PRCTICA 4. CARBOHIDRATOS. FUNDAMENTO TERICO. Experimento 1: Propiedades de los carbohidratos.

Los carbohidratos son los compuestos orgnicos ms abundantes de la bisfera. La mayora pueden ser representados con la frmula general Cx(H20)y por lo que son literalmente, hidratados de carbono. Gran parte de sus funciones biolgicas dependen de esta estructura qumica tan particular y verstil. Ellos son componentes fundamentales de muchos alimentos y su degradacin durante el proceso de digestin genera la energa necesaria para las funciones vitales del organismo. Cuando se encuentran combinados con otras biomolculas, dan origen a molculas ms complejas cuyas funciones pueden ser estructurales o de soporte celular y tisular, o de combinacin entre de reconocimiento o de sealizacin. Qumicamente se definen como polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas cclicas o sustancias que luego de hidrolizarse dan origen a los mismos. Un carbohidrato que no puede ser hidrolizado en uno ms simple es llamado monosacrido.

Los monosacridos ms comunes son la glucosa, la fructuosa, la galactosa y la manosa. Un carbohidrato que puede ser hidrolizado en dos molculas de monosacridos es llamado disacrido. Los ms importantes son la lactosa (presente en la leche), la sacarosa (presente en el azcar comn) y la maltosa. Por su parte, aquellos carbohidratos que pueden ser hidrolizados en varias molculas de monosacridos son llamados polisacridos. Los ms comunes son el almidn, glucgeno y la celulosa, ste ltimo componente estructural de las plantas. De la discusin anterior puede resultar claro que la mayora de los carbohidratos son molculas relativamente polares, miscibles, o solubles, en agua. Desde el punto de vista qumico, un azcar es aquel compuesto cuya molcula est formada por tomos de carbono, cada uno de los cuales est unido a un grupo hidroxilo (-OH), excepto uno de ellos, que lleva un grupo carbonilo (=0). En solucin, la molcula de un azcar est en equilibrio entre una forma de "cadena recta" y una en anillo; la forma que predomina

es la de anillo, por lo que habitualmente los azcares se representan de esta forma.

Los carbonos anomricos internos de dichas molculas participan en enlaces acetal y no son libres de actuar como agentes reductores. Sin embargo, algunas de las propiedades de los azcares nicamente pueden entenderse teniendo en cuenta que tambin existe la forma de cadena abierta. Los monosacridos pueden tener un nmero variado de carbonos, lo cual se refleja en la terminologa: Una molcula de hexosa tiene seis carbonos, una de pentosa, cinco, etc.

Los carbohidratos complejos, disacridos, oligosacridos y polisacridos, estn formados a partir de monosacridos mediante la unin covalente de molculas de azcar. Los enlaces que se producen entre las unidades individuales de azcar son relativamente fuertes a concentraciones normales de iones hidrgeno: Por ejemplo, la sacarosa no se rompe al hervirla, aunque se mantiene rota en soluciones cidas, como las bebidas de cola; sin embargo, existen enzimas especficas en el intestino que hidrolizan estos enlaces liberando los monosacridos correspondientes. Los disacridos, como se mencion anteriormente, son carbohidratos que al estar unidos a travs de enlaces covalentes (glucosdicos), pueden llegar a ser hidrolizados en sus dos molculas de monosacridos constitutivas, es decir la unidad mnima de cada disacrido o polisacrido es un monosacrido. Los ms importantes son la lactosa (presente en la leche), la sacarosa (presente en el azcar comn) y la maltosa. Los polisacridos se diferencian entre s en varios aspectos: la longitud de su cadena, y la naturaleza (- o -) y la posicin (por ejemplo, 1-4, 1-6) de los enlaces entre las unidades individuales de los azcares que los forman. La celulosa est formada mayoritariamente por unidades glucosilo unidas entre s por enlaces -1,4; estos enlaces dan al compuesto una estructura fuertemente empaquetada que no es atacada por los enzimas de los mamferos. Por ello, en los humanos la celulosa pasa casi intacta a travs del intestino delgado, donde otros carbohidratos son digeridos y absorbidos. La celulosa es degradada por algunas enzimas bacterianas. Los rumiantes tienen tractos digestivos complicados en los que residen grandes cantidades de bacterias, lo cual permite al husped obtener energa a partir de celulosa, el principal constituyente de la hierba, la dieta de los rumiantes. El almidn y las pequeas cantidades de glucgeno de la dieta son fcilmente digeridos.

El almidn, la reserva energtica de las clulas vegetales, es una fuente significativa de carbohidratos en la alimentacin humana. En el almidn se encuentran juntos dos polisacridos: la amilosa y la amilopectina. La amilosa est formada por cadenas largas sin ramificar de residuos de Dglucosa que estn unidos por enlaces glucosdicos -1,4. Varios

polisacridos, incluyendo los dos tipos de almidn, poseen un extremo reductor en el que el anillo puede abrirse para formar un grupo aldehdo libre con propiedades reductoras. Debido a que las molculas lineales de amilosa forman largas hlices apretadas, su forma compacta es ideal para su funcin de almacenamiento.

La otra forma de almidn, la amilopectina, es un polmero ramificado que contiene enlaces glucosdicos -1,4 y -1,6. Los puntos de ramificacin 1,6 pueden producirse cada 20 - 25 residuos de glucosa e impiden la formacin de una hlice.

En la figura al final del prrafo se ilustra la estructura del glucgeno. Es un polisacrido ramificado; la mayora de los enlaces entre las unidades de azcar son del tipo -1,4, pero cada 9 - 10 residuos hay un enlace 1, 6, que genera una ramificacin.

Como ya se indic, los carbohidratos comparten la propiedad de tener una polaridad relativamente elevada. La celulosa estrictamente no es soluble en agua debido al fuerte empaquetamiento entre sus cadenas, pero incluso ella puede mezclarse con agua. Los polisacridos tienden a formar mezclas "pastosas" con el agua, mientras que los pequeos oligo-, di- y monosacridos son completamente solubles en agua. La determinacin de glucosa es de importancia mdica ya que niveles sanguneos alterados pueden ser signo de una enfermedad metablica comn, conocida como diabetes mellitus.

IMPRIMIR A PARTIR DE ESTA PGINA Experimento 1A: Prueba de Benedict.

Algunos azcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta caracterstica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azcares con un grupo carbonilo libre son llamados azcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en unin glucosdica se conocen como azcares no reductores. Existen varias reacciones qumicas que permiten determinar si se est en presencia de un azcar reductos o no. La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reaccin o no de un azcar con el ion Cu2+. El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de sodio. El Na 2CO3 confiere a la solucin un pH alcalino necesario para que la reaccin pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en solucin ya que tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una solucin de azcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullicin, el azcar en solucin alcalina a elevadas temperaturas se convertir en D-gluconato y su ene-diol, rompindose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos, reaccionarn con el Cu++ . Se obtiene entonces un azcar oxidado y dos iones Cu+ . Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH presentes en la solucin para formar el hidrxido de cobre: Cu+ + OHCu(OH) (precipitado amarillo)

El hidrxido pierde agua. 2Cu(OH) Cu2O (precipitado rojo ladrillo) + H2O

La aparicin de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azcar reductor. Experimento 1B: Prueba cualitativa de glucosa oxidasa.

Este mtodo es utilizado hoy en da para la determinacin y cuantificacin de glucosa en sangre y orina. V y vino a reemplazar a otros como la prueba Benedict, debido a su mayor especificidad y sensibilidad. La prueba se basa en el uso de una enzima llamada glucosa oxidasa que reconoce especficamente a una de las formas anomricas de la D-glucosa, la forma beta glucupiranosa. Esta enzima, en presencia de glucosa, oxgeno y un amortiguados de pH, genera gluconolactona y perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno es a su vez sustrato de otra enzima, la peroxidasa, la cual en presencia de fenol y una amina aromtica (en nuestro caso, la

amino-4-antipirina) genera un compuesto de color rosado y agua. Por lo tanto, cuando el reactivo vira de incoloro a rosado, se demuestra la presencia de glucosa en la muestra.

Experimento 1C:

Prueba de yodo para Almidn.

La prueba del almidn es una prueba muy sencilla pero que todava se utiliza para determinar la presencia de almidn en algunos alimentos. La prueba se basa en una reaccin fsica y no qumica, en la cual el almidn reacciona con el yodo para formar un complejo de color azul intenso. Bajo las mismas condiciones, el glucgeno de una coloracin caf.

Experimento 1D:

Hidrlisis del almidn.

Esta prctica tiene como objetivo demostrar que efectivamente los polisacridos como el almidn estn compuestos de monosacridos unidos por enlaces glucosdicos. Como se mencion anteriormente, el almidn est constituido de un solo monosacrido, la glucosa. Las propiedades del almidn son diferentes a las de la glucosa como se evidenciar mediante la hidrlisis del almidn para generar glucosa. Todos los polisacridos son hidrolizados en sus constituyentes monosacridos, por la accin de cidos diluidos. Esta es una reaccin gradual que puede observarse durante el tiempo de la sesin de laboratorio. Es por tanto recomendable que usted inicie el proceso de hidrlisis al comenzar la sesin de laboratorio y luego proceda con el resto de las pruebas. La hidrlisis del almidn se puede evidenciar con dos pruebas: I Desaparicin del color azul caracterstico de la prueba del yodo.

II Aparicin de glucosa, un azcar reductor. La aparicin de glucosa se evidenciar mediante la prueba de Benedict.

Experimento 1E:

Hidrlisis de la sacarosa.

La sacarosa es un disacrido que no posee carbonos anomricos libres por lo que carece de poder reductor y la reaccin con el reactivo de Benedict es negativa, tal y como ha quedado demostrado en el experimento 1A. Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza, es decir, incorpora una molcula de agua y se descompone en los monosacridos que la forman, glucosa y fructosa, que s son reductores. La prueba de que se ha verificado la hidrlisis se realiza con el Reactivo de Benedict y, si el resultado es positivo, aparecer un precipitado que puede ser de color verde, o amarillo, o naranja o rojo ladrillo. Si el resultado es negativo, la hidrlisis no se ha realizado correctamente y si en el resultado final aparece una coloracin verde en el tubo de ensayo se debe a una hidrlisis parcial de la sacarosa.

TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO. CONSULTAS PREVIAS. 1 Grafique la estructura qumica de los carbohidratos que presentan propiedades reductoras e identifique sobre dicha grfica el carbono

que sufre la reaccin de xido reduccin y explique el por qu ste y no otro carbono es susceptible a dicha reaccin. 2 3 La forma cclica de la glucosa sufre la reaccin de xido reduccin con el reactivo de Benedict? Justifique la respuesta Por qu la sacarosa no reacciona con el reactivo de Benedict, si sus monosacridos constituyentes, cuando se encuentran libres, s reaccionan con dicho reactivo? Qu entiendes por hidrlisis de un carbohidrato? Qu parte del almidn reaccionar con el yodo, por qu? Cul es la diferencia estructural entre la celulosa y el almidn?

4 5 6

7 El almidn se hidroliza en presencia de saliva, mientras que la celulosa no por qu? 8 Realice una tabla en donde enumere los carbohidratos con los que usted va a trabajar en la prctica y anexe en ella los resultados que usted esperara obtener tras el desarrollo experimental, deje un espacio en la tabla para colocar los resultados que usted obtenga de los experimentos y consgnelos ah una vez termine la prctica. Entregue LA SOLUCIN A ESTA CONCULTA PREVIA ANTES INICIAR LA PRCTICA. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Objetivos. Al finalizar la prctica se espera que el estudiante demuestre que: 1 Reconoce los fundamentos qumicos y/o fsicos para la identificacin de carbohidratos en muestras biolgicas. 2 Utiliza el fundamento qumico para la determinacin cualitativa y cuantitativa de los diferentes carbohidratos presentes en una muestre biolgica. 3 Aplica principios biotecnolgicos en la determinacin cuantitativa de carbohidratos en fluidos corporales. 4 Identifica las diferencias estructurales de los carbohidratos y predice reactividades qumicas especficas, inherentes a las diferencias estructurales que se presentan en dichos carbohidratos.

Materiales y reactivos.
Cantid ad 1 Equipos y materiales Gradilla Cantid ad Muestras a analizar y reactivos Reactivo de Benedict: Consta de tres soluciones: 100 g de Na2CO3 anhidro disueltos en 200 mL de H2O dd 173 g citrato de sodio disueltos en 200 mL de H2O dd 17.3 g de CuSO4*5H2O disueltos en 300 mL de H2O dd Se mezclan las tres soluciones en fro. y Aforar a 1 L con H2O dd Soluciones de carbohidratos 0.1 mol/l. Xilosa Glucosa Galactosa Lactosa Fructosa Sacarosa HCl conc NaOH 0,4 M Solucin de yodo en yoduro de potasio Solucin de almidn al 1% Solucin de glucosa oxidasa/peroxidasa

15 15 1 3 3 2 1

tubos de ensayo medianos tubos de ensayo grandes bao de Mara Pipetas 5 mL Pipetas 10 mL Pinzas para tubo de ensayo Placa de aglutinacin

Mtodo 1: Prueba de Benedict. Procedimiento. Seleccione la pipeta ms conveniente y deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict en un tubo de ensayo mediano (los tubos de ensayo grandes se usan en la prueba de hidrlisis del almidn). Repita este paso en 6 tubos ms. Luego, a cada tubo, aada 6 gotas de una y solo una de las siguientes soluciones de carbohidratos: glucosa, galactosa, lactosa, xilosa, Fructosa, sacarosa al 0.1 M y almidn al 1%. Coloque los tubos en un bao de agua hirviendo por 5 minutos. Tenga cuidado de no quemarse. Observe cualquier cambio de color durante el calentamiento. Saque el tubo y pngalo en una gradilla y despus de un corto tiempo observe si se ha formado un precipitado, el cual puede ser rojo, anaranjado o verdoso. Mtodo 2: Prueba de Glucosa oxidasa.

Procedimiento. Coloque 3 gotas de solucin de glucosa oxidasa/peroxidasa en siete depresiones de la placa de ensayos. Aada una gota de glucosa a una depresin, una gota de fructuosa a otra, etc. Observe las depresiones inmediatamente y anote los resultados, vuelve a observar las depresiones y revisa si existe algn cambio. Mtodo 3: Prueba de yodo para el almidn. Procedimiento. En tres tubos medianos y utilizando la pipeta que ms se ajuste, distribuya los reactivos indicados segn el siguiente cuadro:
Reactivo Tubo Nmero 1 2 3 Agua (ml) 5 5 5 Almidn 1% (gotas) 5 1 0 Solucin de yodo (gotas) 1 1 1

Agite muy bien los tubos y note la diferencia de color que se atribuye a la formacin de un complejo entre el almidn y el yodo. Anote el resultado. Posteriormente coloque los tres tubos en un bao de agua caliente (70 oC) con cuidado por 10 minutos y observe cualquier cambio de color. Anote el resultado. Enfre los tubos y observe nuevamente. Anote el resultado. Mtodo 4: Hidrlisis del almidn. Procedimiento. Coloque 10 mL de una solucin de almidn al 1% en un tubo de ensayo grande. Pida a su instructor que le aada 1 mL de HCl concentrado al tubo. Agite bien luego coloque el tubo en un bao de agua hirviendo con cuidado de no quemarse, Mientras el almidn se est hidrolizando (tarda de 1:30 h a 2 h aproximadamente), efecte la prueba de coloracin del yodo. Para ello, aada en otro tubo 5 mL de agua, una gota de solucin de yodo y 0.5 mL de la solucin de almidn que tiene hidrolizando en el bao Mara a ebullicin. Anote el resultado de la prueba del yodo. Despus de que la hidrlisis del almidn se haya llevado a cabo por 30 minutos, saque 0.5 mL del almidn que se est hidrolizando en el bao Mara y repita la prueba del yodo, es decir, disuelva en 5 mL agua los 0,5 mL de

solucin de almidn que acaba de tomar de la mezcla de reaccin y aada una gota de solucin de yodo. Compare su coloracin con la coloracin obtenida en el paso anterior. Contine la hidrlisis hasta obtener una prueba de yodo negativa, tomando alcuotas con intervalos de 30 minutos. Posteriormente y para confirmar la presencia de glucosa, efecte la prueba de Benedict a una alcuota de la mezcla de reaccin, transcurridas aproximadamente 1 h 30 mn., de iniciada la reaccin de hidrlisis del almidn. Para ello, aada en un tubo 0.5 ml del almidn hidrolizado, 1 ml de NaOH 0.4 mol/l (para neutralizar el cido) y 2.5 ml de reactivo de Benedict. Incubar por 8 minutos en agua hirviendo. Anote y analice los resultados. IMPORTANTE: Utilice sus resultados del punto 1 (Prueba de Benedict) y del punto 2 (Prueba de yodo para almidn) para interpretar sus resultados.

Mtodo 5: Hidrlisis de la sacarosa. Procedimiento. 1 2 3 4 5 6 Tomar 3mL de solucin de sacarosa y aadir 10 gotas de HCl. Introducir en el bao de Mara a ebullicin. Dejar enfriar. Neutralizar aadiendo 3 mL de solucin de NaOH. Realizar la prueba de Benedict como se indica en el experimento 1A. Observar y anotar los resultados.

RESULTADOS Y ANLISIS PRELIMINAR DE RESULTADOS. Experimento 1: Propiedades de los carbohidratos. Mtodo 1: Prueba de Benedict. 1 Elabore un cuadro con los carbohidratos que utiliz en esta prueba, si se form un precipitado y de qu color es el mismo. 2 Concuerda sus resultados con lo esperado tericamente sobre carbohidratos reductores? Explique. 3 4 Qu otro reactivo se puede usar para anlisis de azcares reductores? Por qu es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?

Mtodo 2: Prueba de Glucosa oxidasa.

1 Qu coloracin es una prueba positiva para la glucosa oxidasa, qu compuesto qumico se debe producir y qu agente lo reconoce para que se genere la coloracin? 2 Por qu la prueba es especfica para la determinacin de glucosa?

3 Observ algn cambio luego de incubar por ms tiempo las diferentes reacciones? Si es as, a qu cree usted que se debe este cambio? Qu implicaciones podra tener este resultado? Mtodo 3: Prueba de yodo para el almidn. 1 2 3 4 Describa el resultado obtenido en los diferentes tubos luego de incubar a temperatura ambiente. Describa el resultado obtenido en los deferentes tubos luego de incubar a alta temperatura. Qu sucede cuando los tubos se enfran de nuevo? Tomando en cuenta la estructura helicoidal del almidn, explique qu tipo de reaccin se lleva a cabo cuando se mezcla el yodo con el almidn. Cmo explica los fenmenos descritos en las respuestas a las preguntas 1 Y 2? Cmo cree usted que dara el resultado de esta prueba si se utiliza celulosa?

5 6

Mtodo 4: Hidrlisis del almidn. 1 Haga un cuadro con los resultados de la prueba del yodo a diferentes tiempos y anote el tiempo que tard la prueba de Benedict en dar positiva para la presencia de glucosa. 2 Segn los resultados del cuadro 1, cunto tiempo tard la solucin de almidn en hidrolizarse? 3 Qu tipo de enlaces es capaz de romper el HCl? Por qu?

Mtodo 5: Hidrlisis de la sacarosa. 1 Qu puede concluir al realizar esta prueba y compararla con el resultado obtenido en la reaccin de Benedict para ste mismo carbohidrato? Bibliografa. -Angulo Ugalde, Y. Bioqumica Manual de laboratorio. Universidad de Costa Rica. 1999

-ELITECH Diagnostics. Instrucciones de uso del reactivo Glucosa PAP, versin 12/2002 -Nelson D.L y Cox M.M: Lehninger Principles of Biochemistry. W, H. Freeman and Company, NY. Cuarta edicin, 2005.