a una campana de extraccin y se permitir su secado a temperatura ambiente hasta perder la fluidez del extracto. Para la comprobacin de alcaloides se realizar un ensayo de coloracin y precipitacin con la reaccin de reactivos de Dragendorf y Mayer respectivamente. Con la muestra seca de Capsicumchinese, se pesar entre 2 g ms 20mL de etanol, se tomar 1mLy se depositar en un tubo para microcentrfuga y se le agregar una gota de HCL, inmediatamente despus se le aadir una gota del reactivo Dragendorf el cual en caso de la presencia de alcaloides se observar un precipitado. Para el indicador Mayer se llevar a cabo el mismo procedimiento y ante la presencia de alcaloides se observar un color blanco opaco. Induccin de la diabetes mellitus en ratas Wistar Se realizar la induccin de la diabetes mediante la administracin de 65mg/kg de STZ por va intraperitoneal, disuelta en amortiguador de citratos pH= 4 al 0.05M (1 ml/Kg de peso vivo).

Administracin del extracto hidroalcohlico de Capsicum chinese. Se utilizarn ratas Wistar macho con un peso de entre 180-240 g. Se mantendrn en condiciones de bioterio (12h luz/12h oscuridad). Las ratas sern alimentadas con una dieta pellet y agua ad libitum. Se administrar el extracto de chile habanero (10mg/kg peso corporal) por va intramuscular, previamente disuelto en aceite de olivo con una dilucin 1:1 para hacer que la fluidez del extracto aumente. Medicin de dao por lipoperoxidacin. Se medirn el dao por lipoperxidacin por medio del malondialdehdo endgeno, el cual en condiciones de bajo pH y alta temperatura, reacciona con el cido tiobarbitrico (TBA) dando lugar a un aducto MDA-TBA cromgeno o pigmento rojo que es detectable por espectrofotometra o por fluorimetra. Para medir este dao se utilizar el mtodo propuesto por Asakawa, et al., (1979), modificado y optimizado por Estepa, et al., (2001). En tubos de ensayo de 10 mL de capacidad, se aaden respectivamente 100 L de suero (muestras problema), 100 L de H2O destilada (muestra blanco), 100 L de disolucin patrn (muestras patrn) o 100 L de disolucin control (muestra control) y a continuacin los siguientes reactivos en el orden que se describe:

1) 0,1 mL de reactivo antioxidante 2) 0,1 mL de reactivo catalizador 3) 1,5 mL de disolucin tampn Esta mezcla de reaccin se mantiene 60 minutos a 5 C. Transcurrido este tiempo, se lleva a ebullicin en un bao de agua a una temperatura entre 95 C y 100 C durante 60 minutos, para desarrollar la mxima coloracin en todas las muestras y patrones. Los tubos se tapan con bolas de cristal como condensadores para evitar prdidas de lquido por evaporacin. Una vez verificada la reaccin, se procede a la extraccin de los aductos con una mezcla de 2,5 mL de una disolucin de n-butanol-piridina (15:1 V/V) y 0,5 mL de agua destilada, enfriando previamente los tubos en un bao de hielo. Tras mezclar y centrifugar a 4000 r.p.m. durante 10 minutos, las capas superiores o sobrenadantes se recogen en un tubo limpio y se procede a la lectura de las absorbancias a 532 nm, frente a un blanco de reactivos. Tanto las muestras de suero, como las disoluciones patrones, control y blanco de reactivos, se procesan de la misma manera. Ensayo Cometa El ensayo cometa o electroforesis alcalina en geles de agarosa, es comnmente usado para medir los niveles de dao inducido por el EOx en el DNA. Esta tcnica consiste en mezclar una muestra de sangre de 10 L con 75 L de agarosa de bajo punto de fusin (al 0.5% en PBS libre de Ca +2 y Mg +2), despus hay que colocar 75 L de esta mezcla en un portaobjetos esmerilado, el cual debe contener previamente una capa de 120 L de agarosa regular (al 75% en PBS libre de Ca +2 y Mg +2) solidificada a 4C, inmediatamente hay que cubrirlo con un cubreobjetos. Dejar solidificar la muestra a 4C, retirar el cubreobjetos y posteriormente adicionar 75 L de agarosa de bajo punto de fusin y dejar solidificar siguiendo el procedimiento anterior. Al retirar nuevamente el cubreobjetos de cada laminilla, hay que sumergirlos en una solucin de lisis fra por lo menos 1 h (1% de laurilsarcosianato de sodio, 2.5 M NaCl, 10mmol/L Na 2 EDTA, 10 mmol/L Tris-HCl pH 10, 1% tritn y 10% DMSO). Posteriormente colocar las laminillas en una cmara de electroforesis que contenga solucin amortiguadora fresca a pH 13 (1 mmol/L Na 2 EDTA, 300 mmol/L NaOH) permitiendo que se desenrolle el ADN por 20 minutos y despus efectuar la electroforesis por 20 minutos ms a 25V y 300 mA. Pasado este tiempo, lavar las laminillas en solucin amortiguadora de neutralizacin 3 veces por 5 min. (0.4 mol/L Tris-HCl, pH 7.5). Eliminar el exceso de neutralizador de las laminillas y despus teir con bromuro de etidio (20 g/mL), cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio de fluorescencia con un filtro de excitacin de 520 nm, utilizar el aumento de 40X. Finalmente, con un ocular graduado determinar la migracin del ADN en 100 clulas sanguneas por laminilla.

Referencias: 1.-Hernndez J.; Puig M.; Garca P.; Marcel E.; Quesada M. (2011) Estrs oxidativo y diabetes mellitus. Revista mexicana de Patologa Clnica. Nm. 1, Vol. 587, pp 4-15. 2.-Rodrguez M.; Osorio E.; Vargas L.; Nez V. (2004). Propuesta de un constructo para evaluar integralmente el estrs oxidativo. Bioquimia. Nm. 3, Vol. 29, pp. 81-90. 3.- Prez A.; Abils J.; Prez J.(2008) Estrs oxidativo y su implicacin en distintas patologas. Nutricin Clnica en Medicina. Nm. 2, Vol. Ll, pp. 45-64. *4.- Castorena M.; Guerrero I.; Guzmn M. (2010). Estudio electroqumico de Vainillina y Capsaicina en solucin fisilogica Hartmann. XXV Congreso de la sociedad mexicana de electroqumica. *5.- Cabrera T.; Serrano D. (2000) Algunos aspectos sobre el estrs oxidativo, el estado antioxidante y la terapia de suplementacin Revista Cubana de Cardiologa 14(1):55-60 6.-Ibarra M.; Gonzlez C.; Gmez B.; Prez A. (2006) Diabetes, estrs oxidativo y antioxidantes. Investigacin en salud. Nm.001, Vol. Vlll, pp. 7-15. 7.- Mora H.; ngela C.; Aragn N.; Diana M.; Ospina G., Luis F. (2009). Caracterizacin del estrs oxidativo en ratas Wistar diabticas por Estreptozotocina. Redalyc. Nm. 3, Vol. 16, pp. 311-319. *8.- Prez R.; Bravo S.; Avalos S.; Molina A. (2009) Estrs oxidativo y las complicaciones asociadas a la diabetes. Ciencia Nicolaita Nm. 51 Laboratorio de Bioqumica, Instituto de Investigaciones Qumico-Biolgicas. UMSNH. Ciencia Nicolaita No. 51 Julio de 2009