GUIA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (ANALISIS Y DETERMINACION de clostridium y virion)

KEVIN ANDREETY MELO ROMERO ERIKA NOSSA LEN SANDRA LILIANA RAMREZ SALAS DORA CONSUELO SALAMANCA CAN ADRIANA MARA SOTELO CHVES

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS AREA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS BOGOTA D.C MAYO 2013

GUIA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (ANALISIS Y DETERMINACION de clostridium y virion)

KEVIN ANDREETY MELO ROMERO ERIKA NOSSA LEN SANDRA LILIANA RAMREZ SALAS DORA CONSUELO SALAMANCA CAN ADRIANA MARA SOTELO CHVES

ALEXANDRA CUCAITA Instructora Microbiologa

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENA CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS AREA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS BOGOTA D.C MAYO 2013

INTRODUCCION

Todos los bacilos anaerobios Gram positivos esporulados con importancia mdica se clasifican en el gnero Clostridium. No obstante, la identificacin de muchos de esos grmenes plantea problemas. El gnero contiene ms de 100 especies con diversas propiedades bioqumicas y relacin gentica limitada. Aunque la mayora de esas especies son anaerobias estrictas, hay algunas aero tolerantes que pueden crecer en medios de agar expuestos al aire. Algunos Clostridium puede aparecer Gram negativos y quiz no se observen esporas en algunas especies. As pues, la clasificacin de un aislamiento dentro del gnero Clostridium se debe basar en una combinacin de pruebas diagnsticas entre las que se incluyen demostracin de esporas, crecimiento ptimo en anaerobiosis con un patrn complejo de actividad bioqumica y anlisis de los productos metablicos mediante cromatografa gaseosa. Por fortuna, la mayora de los aislamientos corresponden a un nmero limitado de especies. Algunas de las especies del gnero Clostridium tienen la propiedad de reducir el ion sulfito a sulfuro que en presencia de citrato frrico o cualquier otra sal (metales pesados) forman colonias de color negro. El recuento de esporas es considerado como el indicador ms importante de las bacterias anaerobias capaces de formar esporas. Estas estructuras de supervivencia suelen presentarse en alimentos enlatados que no han sido producidos bajo condiciones de calidad en cada proceso y malas condiciones de almacenamiento. El gnero Vibrio comprende varias especies de importancia mdica, relacionadas muchas de ellas con enfermedad gastrointestinal y en particular con enfermedades trasmitidas por alimentos de origen marino. De todas ellas merece especial atencin Vibrio cholerae responsable del Clera epidmico, una enfermedad infecciosa con un cuadro clnico caracterizado por vmitos y diarrea intensa, que puede llevar a la deshidratacin grave. Dicha bacteria ingresa al organismo con el agua o los alimentoscontaminados. Vibrio chorelae pertenece a la familia Vibrionaceae, gnero Vibrio. Es un bacilo pequeo, gram negativo, no esporulado, aerobio y anaerobio facultativo, curvo, mvil mediante un flagelo polar nico, no encapsulado, oxidasa positivo. El Vibrio chorelae O1 es el agente causal del clera, enfermedad diarreica producida por una toxina segregada por el microorganismo en el intestino, suele presentarse en comunidades donde las practicas de higiene son muy deficientes. Esta especie se divide en dos biotipos el Clasico y el Tor, y puede pertenecer a los serotipos Ogawa, Inaba e Hikojima.

OBJETIVOS Identificarn los grupos de microorganismos que pueden causar los diferentes tipos de alteraciones en alimentos. Detectar en el laboratorio a los microorganismos de importancia en alimentos e interpretarn correctamente los resultados de los anlisis. ANALISIS Y DETERMINACION DE CLOSTRIDIUM MATERIALES Tubos con 9mL de agua peptonada. Erlenmeyer con 90mL de agua peptonada. Pipetas Micropipeta Puntas azules Tubos de 10mL estriles Gradillas Jarra de anaerobiosis Bao de Mara Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS) Incubadora Cuchillos, tenedores y cuchara Balanza

METODOLOGIA Preparacin de la muestra Realizar diluciones seriadas hasta 10-3 bajo cabina de flujo laminar.

Procedimiento 1. 2. 3. 4. Pipetear 1mL de cada una de las diluciones en tubos estriles. Colocar los tubos en bao de Mara a 80C durante 10min. Dejar enfriar rpidamente en agua corriente. Verter 9 mL del Agar SPS en los tubos mediante siembra en profundidad.

5. Agitar y dejar solidificar. 6. Colocar las cajs en camara de anaerobiosis e incubar a 35C+/-2 durante 72 horas.

1mL de dilucin

la

Bao de Mara a 80C durante 10min

Adicionar 9mL del Agar SPS agitar y dejar solidificar e Incubar 35C+/-2 durante 72 horas

Realizar el recuento entre 550 colonias negras

1. LECTURA DE RESULTADOS Se recomienda observar los tubos a las 24, 48 y 72 horas debido a que los microorganismos pueden producir a las 24 horas H 2S tornndo el medio de cultivo de color negro, impidiendo su lectura. Se deben seleccionar las cajas que presenten recuentos entre 15-150 colonias.

EXPRESION DE LOS RESULTADOS

Se calcula el nmero N de Clostridium sulfito reductores presentes en 1 ml 1 g del producto, usando la siguiente ecuacin:

Donde: a es la suma de las colonias de Clostridium sulfito reductores contadas en todas las cajas de dos diluciones sucesivas, una de las cuales contiene al menos 15 colonias. n1 es el nmero de cajas guardadas en la primera dilucin. n2 es el nmero de cajas retenidas en la segunda dilucin. d es el factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin retenida.

Los resultados se redondean a dos cifras significativas. Se toma como resultado el nmero de Clostridium sulfito reductores por mililitro o por gramo de producto, expresado como un nmero entre 1,0 y 9,9, multiplicado por la potencia de 10 apropiada.

ANALISIS Y DETERMINACION DE VIBRIO

METODOLOGIA Preparacin de la muestra Para pescado entero se debe remover la carne alrededor de las tripas, agallas y piel, para conformar la unidad de la muestra necesaria para el anlisis. Para los crustceos partir en trocitos pequeos extrayendo nicamente la carne.

Procedimiento 1. Pesar 25g del total de la muestra. 2. Adicionarlo en un erlenmeyer que contiene 225mL de agua peptonada alcalina (pH 8.5).

3. Agitar e incubar a 35C+/-2, durante 6-8h. 4. Pasado el tiempo de incubacin (sin agitar el erlenmeyer) tomar una azada y sembrar por agotamiento en caja de Petri que contiene agar TCBS por duplicado. 5. Incubar las cajas a 35C+/-2 durante 18-24h.

Siembre por estras 225mL H2O por Peptonada alcalina

TCB S

Incubar 6-8h 35C+/-2

TCB S

Muestra 25g

Incubar por 6-8h 35C+/-2 En caso de que observe ls colnias tpicas de V. chorelae, se deben tomar un mnimo de tres colonias y sembrarlas en Agar nutritivo o BHI por estras e incubarlas a 35C+/-2 por 18-24h. 7. Seguidamente, realizar la prueba de oxidasa. 1. LECTURA DE RESULTADOS Despus de transcurrido el tiempo de incubacin, obsrvese las colonias tpicas de V. chorelae en agar TCBS: colonias grandes (2-3mm) lisas, amarillas y ligeramente aplanadas, con el centro opaco y la periferia traslucida y reaccin positiva a la de oxidasa.

EXPRESIN DE RESULTADOS De acuerdo con los resultados de la interpretacin, se indica la presencia o ausencia de V. chorelae en una porcin de x g de producto.

BIBILOGRAFIA AOAC. 2005. Mtodo 988.20 Deteccin de Vibrio chorelae. ICONTEC. 2009. Norma Tcnica Colombiana NTC 4092. Microbiologa de alimentos y productos para alimentacin animal. Requisitos generales y directrices para anlisis microbiolgicos. INVIMA. 1998. Manual de tcnicas de anlisis para control de calidad microbiolgico de alimentos para consumo humano.. ICONTEC. 2000. Norma Tcnica Colombiana NTC 4834. Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Mtodo horizontal para el recuento de Clostridium sulfito reductores e identificacin de Clostridium perfringens. tcnica de recuento de colonias. ICONTEC. 2009. Norma Tcnica Colombiana NTC 4092. Microbiologa de alimentos y productos para alimentacin animal. Requisitos generales y directrices para anlisis microbiolgicos. INVIMA. 1998. Manual de tcnicas de anlisis para control de calidad microbiolgico de alimentos para consumo humano.