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LABORATORIO DE ANALISIS DE ALIMENTOS SEPARACIN DE PROTENAS

INTRODUCCIN Las protenas son sustancias orgnicas muy complejas presentes en toda la materia viva. Todas las protenas contienen adems de carbono, hidrgeno, tambin nitrgeno y a menudo azufre y fsforo. Todas las protenas se componen bsicamente de 20 unidades estructurales denominadas aminocidos unidos por enlaces peptdicos provocando caractersticas especficas en cada una. Las propiedades de las protenas se ven afectadas por modificaciones en el pH, la absorcin de protenas mediante intercambio inico depende del pH, es decir de valores de pH por abajo del punto isoelctrico la carga neta de la protena es positiva y la molcula se ve absorbida con mayor fuerza en intercambiadores catinicos como la carboximetil celulosa sdica. Esta propiedad permite la separacin y la purificacin de protenas mediante cromatografa de intercambio inico. La movilidad de las molculas de protenas en un campo electrosttico tambin depende del valor de pH. investigacin de protenas. OBJETIVOS El estudiante identificar el pH isoelctrico de la casena. El estudiante aprender a separar la clara del huevo en sus fracciones de globulina y albmina por el mtodo de precipitacin salina o salado. El estudiante aprender a realizar una dilisis. El estudiante conocer la prueba de Buiret para la identificacin de protenas. Esta propiedad permiti desarrollar la tcnica de la electroforsis que es una de las ms utilizadas en la

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MATERIALES 9 tubos de ensayo. 2 tubos de centrfuga de 100 ml. 2 agitadores de vidrio. Bolsas para dilisis. Tela de manta de cielo o gasa (proporcionada por el alumno). 1 Matrz volumtrico de 500 ml. 1 Gradilla 1 Rollo de Hilaza (proporcionado por el alumno) Tijeras (proporcionadas por el alumno) 1 molde para elaborar el queso (proporcionado por el alumno) Manta de cielo (proporcionada por el alumno) 1 termmetro con escala de hasta 200C EQUIPO Potencimetro. Centrfuga. REACTIVOS Soluciones de cido actico 0.01, 0.1 y 1M. Casena. Sulfato de amonio. Solucin de NaOH 1M. Solucin saturada de sulfato de amonio. Solucin de NaCl 0.15M. Solucin de NaOH al 20%. Solucin de sulfato cprico al 0.5%. Alcohol amlico. 3 4 huevos (proporcionados por el alumno). Agua destilada. Leche entera de vaca, cabra u oveja (proporcionada por el alumno) Tabletas de renina o cuajo Sal yodatada (de mesa, proporcionada por el alumno) PREPARACIN DE LA SOLUCIN DE CASENA 1) En un matraz volumtrico de 500 ml. coloque 2.5 g de casena. 2) Adicione 200 ml de agua destilada y un volumen de solucin de NaOH (1M) que proporcione exactamente 0.05 moles de NaOH. 3) Agregue unas gotas de alcohol amlico para disminuir la formacin de espuma.

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4) Agite, disuelva y adicione una solucin de cido actico 1M que proporcione exactamente 0.05 moles de cido actico 5) Afore a 500 ml. con agua destilada. DETERMINACIN DEL pH ISOELCTRICO DE LA CASENA El pH isoelctrico (baja solubilidad, carga neta igual a 0) debe recordarse cuando se investiga sobre la separacin y purificacin de fracciones proticas. Existen varios mtodos para la determinacin experimental del pH En esta determinacin el pH donde se isoelctrico (pHI) de una protena. la casena. La casena est presente en la leche en forma de partculas coloidales o micelas y son fcilmente separadas por precipitacin isoelctrica. El cuajado y la acidificacin son una prctica de la tecnologa de lcteos para la preparacin de productos de leche agria y algunos quesos suaves. La acidificacin natural se lleva a cabo por inoculacin de la leche con iniciadores por ejemplo, cultivos de bacterias cido lcticas.

presenta la mnima solubilidad puede ser usado para estimar el pH isoelctrico de

PROCEDIMIENTO 1) Prepare una serie de tubos como se indica: REACTIVO (volumen en ml.) H2O HOAC 0.01M HOAC 0.1 M HOAC 1.0 M TUBO 4 8.5 0.5 NMERO 5 6 8.0 7.0 1.0 2.0 -

1 8.4 0.6 -

2 7.8 1.2 -

3 8.8 0.2 -

7 5.0 4.0 -

8 1.0 8.0 -

9 7.4 1.6

2) Agregue 1 ml. de solucin de casena a cada muestra y mezcle inmediatamente cada 2 minutos. 3) Observe la presencia o ausencia de turbidez en la mezcla a los 10, 30 y 50 minutos. 4) Tabule los resultados e indique el grado de precipitacin:

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0 = ningn cambio. 1+ = opalecencia. 2+ = notable opalecencia. 3+ = precipitacin. 4+ = marcada precipitacin. 5+ = abundante precipitacin. 5) Determine el pH de cada tubo en el medidor de pH. II. PRECIPITACIN SALINA O SALADO) La precipitacin salina o salado es uno de los mtodos de separacin de protenas de su estado natural (actividad biolgica). El sulfato de amonio es una de las sales ms utilizadas para la precipitacin salina de protenas. Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20C, temperatura promedio del laboratorio) y el in sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas. En esta determinacin la protena blanca del huevo (clara) ser separada en fracciones de globulina y albmina. PROCEDIMIENTO Es recomendable trabajar en equipos de trabajo de 2 a 3 personas. 1) Separe las claras y las yemas de 3 4 huevos. 2) Combine las claras y filtre a travs de una manta de cielo o gasa. 3) Coloque 25 ml. de clara de huevo en un tubo de centrfuga y adicione 25 ml. de solucin saturada de sulfato de amonio, mezcle suavemente. 4) Deje en reposo durante 30 minutos moviendo ocasionalmente. 5) Permita que sedimente y decante el lquido sobrenadante. Guarde el precipitado y la fraccin sobrenadante. 6) Realice una prueba de confirmacin de la presencia de protena en la muestra como se describe a continuacin: REACCIN DE BUIRET DIFERENCIAL DE PROTENAS (PRECIPITACIN

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Cuando una solucin de protena fuertemente alcalina es adicionada a una solucin de sulfato de cobre se obtiene un color prpura. La reaccin es caracterstica de las sustancias que poseen dos grupos -NH-CO- unidos directamente o separados por un tomo de carbono o de nitrgeno. Se trata de una reaccin inducida por la unin peptdica pero tambin puede ocurrir en sustancias no proticas que posean tal estructura (ejemplo, la biurea o buiret). PROCEDIMIENTOS 1) Adicione 2 ml de solucin de NaOH al 20% a 2 ml. de la solucin de prueba (la del paso 5 antes mencionada (fraccin sobrenadante). 2) Mezcle y aada gota a gota solucin de sulfato cprico al 0.5%. 3) Agite constantemente hasta la formacin del color prpura. Un exceso de sulfato cprico provocar la formacin de un precipitado de hidrxido de sodio. 7) Demuestre que el slido es globulina: a) Pruebe la solubilidad en solucin de NaCl 0.15M b) Transfiera la solucin de NaCl conteniendo la protena disuelta a una bolsa de dilisis y permita la dializacin durante la noche frente a 500 ml de agua destilada. Observe y explique TODOS los resultados.

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FORMACIN DE UN GEL Dos de los geles proticos ms conocidos y presentes en alimentos son: gelatina casena coagulada (queso) Esta determinacin estudiar los principios de la fabricacin de quesos en semejanza con la formacin de geles. PROCEDIMIENTO 1) Pulverizar tableta de renina y adicionarla a 100 mL de leche 2) Calentar 900 mL de leche en un precipitador (u olla proporcionada por el alumno) de 1000 mL hasta alcanzar 75C (utilizar parrilla de calentamiento o, puede ser mechero pero se debe tener mucho cuidado al utilizarlo para que la leche no se derrame al hervir) 3) Adicionar los 100mL de leche que contienen la renina o cuajo a la porcin caliente. 4) Mover algunas veces 5) Dejar en reposo durante 15 minutos para formar la cuajada 6) Presionar la cuajada sobre manta de cielo para separarla del suero. Adicionar sal al gusto 7) Dejar en reposo la cuajada en su molde durante 15 minutos para formar el queso Explicar qu sucede durante el proceso de elaboracin del queso.

BIBLIOGRAFIA Braverman, J.B.S. 1980. Introduccin a la bioqumica de los alimentos. 2. Ed. Z. Berk. Editorial El Manual Moderno. Mxico, 358pp. Egan, H., Kirk, R.S., Sawyer, R. 1988. Anlisis qumico de alimentos de Pearson. Ed. C.E.C.S.A. Mxico, 586pp. Pearson, D. 1976. Tcnicas de laboratorio para el anlisis de alimentos. Ed. Acribia. Espaa 331pp.

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Watty, B. M. 1982. Qumica analtica. Mxico, 671pp.

Ed. Alhambra Universidad.