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PRUEBAS DE DIAGNOSTICO SEROLOGICAS Definicin de Serologa: Es un examen del lquido seroso de la sangre (suero, el lquido transparente que se separa

cuando la sangre se coagula) que se utiliza para detectar la presencia de anticuerpos contra un microorganismo. En otras palabras, la serologa se refiere al estudio del contenido de anticuerpos en el suero. Ciertos microorganismos estimulan al cuerpo para producir estos anticuerpos durante una infeccin activa Las reacciones antgeno-anticuerpo se estudian ms fcilmente "in vitro" utilizando preparaciones de antgenos y antisueros. El estudio de las reacciones antgenoanticuerpo "in vitro" se denomina serologa y es de especial importancia en la microbiologa diagnostica.En las reacciones antgeno-anticuerpo se distinguen 2 fases: la primera consiste en la unin del antgeno con el anticuerpo y la segunda en las manifestaciones que resultan de dicha unin. La primera fase se realiza por la combinacin de reas pequeas tanto del antgeno como del anticuerpo, denominadas respectivamente determinante antignico y sitio activo,que al unirse forman un complejo antgeno-anticuerpo. La reaccin es reversible, siguiendo, por consiguiente, la ley de accin de masas y existen factores externos que pueden modificar dicha unin, como son: el pH, la temperatura y la fuerza inica.Dependiendo de la naturaleza del antgeno y del anticuerpo y de las condiciones de la reaccin se pueden observar diferentes tipos de reacciones serolgicas: Neutralizacin Las pruebas de neutralizacin van dirigidas a la deteccin de anticuerpos capaces de bloquear los eptopos crticos del patgeno. Normalmente suelen tener una interpretacin biolgica correlacionada con la proteccin. Sin embargo, no suelen ser tiles para diferenciar respuestas entre animales infectados y vacunados ya que la matyora de vacunas inducen anticuerpos neutralizantes. Mediante anticuerpos especficos se pueden neutralizar toxinas, virus o enzimas, Los anticuerpos neutralizantes requieren un solo tipo de combinacin con el antgeno para poder actuar y as pueden ser univalentes, aunque anticuerpos bivalentes o multivalentes pueden neutralizar tambin. Un antisuero que contiene anticuerpos neutralizantes contra una toxina se denomina "antitoxina". Precipitacin La reaccin de precipitacin ocurre cuando se combina un anticuerpo, por lo menos divalente,con un antgeno soluble y esto conlleva a la formacin de agregados que precipitan. Como las reacciones de precipitacin son fcilmente observables "in vitro", stas resultan pruebas serolgicas muy tiles, especialmente para medir concentraciones de anticuerpos. Para que la precipitacin ocurra en forma mxima se necesita que tanto el antgeno como el anticuerpo estn en concentraciones ptimas, cuando cualquiera de los reaccionantes estn en exceso no se pueden formar grandes agregados antgeno-anticuerpo. Un ejemplo clsico de este tipo de pruebas es la inmunodifusin en gel de agar utilizada histricamente en el diagnstico de la leucosis bovina.

Aglutinacin Cuando un antgeno particulado reacciona con su anticuerpo especfico (divalente por lo menos)se observa la formacin de grumos o agregados de estas partculas, esto se conocecomo aglutinacin. En estas reacciones el determinante antignico est sobre la superficie de una partcula o de una clula. Estas reacciones son ms sensibles que las de precipitacin para detectar pequeas cantidades de anticuerpos, debido a que relativamente pocas molculas de anticuerpo pueden unir efectivamente un gran nmero de partculas de antgeno en grumos gruesos macroscpicamente visibles HEMAGLUTINACION. Los anticuerpos pueden reaccionar con antgenos de los glbulos rojos, u otros antgenos que se pueden adsorber a los glbulos rojos y observarse hemaglutinacin cuando se una el anticuerpo especfico. Suele tratarse de pruebas muy sensibles pero con poca especificidad. Ejemplos de este tipo de pruebas es la aglutinacin con rosa de Bengala empleada en el diagnstico de la brucelosis Inmunofluorescencia Es una tcnica donde las molculas de anticuerpos son convertidos en sustancias fluorescentes,unindoles qumicamente a compuestos orgnicos fluorescentes tales como isotiocianato de fluorescencia o rodamina B Esto no altera la especificidad del anticuerpo pero hace posible su deteccin cuando est unido a clulas o tejidos usando un microscopio para fluorescencia. Los anticuerpos fluorescentes son de considerable utilidad en microbiologa diagnstica. Para demostrar la presencia de antgenos o clulas bacterianas utilizando anticuerpos fluorescentes,existen dos procedimientos: el mtodo directo y el indirecto. En el mtodo directo, el anticuerpo marcado es especfico contra el antgeno En el mtodo indirecto, la presencia del anticuerpo especfico sobre la superficie de la clula es detectado por el uso de otro anticuerpo fluorescente dirigido contra el anticuerpo especfico. Ejemplos de este tipo de pruebas los encontramos en el diagnstico directo de la mayora de virus del sndrome respiratorio bovino Complemento Adems de las reacciones antgeno-anticuerpo ya descritas, existen otros tipos de reacciones de gran importancia en inmunidad donde participa el Complemento. El complemento acta junto con los anticuerpos especficos para llevar a cabo varios tipos de reacciones antgeno-anticuerpo que de otra manera no podran ocurrir, tales como: lisis de clulas bacterianas, muerte de clulas bacterianas, hemlisis, etc. El complemento no es un anticuerpo (por lo tanto no aumenta con la inmunizacin), sino unaserie de enzimas que se encuentran en el suero normal y que atacan a las clulas bacterianas u otros agentes extraos. Estas enzimas, que se encuentran an en individuos no inmunizados, son normalmente inactivas, pero se activan cuando ocurre una reaccin antgeno-anticuerpo.Una de las principales funciones del anticuerpo es reconocer las clulas invasoras y activar el sistema del complemento para que acte. Acciones del complemento Entre las principales acciones del complemento tenemos: Lisis bacteriana Especialmente de bacterias Gram negativas, cuando los anticuerpos especficos se combinan con el antgeno de la superficie bacteriana en presencia de complemento.

Muerte microbiana En ausencia de lisis ocurre la muerte microbiana cuando los anticuerpos especficos se combinan con los antgenos de la superficie bacteriana en presencia de complemento. Promocin de la accin fagocitaria: Cuando se combinan bacterias capsuladas con el anticuerpo especfico en presencia de complemento se promueve la accin fagocitaria Este proceso en el cual los anticuerpos especficos ms complemento hacen una clula susceptible a la fagocitosis se llama ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante unanticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado). ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran variedad de antgenos, por eso es un mtodo ms polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisin por tener

un eslabn ms con respecto al mtodo directo. La dilucin de la solucin que contiene el anticuerpo primario (por ejemplo: suero sanguneo) es un factor muy importante a tener en cuenta para evitar la aparicin de falsos negativos, ya que si la muestra est muy diluida no saldr positiva si la titulacin de anticuerpos es muy baja. Es decir, aunque los anticuerpos estn presentes, la prueba no da positivo porque la concentracin de anticuerpos especficos contra el antgeno que est pegado en el fondo del pocillo no es suficiente como para dar una seal detectable. El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (polimerasa chain reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturasalternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. Tecnica de Western Blot El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella.1 2 Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica,fluorescencia entre otros mtodos. De

esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas

Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, sern estos los que realizen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario antihumano unido a una enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de protenas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.

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