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MICROBIO LOGA APLICADA

PRCTICA No. 5 EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ENZIMAS DE HONGOS OBJETIVOS. Realizar la extraccin y purificacin parcial de la invertasa de levaduras. INTRODUCCION. Los caldos de fermentacin son mezclas complejas, compuestas de clulas, productos solubles extracelulares, productos intracelulares y medio de cultivo sin convertir. Particularmente un bioproceso incluye los procesos de produccin de un metabolito especfico y su posterior recuperacin. La seleccin del proceso de recuperacin del producto se basa en los siguientes criterios: La localizacin del producto (intracelular o extracelular). La concentracin del producto en el caldo de fermentacin. Las propiedades fsicas y qumicas del producto (tamao, carga, solubilidad, etc.). El uso tentativo de] producto. Las impurezas del caldo de fermentacin. El precio del producto en el mercado. La secuencia de operaciones a travs de las cuales se somete el caldo de fermentacin para obtener el producto deseado con una alta pureza son generalmente las siguientes: Remocin de partculas insolubles. Las operaciones ms comnmente usadas en esta etapa son filtracin, centrifugacin, sedimentacin y decantacin. Aislamiento primario. La extraccin con disolventes, la adsorcin, precipitacin y ultrafiltracin son las operaciones m s usadas. Durante este aislamiento primario, la concentracin del producto deseado aumenta considerablemente. Purificacin. Con esta operacin se remueven las impurezas del producto concentrado, se utilizan entre otras operaciones la precipitacin fraccionada, diferentes tipos de cromatografa o la adsorcin. Obtencin del producto final. En esta ltima etapa se obtiene el producto con el nivel de pureza requerido. Los procesos que se incluyen aqu, son un secado al vaco, cristalizacin y liofilizacin. En la presente prctica se realizar la extraccin y parcial purificacin de la invertasa de levaduras La enzima invertasa y en especial la invertasa de levadura ha tenido un papel primordial en el desarrollo de la enzimologa. Gran parte de los conocimientos en cintica enzimtica se deben a esta enzima. La invertasa es una enzima con especificidad de fructofuranosidasa que participa en la reaccin de hidrlisis de los oligosacridos con enlaces del tipo 21,fructofuranosos. Se obtiene comercialmente a partir de la levadura de Saccharomyces cerevisiae que es un subproducto de la industria cervecero. Sin embargo despus de un estudio cintico realizado, se encontr que en la levadura Candida utilis Y-900 bajo ciertas condiciones se presenta una mayor actividad especfica (U/g de clulas). Actualmente en Mxico no se produce invertasa y la que se utiliza en la industria es importada de Europa y los Estados Unidos.

A pesar de que es una enzima extracelular, la mayor parte de ella est retenida en la pared celular, por lo que es necesario la desorganizacin de esta estructura para su liberacin. Se ha informado que compuestos con grupos sulfhidrilos son capaces de inducir la liberacin de enzimas que se encuentran de alguna forma unidas a la pared celular de levaduras. La adicin de cistena a altas densidades celulares de la levadura reduce el tiempo de liberacin de la enzima. Una vez que se tiene el extracto enzimtico, se seleccionan las tcnicas para la purificacin de la invertasa. En este caso el mejor mtodo fue la precipitacin con etanol, estableciendo las condiciones para precipitar selectivamente a la invertasa, dejando en solucin al resto. El etanol ha sido empleado por varias dcadas como un agente precipitante de protenas. La obtencin de protenas puras de una mezcla compleja se facilita por la influencia de factores como el pH, la fuerza inica, la temperatura y la concentracin de protena sobre la accin precipitante del etanol. Adems de interaccionar con otras variables, el etanol por s mismo causa precipitacin de protenas ya que disminuye significativamente la constante dielctrica de las soluciones acuosas. Finalmente se utiliza la centrifugacin para recuperar el precipitado. METODOLOGA. Se utilizar la biomasa generada en la prctica de Produccin de protenas unicelular mediante la tcnica de cultivo extendido como materia prima para la obtencin de la invertasa, o bien, se emplear S. cerevisiae de origen comercial. ACTIVIDADES POR SESIN. SESIN 1. EXTRACCIN DE LA ENZIMA UTILIZANDO CISTEINA. Se utilizar una concentracin celular de aproximadamente 200 g/, resuspendiendo el paquete celular en una solucin reguladora de fosfatos 0.1 M pH 7.2. Se adicionar cistena hasta una concentracin de 0.25% (p/v) y se incubar a temperatura ambiente por 24 horas. Despus de este tiempo la suspensin se colocar en el refrigerador hasta la siguiente sesin. Una hora despus de haberse iniciado la autolisis, se tomar una muestra a la que se le determinar la actividad enzimtica y la concentracin de protena. Se comparar con una muestra tomada al inicio de la incubacin para asegurarse de que est llevndose a cabo el proceso de autolisis. SESIN 2. RECUPERACIN PARCIAL Y PURIFICACIN DE LA ENZIMA. Recuperacin de la enzima. Separar los residuos celulares por centrifugacin de la suspensin celular a 3500 rpm por 10 minutos Tomar una muestra del sobrenadante para su posterior anlisis de actividad y concentracin de protena. Purificacin parcial de la enzima. Al sobrenadante obtenido se le adicionan 4C volmenes de etanol muy lentamente y con agitacin en un bao de hielo. Se deja reposar por una hora a 40C para permitir la precipitacin de la enzima. Despus de este tiempo se recuperar el precipitado por centrifugacin a 3500 rpm por 10 minutos. El precipitado se resuspende en un volumen exacto de regulador de TRIS-HCI 50 mM y pH de 7.2. A este precipitado se le determinar la actividad de invertasa empleando el mtodo de glucosa-oxidasa-peroxidasa y la concentracin de protena por el mtodo de Lowry. METDOS ANALTICOS.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE INVERTASA POR EL MTODO DE LA GLUCOSA-OXIDASA-PEROXIDASA. Reactivos: A. Solucin enzimtica: a un litro de regulador de fosfatos 0.1 M pH 7.0 se le adicionan 5 mg de peroxidasa (SIGMA) y 1 ml de la enzima glucosa oxidasa (SIGMA). B. Solucin de o-dianisidina: 300 mg de o-dianisidina en 50 mi de agua destilada. C. Mezcla enzimtica: 20 mi de reactivo A m s 1 mi de reactivo B (preparada al momento de usarse). D. Solucin de sacarosa 0.5 M. E. Solucin de HCI 6 N. F. Regulador de acetatos 0.1 M PH 4.5. Procedimiento: En un tubo de ensayo se colocan 100 microlitros del reactivo F y 50 microlitros del reactivo D. La mezcla se incuba 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se adicionan 2 mi del reactivo C y se deja a temperatura ambiente durante 8 minutos. Transcurrido este tiempo se detiene la reaccin adicionando 2 mi del reactivo E. El color desarrollado se mide a 540 nm en un espectrofotmetro. Para ajustar el espectrofotmetro se prepara un testigo de reactivos siguiendo el mismo procedimiento usando agua destilada en lugar de muestra. Tambin se utiliza un control de glucosa 2 mM. Una unidad de invertasa (U) se define como un micromol de glucosa liberada por un minuto en las condiciones de ensayo. DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE LOWRY. Reactivos: A. Solucin de tartrato de sodio y potasio al 1% en sulfato cprico al 0.5%. B. Solucin de carbonato de sodio al 2% en hidrxido de sodio 0.1 N. C. Se mezclan 50 mi de B con 1 mi de A (preparado al momento de usarse) D. Reactivo Folin-Ciocalteu diluido 1:2 con agua destilada. Procedimiento: En un tubo de ensayo se adicionan 500 microlitros de muestra diluida y 5 ml del reactivo C, se dejan incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, pasado este tiempo se agregan 0.5 ni] del reactivo D, la mezcla se agita y se esperan 30 minutos para que se lleve a cabo la reaccin, transcurrido este tiempo, el color desarrollado se mide en un espectrofotmetro a 500 nm. De la misma manera se prepara un blanco de reactivos, sustituyendo la muestra por agua destilada, y un control utilizando una solucin de albmina de bovino de 0.5 mg/ml tratado en forma similar. RESULTADOS. 1. Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimtica en el sobrenadante y el paquete celular antes y despus de la extraccin. 2. Determinar el % de liberacin de la enzima durante la extraccin. 3. Determinar la eficiencia de recuperacin de la enzima durante la purificacin. 4. Determinar el grado de purificacin relativo de la invertasa. 5. Discusin y conclusiones.

REFERENCIAS. Ahuatzi C. D. Extraccin y purificacin de la invertasa de Cndida utilis Y-900. Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. IPN. Mxico. Castro B.F. & Romero, F.F. 1984. Cintica de acumulacin de invertasa de levaduras cultivadas en distintos sistemas fermentativos. Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. IPN. Mxico. De la Vega, G. M., & Paneque, A. 1990. Purification and properties of an extracellular invertase from Acetobacter chroococuni. Enzynic & Microbial Technol.13:267-271. Cascn, S & Lampen, 0. J. 1968. Purification of the internal invertase of yeast. J. Biol Chem. 243:1567-1572. Lam, K.S., & Grootwassink. W. D. 1985. Efficient, non-killing extraction of -fructofuranoside (an exo-inulase) form Kluyveroniyces fragilis at high density. Enzyme Microb. Technol. 7:239-242. Lowry, 0. H. Rosebrough, N. J. Farr, A.L. & Randall R. J. 1951. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

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