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TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC Ingeniería Bioquímica Método de Elaboración de un Bioinsecticida Contra

TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC

Ingeniería Bioquímica

Método de Elaboración de un Bioinsecticida Contra las plaga insectívoras

Guerrero Chávez Arturo.

Grupo:3551

Fecha de entrega:

02/08/2013

Vo.Bo. Dr(a). García Rivero Mayola Div. Ingeniería Química y Bioquímica

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II RESUMEN En los últimos años, varios sistemas agrícolas

RESUMEN

En los últimos años, varios sistemas agrícolas han sido seriamente afectados por plagas de insectos, que de ser en general una especie de importancia secundaria se ha convertido en un problema agrícola principal presente en todos los continentes.

Aunque es difícil cuantificar su impacto sobre la producción, las pérdidas ocasionadas por las plagas de esta especie, equivalen a decenas y quizás cientos de millones de dólares. Además de las pérdidas de cultivos debe sumarse el aumento en los costos de producción, debidos al uso de insecticidas químicos. Varias especies de parasitoides, depredadores y hongos entomopatógenos han sido estudiadas con el fin de reducir estos costos y sin provocar el daño que causan los insecticidas químicos a los suelos. Los hongos entomopatógenos tienen la particularidad de invadir a sus hospedantes a través del tegumento por lo que se consideran de gran utilidad para el control de las poblaciones de insectos. Varios autores han apuntado la posibilidad de empleo de hongos como Paecilomyces fumosoroseus Aschersonia aleyrodis, Verticillium lecanii, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Se pretende realizar de modo artesanal la producción de un Bioinsecticida a base de un hongo llamado Besuveria bassiana, la cual será sembrada en un medio solido en este caso arroz para la obtención de esporas del dicho hongo para su aplicación directa a los cultivos agrícolas.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

¿Cuál sería la solución para el control de la plagas sin afectar el suelo?

Una alternativa para el control de plagas es el uso de organismos entomopatógenos en este caso los hongos de Bauveria bassiana, los cuales tienen la capacidad de reducir las poblaciones de plagas agrícolas de una manera satisfactoria y económica.

De igual manera para reducir los efectos negativos de los insecticidas químicos en el suelo y disminuir los problemas en las plagas, debido al desarrollo de resistencia a estos y a la destrucción de sus enemigos naturales (otros Insectos como arácnidos).

HIPOTESIS.

Elaboración de un plaguicida biológico que consistirá de su elaboración en un medio sólido para la obtención esporas producidas por hongos entomopatógeno llamado Bauveria bassiana para reducir la población de plagas agrícolas.

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II Objetivo General Se elaborara un Bioinsecticida a base de

Objetivo General

Se elaborara un Bioinsecticida a base de esporas Beauveria bassiana para el control de plagas agrícolas de modo artesanal y semi-industrial para reducir los costos en la utilización de insecticidas químicos.

Objetivos Específicos

Elaboración de esporas de Beauveria bassiana en un medio solido (arroz). Beauveria bassiana en un medio solido (arroz).

Adaptar la producción del Bioinsecticida a una manera artesanal para su fácil elaboración y aplicación a los campos de cultivo.esporas de Beauveria bassiana en un medio solido (arroz). JUSTIFICACIÓN Debido a la ingestación de insectos

JUSTIFICACIÓN

Debido a la ingestación de insectos sobre distintos cultivos en el país se generan cuantiosas pérdidas económicas, que han obligado a los agricultores a buscar medidas para eliminar a estos insectos, dándoles la posibilidad de exportar sus productos a mercados donde se pagan mejor por sus productos como Estados Unidos de Norteamérica y Asia. En estos países las medidas de sanidad son más rigurosas que en nuestro país por lo que los productores deben cuidar aspectos que eviten residuos tóxicos sobre sus cultivos. Bauveria bassiana es un hongo entomopatógeno específico para algunos insectos que atacan cultivos de algodón, aguacate, café, chile, cítricos, flores, frambuesas, fresas, fríjol, papa, plátano, tomate, jitomate, tabaco, soya y zarzamora. Este se puede aplicar como medida preventiva al ataque de plagas, evitando aspectos desagradables sobre frutos, o aplicarse directamente en cultivos siniestrados e inclusive en el producto cosechado con plaga.

Las plagas agrícolas han sido controladas durante años mediante el empleo de plaguicidas químicos de fuerte impacto negativo sobre los organismos benéficos presentes en el ambiente. Con el objetivo de promover y acelerar el uso de hongos en el control de plagas en los cultivos es necesario el desarrollo de formulaciones eficaces y estables que permitan su manejo y aplicación en el campo. En este trabajo se presentan consideraciones para el desarrollo de productos de origen fungoso, los tipos de formulaciones en que pueden ser la forma de granulado y polvo humedecible que son las más usada hasta estos momentos, en las que nos basaremos para la producción artesanal de nuestro Bioinsecticida.

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II ANTECEDENTES. En el mundo numerosos grupos de investigadores

ANTECEDENTES.

En el mundo numerosos grupos de investigadores y empresas productoras se concentran en el desarrollo de productos comerciales a partir de hongos en forma de gránulos o polvo humedecible entre los que se citan Biofox C (F. oxysporium y F. moniliforme SIAPA, Italia), Mycotal (V. lecanii, Koppert, Holanda), Mycotrol GH (B. bassiana, Mycotech, USA), Green Muscle (M. flavoviride, CABI Bioscience, UK), DiTera (M. verrucaria, Valent (Sumitomo), USA, Japón) (Burges, 1998;Butt y Copping, 2000). Algunas formulaciones granuladas muy sencillas son las del hongo en arroz o arroz molido obtenidas mediante el proceso de producción masiva del hongo. Otras como las de gránulos de aceite hidrogenado son utilizadas para conidios deB. Bassiana (Carballo, 1998). Se han evaluado formulaciones en gránulos de alginato usando agentes aumentadores como cáscara de naranja seca molida. Existen, además, procedimientos para la preparación de formulaciones de micelio o conidios en gránulos de alginato (Carballo, 1998).

INTRODUCCIÓN.

En México y otros países son frecuentes e importantes los daños que causan plagas de insectos que atacan a las plantas cultivadas (Alatorre y col., 2000). Para controlar este tipo de insectos se ha tenido que recurrir al uso de plaguicidas químicos sintéticos tales como los clorados, organofosforados y piretroides, los cuales fueron exitosos en el control de plagas en sus inicios, minimizando las pérdidas de las cosechas. Sin embargo, como consecuencia de su uso inadecuado e indiscriminado, pronto aparecieron problemas de resistencia de los insectos hacia estos productos, así como un rápido crecimiento de las poblaciones de plagas secundarias y alteraciones ecológicas, causando efectos indeseables en el medio ambiente y en la salud del ser humano. Esto ha ocasionado la prohibición o restricción de muchos insecticidas como el dieldrín, mirex, BHC, paratión etílico, toxafeno y DDT (Morales y col., 2009). Con el fin de minimizar estas consecuencias desfavorables, se ha propuesto disminuir el uso de los plaguicidas convencionales y desarrollar nuevas estrategias para un Manejo Integrado de Plagas (MIP), principalmente por medio del control biológico siendo este un método de control de plagas más racional y respetuoso con el medio ambiente y acordes con la filosofía de “desarrollo sustentable” (Badii y col, 2006).

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II El MIP es una alternativa para disminuir la dependencia

El MIP es una alternativa para disminuir la dependencia en el uso de insecticidas químicos sintéticos. Se basa en las prácticas culturales con orientación al control de plagas, la capacidad que tienen las plantas para tolerar o resistir sus daños y la acción de los factores naturales de mortalidad de las mismas, como lo son los parasitoides, depredadores y patógenos de insectos-plagas. Estas tres últimas son la alternativa de control más usada para sustituir el uso inadecuado de los insecticidas (Alatorre y col., 2000).

Marco Teórico.

”El desarrollo y aplicación de agentes de control biológico de plagas adquiere una importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una agricultura sostenible que preserve los recursos naturales y el medio ambiente para las futuras generaciones. La aplicación controlada en agro ecosistemas de organismos vivos o sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, implica el mejoramiento de los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por agentes Fito patógenos

En la naturaleza, los hongos entomopatógenos pueden eliminar o mantener las plagas en niveles que no ocasionan daños económicos a los cultivos

Estos hongos se encuentran en rastrojos de cultivos, estiércol, en el suelo, las plantas; logrando un buen desarrollo en lugares frescos, húmedos y con poco sol. Constituyen, además, el grupo de mayor importancia en el control biológico de insectos plagas. Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por hongos

Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700 especies de hongos entomopatógenos. Entre los géneros más importantes están: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erilla, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium

Para utilizar hongos entomopatógenos como insecticidas deben producirse cantidades masivas del hongo, el cual debe mantener su capacidad infectiva por un período de tiempo considerable. Los hongos se han reproducido para su uso como agentes biológicos de plagas desde hace 100 años, para lo cual se ha utilizado diferentes métodos de reproducción. Entre ellos, el uso de sustratos como arroz, trigo y medios líquidos mediante técnicas más sofisticadas

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II La explotación de los hongos para el control de

La explotación de los hongos para el control de plagas implica una amplia investigación donde se involucran disciplinas como la patología, ecología, genética, fisiología, producción masiva, formulación y estrategias de aplicación

Una buena formulación es la base para el éxito de un bioplaguicida de origen microbiano; la posibilidad de obtener productos adecuados depende de las propias características del microorganismo y su relación con los componentes de la formulación (excipientes) y el ambiente de almacenamiento

Para el desarrollo de nuevos productos de origen biológico se deben tener en cuenta diferentes aspectos: primero definir un medio de cultivo óptimo y el mejor sistema para la obtención masiva de inóculo que permita una buena relación costo - rendimiento en la producción; establecer ensayos de producción a pequeña escala; garantizar la estabilidad del producto y determinar las condiciones de almacenamiento; poder utilizar la maquinaria standard de cualquier explotación agrícola para su aplicación, y ser efectivo a unas dosis parecidas a las utilizadas para los agroquímicos así como bioensayos de laboratorio, invernadero y campo que confirmen la efectividad del producto una vez formulado

El objetivo de una formulación de hongos entomopatógeno es aumentar la estabilidad durante el almacenamiento y después de la aplicación. Las propiedades físicas y biológicas de la formulación deben permanecer estables por un tiempo mínimo de 12 meses, pero es recomendable que se mantengan durante 18 meses para permitir su comercialización. Además de mejorar la adhesión a la cutícula del insecto; aumentar o mantener la virulencia y permitir su aplicación con equipos de volumen ultra bajo

En condiciones de laboratorio es difícil mantener la viabilidad de hongos entomopatógeno por mucho tiempo. De esta manera, formular un entomopatógeno consiste en adicionarle determinados compuestos que mejoran su desempeño en el campo, facilitando su manejo, aplicación y permita su almacenamiento en condiciones que disminuyen el costo, con una pérdida mínima de las cualidades del producto. Para ser formulado, la viabilidad del hongo no debe ser menor de 95 % y el contenido de humedad entre 4 - 6 %. Los materiales utilizados en la formulación no deben tener actividad biológica; ni afectar la actividad del hongo, deben ser inocuos al ambiente, presentar características físicas adecuadas para mezclarse con los conidios; facilitar la aplicación del producto y ser económicamente rentables

Existen varios tipos de formulaciones, el que una sustancia activa dada se presente de una forma u otra dependerá básicamente de sus propiedades fisicoquímicas

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II (solubilidad, tamaño de partícula, densidad, fluidez), de

(solubilidad, tamaño de partícula, densidad, fluidez), de la maquinaria de que dispone, el aplicador y de factores económicos.

La apreciación que tiene el hombre acerca de los hongos que atacan insectos no está limitada al concepto moderno de su utilización para el control biológico de plagas. Dos milenios atrás los chinos estaban conscientes de la momificación de gusanos de seda por especies de Cordyceps e Isaria. Colocaban efiges de estos gusanos elaboradas en piedras preciosas y semipreciosas en la boca de sus bocas, para conferirles el mismo grado de inmortalidad. Las orugas infectadas por Cordyceps se utilizan en la medicina tradicional china, por lo menos desde hace mil años, para el tratamiento de la adicción al opio hasta su consumo como tónicos y aun como afrodisíacos

Hasta en la década de los noventas la mayor cantidad de investigaciones enfocadas al control biológico se realizaban con bacterias y virus, aunque los hongos representan el grupo más amplio de patógenos a insectos. Al parecer existía cierto rechazo a utilizar hongos entomopatógenos como biocontroladores.

Debido a los factores ambientales que no favorecían el empleo exitoso y a las dificultades que se presentaban para su producción a gran escala, junto con su formulación adecuada como bioinsecticida. No obstante los hongos se han utilizado para el control de melazas desde 1950. Siendo producidos los primeros micoherbicidas a principios de la década de los ochenta en USA (Auld, 1991). Agostino Bassi (citado por Roberts y Humber, 1981) estableció la teoría de los gérmenes que provocaban en animales a mediados de la década de 1830, con sus estudios sobre las infecciones de Bauveria bassiana en larvas del gusano de seda.

Bauveria bassiana es un candidato interesante para emplearse como bioinsecticida pues tiene ventajas con respecto a otros microorganismos como Bacillus thuringiensis (Bt.) y los virus: las cepas aisladas tiene un rango de hospederos amplio e infectan por invasión a través de la cutícula, de tal forma que pueden atacar áfidos, larvas de lepidópteros y coleópteros, y otros insectos masticadores

Este hongo se ha producido por fermentación sólida en Rusia, la república popular China y en el Brasil. La producción de esporas de Beauveria bassiana por fermentación en medio sólido (FMS) representa una alternativa interesante para la obtención de Bioinsecticida económicamente efectivo.

Los medios de cultivo utilizados son sencillos, consisten en residuos o productos agrícolas que pueden contener todo tipo de nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos, y pueden obtenerse a bajo costo cerca de las áreas de

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II aplicación. Requieren pretratamientos simples

aplicación. Requieren pretratamientos simples frecuentemente es necesario molerlos para reducir el tamaño de partícula.

Características del proceso de infección de B. bassiana

Usualmente invade a través de la cutícula (exoesqueleto quitinoso) del insecto.

Las unidades infecciosas casi siempre son esporas, que se unen a la superficie del integumento, germinan y penetran la cutícula. En algunos casos penetra a través del tracto digestivo (Debach y Rosen, 1991). En el interior del insecto, B. bassiana se propaga y coloniza el hemolinfo. Roberts y Humber (1981) dividieron el proceso de infección en diez pasos: unión de las conidias a la cutícula del insecto, germinación de las conidias en el insecto, penetración de la cutícula, crecimiento del hongo en el hemolinfo, producción de toxinas, muerte del hospedero, crecimiento micelar e invasión de todos los órganos del hospedero, salida de la hifas a través de la cutícula, producción de esporas, y dispersión de las esporas por el entorno

La unión de las conidias a la cutícula de los insectos es el evento inicial en el establecimiento de la micosis. Cuando se produce el contacto las esporas se unen fuertemente a la epicutícula (superficie externa de la cutícula) mediante interacciones hidrófobas no específicas que juegan un papel fundamental en la adhesión (Boucias et al., 1988).

La superficie exterior de la pared de las esporas y la epicutícula contienen los elementos determinantes para la unión. La superficie de las conidias de B. bassiana está cubierta de una capa bien organizada de haces entretejidos de fibras, compuestas fundamentalmente por carbohidratos que le confieren resistencia contra la deshidratación, su hidrofobicidad característica, y facilitan su dispersión en el aire (Boucias et al., 1988). Figura 1.

su dispersión en el aire (Boucias et al., 1988). Figura 1. Figura 1.Estructura y composición de
Figura 1.Estructura y composición de la cutícula de insectos y forma de penetración de hongos
Figura 1.Estructura y composición de la cutícula de insectos y forma de penetración de hongos
entomopatógenos (Montesinos, 2008).

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y composición de la cutícula de insectos y forma de penetración de hongos entomopatógenos (Montesinos, 2008).
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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II Los carbohidratos como α -D- manosa α -D- glucosa

Los carbohidratos como α-D-manosa α-D-glucosa y β-galactosamina y glicoproteínas como las lecitinas, presentas en la pared de las conidias, están implicados en procesos de quimiotaxis, adhesión e infección (Hegedus et al.1992). Es probable que la formación de estos carbohidratos pueda ser facilitada con la correcta formulación del medio de cultivo utilizado en la producción de esporas (Lane et al., 1991).

En la fase de crecimiento micelar y producción de esporas, el hongo invade prácticamente todos los órganos del insecto provocando su muerte. Si las condiciones de humedad y temperatura ambientales no son las adecuadas, el hongo permanece dentro del cadáver que sirve como su reservorio. Cuando se restablecen las condiciones apropiadas el hongo emerge a través de la cutícula y produce esporas (conidias), que se dispersan con las corrientes de aire o agua. En esta fase B. bassiana puede restablecer relaciones endofíticas con diferentes plantas, colonizarlas sin dañarlas o interactuar de forma específica con estas, pues no es un hongo fitopatógeno. Se ha demostrado que este hongo puede colonizar plantas de maíz a nivel de los verticilos, moverse por su sistema vascular de forma pasiva, y persistir en su interior por largos períodos. Esta capacidad puede aprovecharse para su utilización en el control de plagas.

La producción de toxinas es una característica de la gran mayoría de las especies de hongos entomopatógenos. Estas sustancias pueden, en muchos casos, originar la muerte del insecto debido a sus propiedades biocidas; además actúan como inhibidores de las reacciones de defensa del hospedante por alteraciones en los hemocitos y retraso en la agregación de las células de la hemolinfa (Vey yGötz, 1986). Las toxinas que producen los hongos entomopatógenos pueden ser macromoléculas proteicas o moléculas de tamaño medio a pequeño con bajo peso molecular (Roberts, 1981; Vey et al. 2001). Entre las toxinas producidas por hongosentomopatógenos destacan las destruxinas producidas por M. anisopliae como las más estudiadas. La muerte del insecto puede resultar de una combinación de factores incluyendo agotamiento de nutrientes, obstrucción física o invasión de órganos y Toxinas producidas por algunas especies de Hifomicetos entomopatógenos.

Finalmente el hongo concluye su ciclo al colonizar externamente al cadáver del insecto y producir y liberar al medio millones de conidias infectivas, que funcionarán como inóculo secundario para infectar a otros individuos. Figura 2.

secundario para infectar a otros individuos. Figura 2. Figura 2. Faces de la colonización de Beauveria

Figura 2. Faces de la colonización de

Beauveria bassiana en una larva de lepidóptera causante de la perdida de

muchos cultivos de maíz en el mundo.

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II Tecnologías para producciones de hongos. Tecnologías

Tecnologías para producciones de hongos.

Tecnologías básicas

En el mundo se realizan desde muy puntuales y pequeñas producciones de agentes de biocontrol como la tecnología desarrollada sobre medio agarizado para la producción de Phlebiopsis gigantea, hongo antagonista basidiomiceto del también basidiomiceto Heterobasidion annosum, que es el agente causal de la enfermedad que más afecta la raíz de las coníferas en el hemisferio norte, hasta producciones a escala industrial como las desarrolladas por Mycotech Corporation que pueden llegar a varias toneladas de Beauveria bassiana anualmente.

Los métodos de producción varían considerablemente. Muchos están basados en fermentaciones sobre sustrato sólido con granos de cereales donde el arroz es el más universal. Otros usan sustratos no nutritivos como gránulos de arcilla. Algunos rinden conidios aéreos en la superficie de cultivos líquidos estáticos. Otras tecnologías se desarrollan en tanques de fermentación para obtener productos a base de micelio, blastosporas o conidios sumergidos.

Las 4 formas de producción fundamentales para hongos son:

1. Cultivos bifásicos, donde se desarrolla el inóculo en cultivo líquido agitado (de forma rápida) o líquido estático (más lento) y luego se pasa al soporte sólido. En los sistemas bifásicos siempre se debe optimizar el cultivo de la fase líquida para que promueva un rápido crecimiento del aislado. Es el más usado a nivel mundial por obtenerse estructuras infectivas de alta calidad y acortarse el tiempo cuando la fase líquida se hace por cultivo líquido agitado. Son semiartesanales.

2. Cultivos sobre soporte sólido, siendo una forma de producción donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones altas. Son artesanales

3. Cultivos líquidos agitados o fermentaciones líquidas con un grado de automatización del proceso que puede ser muy alto, son muy rápidos, pero tienen como desventaja el que muchos aislados tienden a crecer como pellets miceliales discretos y/o forman abundantes blastosporas (esporas formadas propagadas por gemación a partir de fragmentos de micelio originalmente), propágalos estos que no son apropiados por la baja estabilidad intrínseca y poseer per se bajó o nulo poder infectivo. En estos sistemas se logra un óptimo aprovechamiento de los nutrientes. Pueden llegar hasta niveles industriales

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II 4. Cultivos líquidos estáticos, los que constituyen una

4. Cultivos líquidos estáticos, los que constituyen una forma de producción donde se requiere menos equipamiento y se realizan muchas operaciones manuales pero se obtiene estructuras infectivas de alta calidad a concentraciones bajas pues solamente hay formación de estructuras deseadas en la interface líquido- gaseosa. Son artesanales

Una forma especial de cultivo sólido con tecnología avanzada lo constituyen las fermentaciones en estado sólido las que han dado la oportunidad a la industria de desarrollar producciones de bioplaguicidas en birreactores sellados con un grado alto de automatización, con principios similares a aquellos de la fermentación líquida, lo que reduce costos de mano de obra y permite un control eficiente del proceso de producción donde se logra biomasa de alto valor infectivo y más resistente a condiciones ambientales adversas. En estos sistemas también se logra un óptimo aprovechamiento de los nutrientes pero la inversión de capital inicial es muy alta.

Para los países del tercer mundo esta tecnología presenta menos posibilidades de aplicación debido a las dificultades económicas y el alto costo de capital de estos procesos automatizados. La presencia de mano de obra barata y un mercado que es regional y pequeño hace a los sistemas de producción artesanales (baja tecnología) viables económicamente a pesar de requerir muchas operaciones manuales.

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II Descripción del proceso productivo artesanal (“baja

Descripción del proceso productivo artesanal (“baja tecnología”).

CULTIVO INICIAL EN VIALES CON MEDIO AGARIZADO
CULTIVO INICIAL EN VIALES CON
MEDIO AGARIZADO
INOCULACION E INCUBACION DE MEDIO SOLIDOO (PREINOCULO)
INOCULACION E INCUBACION DE
MEDIO SOLIDOO (PREINOCULO)
INOCULACION E INCUBACION DE SUSTRATO
INOCULACION E INCUBACION DE
SUSTRATO
SECADO
SECADO
COSECHA
COSECHA
FORMULACION
FORMULACION
ENVASADO
ENVASADO

Figura 3. Diagrama de flujo para la elaboración del Bioinsecticida.

Diagrama de flujo general del proceso de producción de hongos por vía artesanal.

En los sistemas artesanales para la producción de hongos se establecen de manera general los pasos enunciados en la Figura 3.

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II METODOLOGÍA. En toda producción de bioplaguicidas

METODOLOGÍA.

En toda producción de bioplaguicidas microbianos se parte de un aislado con características deseadas como agente de biocontrol, el cual es conservado previamente y subcultivado durante el escalado.

Los preinóculos pueden desarrollarse sobre sustratos sólidos (grano arroz, grano trigo, cáscara de trigo, cáscara de arroz, harina de maíz, etc ) incluyendo los medios agarizados de cultivo o por cultivos líquido estático o agitado (compuestos por combinaciones de materias primas carbonadas y nitrogenadas como melaza de caña de azúcar, licor de maíz, almidón de maíz, sacarosa, extracto de levadura torula, extracto de levadura cervecera, etc.) siendo el objetivo fundamental la obtención de una biomasa homogénea. La relación carbono (C): Nitrógenos (N) es esencial y de este balance en lo fundamental dependerá el que se logre la formación de los propágulos deseados. En los hongos, se necesita que la fuente C esté en exceso en el medio y el contenido de N sea el factor limitante del crecimiento, lo que desencadena el proceso esporulativo.

Los inóculos se preparan a partir de subcultivos de preinóculos a una concentración final en el sustrato inoculado de 10(5)-10(7) propágalos/g

La elección de los sustratos sobre los que se realizará la inoculación, previa esterilización, dependerá de la disponibilidad local y costo de estos así como de las características del aislado a reproducir. Se han usado cereales como agentes nutritivos (arroz, trigo, cáscara de trigo, cáscara de arroz, maíz etc.) y como agentes inertes de soporte la vermiculita, gránulos de minerales arcillosos, tela, etc. Con el uso de sustratos inertes las soluciones nutritivas en los que estos se embeben pueden ser balanceados cuidadosamente para asegurar una casi completa utilización de los nutrientes y acá despliegan un papel clave también el balance C:N.

El sustrato puede ser humedecido previa esterilización o previa inoculación dependiendo del tipo de materia prima o combinación de estas y ajustes realizados. Un exceso de humedad provocaría baja disponibilidad de oxígeno y por ende pobre desarrollo del microorganismo. Además compactaría el substrato impidiendo una colonización total de su superficie. Por otro lado, una baja humedad podría inhibir el desarrollo del microorganismo al no poner la suficiente cantidad de nutrientes en solución para ser usado por este además de la poca resistencia a la desecación que tienen los hongos en el periodo activo de crecimiento micelial.

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II Durante la incubación se debe regular el régimen

Durante la incubación se debe regular el régimen luz-oscuridad. La luz es estimulante en determinadas especies y aislados por lo que este parámetro es ajustable solamente a través de la experimentación.

Cuando se obtiene la biomasa conidial óptima sobre toda la superficie del sustrato se pasa al proceso de secado para que los conidios permanezcan viables en almacenamiento por mayor tiempo. Este proceso se optimiza con deshumidificadores o aires acondicionados o acelerando la ventilación con ventiladores lo que depende de las condiciones locales.

Posterior al secado y previo al paso final de envasado en el flujo de producción se realiza la cosecha. Es en este momento que comienza la etapa de formulación donde se prepara una combinación de ingredientes de forma que el principio activo (esporas) se mantenga estable, efectivo y fácil de aplicar.

Durante todo el proceso la regulación de la temperatura ambiental es esencial la que debe ser lo más próxima posible a la temperatura óptima de desarrollo del microorganismo.

Control de calidad del producto cosechado. El control de calidad del producto cosechado se realiza mediante la evaluación de rendimiento en número de conidias por gramo de polvo cosechado y la viabilidad de las conidias (porcentaje de germinación).Se considera de calidad aquel rendimiento que no sea inferior al rendimiento promedio de la cepa y que la viabilidad no sea menor al 95%. Si una cepa presenta un rendimiento muy bajo no debe utilizarse porque su rentabilidad sería muy baja. Cuando el rendimiento es muy bajo se debe a que la cepa es muy vieja y ha ido perdiendo sus características, por lo que se recomienda reactivarla en el insecto hospedante. Las evaluaciones de rendimiento (conidias por gramo de polvo) se deben realizar al momento de la cosecha y antes de la preparación de la formulación.

Control de calidad de la preservación en sálica gel. El control de calidad del material preservado se inicia con la selección adecuada del cultivo puro, el cual debe ser reciente y debe presentar características de buen crecimiento, buena esporulación y buen vigor. El proceso del control de calidad se efectúa entre 5 y 6 días después de la preservación, con el objetivo de determinar el estado del cultivo. Si este se encuentra en mal estado, es necesario descartar todo el material preservado. Se siembran cristales de sálica gel en un medio de cultivo con el propósito de observar el tipo de crecimiento del entomopatógeno y detectar la presencia de contaminantes (bacterias y hongos).

Procedimiento para el control de calidad

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Ecatepec Ingeniera Bioquímica. Taller de Investigación II 1. Anotar en un registro algunas características de

1. Anotar en un registro algunas características de coloración de los cristales de

sálica gel, si contiene humedad, tubo muestreado, la fecha de preservación anterior,

etc.

2. De los tubos preservados se toman de 10 a 15 cristales

siembran en 2 a 3 cajas de Petri con PDA.

de

sálica

gel

y

se

3. A las cajas de Petri se les coloca una etiqueta que lleva la información: la fecha del día del control de calidad, el código de la cepa, la fecha de preservación y número de la caja.

4. Posteriormente las cajas son colocadas en una incubadora temperatura ambiente.

o

se

dejan a

5. Las cajas deben ser revisados tres d.as después de la inoculación para observar

el tipo de crecimiento. El crecimiento del hongo debe ser característico del aislamiento preservado.

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BIBLIOGRAFÍA

Anais da Academia Pernambucana de Ciencia Agronómica, Recife, vols. 5 e 6, p.209-242, 2008-2009.Bioquímica. Taller de Investigación II BIBLIOGRAFÍA BIOINSECTICIDAS: SU EMPLEO, PRODUCCIÓN Y COMERCIALIZACIÓN

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