Está en la página 1de 104
Reactores Enzimáticos
Reactores Enzimáticos
Concepto de velocidad inicial d[ ] [ ] v = , t 0 dt p
Concepto de velocidad inicial
d[ ]
[
]
v =
, t 0
dt
p
s
t
Actividad enzimática velocidad a la que cursa la reacción enzimática • La velocidad es directamente
Actividad enzimática
velocidad a la que cursa la reacción enzimática
• La velocidad es directamente proporcional de la concentración
de enzima.
• la velocidad es una medida de la concentración de enzima en
una preparación.
Medición actividad enzimática katal: moles/s U.I.: moles/min Actividad enzimática específica: UI/ gramo enzima
Medición actividad enzimática
katal: moles/s
U.I.: moles/min
Actividad enzimática específica:
UI/ gramo enzima
UI/ ml de enzima
Variables que influyen en la velocidad de una reacción enzimática 1. Concentración de enzima 2.
Variables que influyen en la velocidad de una
reacción enzimática
1. Concentración de enzima
2. Concentración de sustrato
3. pH
4. Temperatura
5. Efectores (Activadores e Inhibidores)
Efecto de la concentración de enzima: relación lineal v . . . . [E]
Efecto de la concentración de enzima: relación lineal
v
.
.
.
.
[E]
Efecto de la concentración de substrato Hay un número limitado de sitios en la enzima
Efecto de la concentración de substrato
Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar sustrato; una vez que
están ocupados todos, por mucho que aumente la concentración de sustrato, la
velocidad permanecerá constante tendiendo a un valor asintótico
.
.
.
.
v
.
.
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante
.
.
[s]
Descripción dinámica de la catálisis enzimática k k 1 cat E + S ES E
Descripción dinámica de la catálisis enzimática
k
k
1
cat
E + S
ES
E + P
k
2
d ES
[
]
Según hipótesis de
rápido equilibrio
propuesta por
Michaelis - Menten
=
k
[
E
]
[
S
]
k
[
ES
]
= 0
1
2
dt
k
[
E
]
[
S
]
=
k
[
ES
]
1
2
d ES
[
]
0
k
[
E
]
[
S
]
2
=
= K
dt
eq
k
[
ES
]
1
k k 1 cat E + S ES E + P k 2 [ E
k
k
1
cat
E + S
ES
E + P
k
2
[
E
]
= e
[
S
]
= s
[ES]= c
0
0
e = e
s = s
+ c
Balance a la enzima
0
+ c
Balance al sustrato
0
[
E
]
[
S
]
e
s
(
e
c
)
(
s
c
)
0
0
=
=
=
K eq
[
ES
]
c
c
Si [S] se encuentra en exceso s >>>> e > c s = s 0
Si [S] se encuentra en exceso
s >>>> e > c
s = s
0
(
e
s
e
c
)
s
c =
=
1
K eq
c
K
s
eq +
d P
[
]
=
k
[ES]
=
k
c
=
v
cat
cat
dt
v
c =
2
k
cat
Igualando las ecuaciones 1 y 2 …
k ◊ e ◊ s Si toda la enzima se encuentra formando parte del complejo
k
e
s
Si toda la enzima se encuentra
formando parte del complejo [ES]
cat
v =
c = e
K
+
s
eq
por lo que
v
=
k
c
cat
V
=
k
e
max
cat
V
s
max
v =
K
s
eq +
K eq también se denomina K m
v V max 100 80 V ◊ s 60 max v = K s m
v
V
max
100
80
V
s
60
max
v =
K
s
m +
40
20
K
s
m
0
0
20
40
60
80
100
Representación recíproca doble (Lineweaver - Burk) 0.04 1/v 0.03 1/V max 0.02 -1/K m 1
Representación recíproca doble
(Lineweaver - Burk)
0.04
1/v
0.03
1/V max
0.02
-1/K m
1
K
1
1
m
0.01
=
+
v
V
s
V
mx
mx
0.00
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
1/s
Modelos de reacción con más de un sustrato Modelo Secuencial - Ordenado - Aleatorio Modelo
Modelos de reacción con más de
un sustrato
Modelo Secuencial - Ordenado
- Aleatorio
Modelo Pin-pong
Modelo Secuencial - Ordenado
Modelo Secuencial - Ordenado
Modelo Secuencial - Aleatorio
Modelo Secuencial - Aleatorio
Modelos de reacción con más de un sustrato Modelo Pin-pong
Modelos de reacción con más de un sustrato
Modelo Pin-pong
Modalidades de Reacción Enzimática
Modalidades de
Reacción Enzimática
A: Lotes agitado continuo D: Tanque B: Lotes con recirculación E:
A: Lotes
agitado continuo
D: Tanque
B: Lotes con recirculación
E:
Más del 80% del valor comercial de las enzimas está relacionado con su proceso de
Más
del
80%
del
valor
comercial
de
las
enzimas
está
relacionado con su proceso de aplicación como catalizadores.
Reacciones de tipo hidrolíticas, principalmente con enzimas en
forma soluble en el medio acuoso, ha sido la forma tradicional
de utilización. Esta tecnología todavía representa una parte
importante de los procesos enzimáticos. Sin embargo, en las
últimas décadas el uso de enzimas en procesos de síntesis ha
ampliado su ámbito de aplicación a otros niveles.
Las enzimas pueden ser utilizadas como catalizadores en
reactores por lotes (batch), reactores continuos, reactores por
lotes alimentados, entre otros.
Reactor Enzimático por Lotes (Batch-BSTR) Funcionamiento es discontinuo: - el reactor se llena con el
Reactor Enzimático por Lotes (Batch-BSTR)
Funcionamiento es discontinuo:
- el reactor se llena con el medio de reacción y el
sustrato (s)
- se fijan las condiciones de funcionamiento
- se añade la enzima
- la reacción se deja a proceder hasta que la
conversión deseada se haya obtenido.
Si la enzima es utilizada en su forma soluble:
- al finalizar la reacción ésta debe ser inactivada
- luego el reactor se vacía
-el producto se somete a operaciones de separación
Si la enzima está inmovilizada:
- el derivado se mantiene en el reactor
- se somete a un lavado
Reactor Enzimático por Lotes (Batch- BSTR) V *s(x) dX v e ( , X )
Reactor Enzimático por Lotes (Batch- BSTR)
V *s(x)
dX
v e
(
,
X
)
=
=
s
0
K
+
s(x)
dt
s
(
K
+
s
(1
x
)
)
X
t
0
0
dX
=
V
dt
0
s
(1- x)
0
0
s
k
* e
0
cat
*
x
ln(1
x
)
=
◊ t
K
K
s
Mcat *as
0
*
x
ln(1
x
)
=
t
K
K * Vr
Reactor Enzimático Continuo Agitado (CSTR) Su funcionamiento es continuo un caudal constante de medio de
Reactor Enzimático Continuo Agitado (CSTR)
Su funcionamiento es continuo
un caudal constante de medio de reacción que se
alimenta al reactor
el derivado se encuentra suspendido en el interior
tanque agitado, se asume mezcla perfecta:
F, s 0
*
* * *
* * * * *
* * * *
* * * * *
* * *
*
* * * * *
*
* *
s
*
*
cualquier elemento de fluido en el reactor tiene la
misma composición incluida la salida del reactor
todas las partículas de enzima están en contacto con la
misma concentración de sustrato (distinto a CPBR)
la fracción ε puede ser tan alta como 90-95%,
la fracción del volumen ocupado por el derivado
generalmente no es superior al 10%
* * *
*
* * * * *
* *
* *
*
* * * * * * * * * * * * * * * * * *
*
F, s
Reactor Enzimático Continuo Agitado (CSTR) F, s 0 F ◊◊◊◊ s - F ◊◊◊◊ s
Reactor Enzimático Continuo Agitado (CSTR)
F, s 0
F
◊◊◊◊ s
- F
◊◊◊◊ s
====
v
◊◊◊◊ V
◊◊◊ ◊
ingreso
salida
R
*
*
* *
* * * * *
*
* * *
* * * * *
F
s
- F
s
(1- X)
=
v
V
*
* * *
* * * * *
0
0
R
s
* * *
*
*
*
* * *
* * * * *
*
*
*
*
X
*
*
=
V R
*
* * * * * * * * * * * * * * * * * *
=
v e
(
,
X
)
s
F, s
0
F
s
x
k
e
M
*a
0
cat
s
*x
+
=
=
K
(1
x
)
K
F
K
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR) F, s 0 Su funcionamiento es continuo El
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR)
F, s 0
Su funcionamiento es continuo
El reactor se alimenta con un caudal constante de
medio de reacción
El derivado se encuentra en el interior formando un
lecho sumergido
Se puede alimentar desde el fondo o desde el tope
A escala de laboratorio es preferida la alimentación
desde el fondo, ya que es más fácil mantener el nivel de
líquido por encima de la cama de derivado y también
evita la compactación del lecho.
A gran escala la alimentación por tope es mayormente
utilizada pues se reducen las necesidades de energía
para el bombeo.
F, s
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR) F, s 0 F ◊ s - F
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR)
F, s 0
F ◊ s
- F
s
=
v
V
z
z+
z
R
z
x
F
s
(1- X) - F
s (1-[X
+
X])
=
v
V
V’ R
0
0
R
z+ z
x+ x
dX
V R
*
=
=
v e
(
,
X
)
s
F
0
F, s
s
k
e
M
*
a
0
cat
s
*
x
ln(1
x
)
=
=
K
K
F
K
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR) Si no existe ningún tipo de F, s
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR)
Si
no
existe
ningún
tipo
de
F, s 0
inactivación
enzimática, el reactor llegará a un estado de
equilibrio después de tres a cinco tiempos de
residencia hidráulica (τ) .
La fracción de hueco (ε) corresponde a la
fracción del lecho ocupada por el medio de
F, s
reacción, puede ser el 40-50% del volumen de
reactor.
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR) F, s 0 Las ecuaciones que describen al
Reactor Enzimático Continuo de Lecho Empacado (CPBR)
F, s 0
Las ecuaciones que describen al reactor CPBR y al
BSTR son formalmente iguales, si se considera que
el tiempo de residencia (τ) en el reactor continuo
corresponde a la operación de tiempo (t) del reactor
discontinuo.
Ambos tipos de reactores presentan similares perfiles
de concentración de sustrato en el tiempo
El reactor CPBR puede ser considerado como un
número infinito de BSTR conectados en serie.
F, s
Comportamiento de reactores CPBR y CSTR bajo cinética de Michaelis–Menten
Comportamiento de reactores CPBR y CSTR bajo cinética de
Michaelis–Menten
Inhibición Competitiva por Producto 1.0 0.8 CPBR RLF RTA CSTR 0.6 s i / K
Inhibición Competitiva por Producto
1.0
0.8
CPBR
RLF
RTA
CSTR
0.6
s i / K = 5
K/K 1 = 0.5
0.4
0.2
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
M cat ·a e / F·K
Grado de Convesrsión, X
El desempeño del reactor CPBR es mejor que el CSTR para una cinética de M-M
El desempeño del reactor CPBR es mejor que el CSTR para
una cinética de M-M y más aún en el caso de la inhibición del
producto
De hecho CSTR opera en las peores condiciones (con un
mínimo de s y p máximo, correspondiente a las condiciones de
salida), mientras que CPBR opera en un rango que va desde
las mejores condiciones a la entrada (máximo s y cero p) a la
peor condición a la salida (mínimo s y máximo p).
Esto significa que para un X dado, se requiere una mayor
Mcat o un menor F
Aplicaciones de enzimas como biocatalizadores
Aplicaciones de enzimas como
biocatalizadores
Industria alimentaria Industria química Industria farmacéutica Industria nutracéutica Tratamiento ambiental
Industria alimentaria
Industria química
Industria farmacéutica
Industria nutracéutica
Tratamiento ambiental
Aplicaciones Industriales
Aplicaciones de Enzimas
Aplicaciones Analíticas
Biosensores, kits analíticos
Aplicaciones
Terapéutica
ENZIMAS catalizadores biológicos reacciones químicas del metabolismo celular (velocidad significativa) condiciones
ENZIMAS
catalizadores biológicos
reacciones químicas del metabolismo celular (velocidad significativa)
condiciones ambientales suaves compatibles con la viabilidad celular
catalizadores de proceso
capaces de transformar materias primas en
productos con valor agregado
condiciones artificiales
labilidad de las enzimas
DESAFIO TECNOLÓGICO
Producción comercial 1890 Christian Hansen renina aplicación industrial fuerte incremento segunda guerra mundial
Producción comercial
1890
Christian Hansen
renina
aplicación
industrial fuerte
incremento
segunda guerra
mundial
década del 60
producción de
enzimas por
fermentación con
microorganismos
década del 60
primer proceso industrial
enzimático: obtención de
jarabe de glucosa a partir
de almidón con alfa
amilasa microbiana
Década de los 90 70% del mercado mundial enzimas extraídas de plantas y órganos Actualmente
Década de los 90
70% del mercado mundial
enzimas extraídas de plantas y órganos
Actualmente
75 % del mercado
enzimas de origen microbiano
50% de las enzimas
comercializadas en la actualidad
algún tipo de modificación genética
http://www.novozymes.com/en
http://www.biocatalysts.com/
Aplicaciones de Enzimas como Catalizadores en Procesos Industriales aditivo para modificar alguna propiedad funcional
Aplicaciones de Enzimas como Catalizadores en Procesos Industriales
aditivo para modificar
alguna propiedad
funcional de un
producto
catalizador para fabricar un
producto derivado de cierta
materia prima
las condiciones en que actúa la
enzima no están controladas o al
menos no están especificadas
para optimizar su actividad
catalítica
las condiciones de
proceso están
establecidas de modo
de maximizar la
actividad catalítica de
la enzima
uso de proteasas fúngicas en
panificación
uso de amilasa y
glucoamilasa en la
producción de jarabes de
glucosa a partir de almidón de
papa o maíz
ENZIMA Amilasas Proteasas Lipasas Esterasas Celulasas Glucanasa Xilanasas Gluc isomerasas Pectinasas Lactasas
ENZIMA
Amilasas
Proteasas
Lipasas
Esterasas
Celulasas
Glucanasa
Xilanasas
Gluc isomerasas
Pectinasas
Lactasas
Acilasas
Fitasas
Invertasa
Aminoacilas
Gluc oxidadasas
Catalasas
Oxidorreductasas
Luciferasa
Panificación
Aliment humana / animal
Vitivinícola
Cervecera y jugos
Láctea
Farmacéutica
Química fina
Detergentes
Textil
Pulpaje
Sist de detección / electrodos
Trat medio ambiental
PROCESO DE PRODUCCIÓN DE JARABES DE ALTO CONTENIDO DE FRUCTOSA A PARTIR DE ALMIDÓN
PROCESO DE PRODUCCIÓN DE JARABES DE
ALTO CONTENIDO DE FRUCTOSA A PARTIR DE
ALMIDÓN
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Licuación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Licuación
Sacarificación
Isomerización
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Licuación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Licuación
dos tipos de α amilasa utilizada:
amilasa de Bacillus amyloliquefaciens
amilasa de Bacillus licheniformis
Espectro de productos:
α
amilasa
con
de
B.
licheniformis
maltosa
maltotriosa
maltopentosa
con
α
amilasa
de
B.
amyloliquefaciens
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Licuación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Licuación
►Ambas enzimas requieren del ion Ca++
para su actividad y estabilidad
►El requerimiento de la amilasa de B.
licheniformis es sustancialmente menor.
►Las α amilasas actúan sobre el almidón gelatinizado (temp 75 a 90°C)
►enzimas termoestables a las condiciones del proceso
► La amilasa de B. licheniformis (más termorresistente) tiene una
temperatura óptima de 90°C
► La amilasa de B. amyloliquefaciens tiene una T óptima de 70°C
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Licuación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Licuación
►Sistema de reacción actualmente utilizado:
Reactor Tubular Continuo (jet cooker)
► Se inyecta vapor a 100 - 110 °C.
►Se utiliza la amilasa de Bacillus licheniformis
frecuentemente
se adiciona
enzima fresca
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Licuación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Licuación
►Los requerimientos de enzima no son muy
elevados y el costo de la amilasa es bajo
por lo que no incide fuertemente en el
costo global del proceso.
►El uso de amilasa inmovilizada es dificultoso dadas las
características del sustrato, lo que ocasiona severas restricciones
difusionales y problemas hidrodinámicos al sistema.
►Previo a la segunda etapa de proceso, el almidón parcialmente
hidrolizado (dextrina) se enfría y el pH de la solución se ajusta a un
valor de 4,5.
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Sacarificación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Sacarificación ►Se lleva a cabo mediante la enzima
glucoamilasa (amiloglucosidasa).
►Enzimas obtenidas de Aspergillus
niger y Rhizopus sp.
►Objetivo de la etapa: transformar la dextrina en glucosa
►La enzima actúa hidrolizando en forma exo los enlaces a 1-4 de la
dextrina, liberando una molécula de glucosa
►Operación convencional en un reactor por lotes tipo tanque agitado
►Las condiciones de operación
pH:
4 a 4.5
Temperatura: 50 - 55 °C
Tiempos de reacción: entre 48 y 60 horas
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Sacarificación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Sacarificación
►El preparado enzimático debe estar libre
de transglucosilasa
(purificación de la enzima cruda / obtención
de cepas transglucosilasa negativas)
►glucoamilasa presenta baja actividad sobre enlaces a 1-6 de dextrina
ramificada
►requiere de altas cargas enzimáticas o tiempos prolongados de
incubación para lograr el grado de hidrólisis requerido.
►uso de la enzima pululanasa (enlaces α 1-6), acción a pH más alto, no
óptimo para la acción de la glucoamilasa.
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Sacarificación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Sacarificación
DE (dextrosa equivalente)
grado de conversión de almidón en
D- glucosa (dextrosa)
►Sistema continuo con glucoamilasa inmovilizada no ha logrado obtener
los elevados grados de DE (97 a 98) deseables y obtenidos en el
proceso convencional por lotes.
►Tate & Lyle (www.tateandlyle.com) ha puesto en operación un proceso
comercial con glucoamilasa inmovilizada en un gel de su propia proteína
precipitada y entrecruzada con glutaraldehido.
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Sacarificación
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Sacarificación
► El jarabe de glucosa se concentra
hasta aproximadamente 60° Brix
►Luego se lleva a una etapa de decoloración y desalación
►El pH se ajusta a los requerimientos de la tercera etapa.
►El jarabe de glucosa tiene como tal un importante mercado en la
industria alimentaria.
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Isomerización
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Isomerización
►La tercera etapa:
isomerización enzimática del
jarabe de glucosa a fructosa
Se lleva a cabo mediante la enzima glucosa isomerasa (xilosa isomerasa)
►El poder edulcorante de la fructosa es de 1.2 y 1.6 veces el de la
sacarosa
►El poder edulcorante de la glucosa es de 0.6 a 0.7 veces el de la
sacarosa.
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Isomerización
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Isomerización
► Aplicación industrial de la
tecnología de inmovilización
enzimática.
►Proceso de relevancia comercial a partir de 1974
►glucosa isomerasa inmovilizada en DEAE-celulosa
►Operación en modalidad por lotes
►Actualmente todos los procesos desarrollados son continuos con
enzima inmovilizada: amplia gama de catalizadores disponibles
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón CATALIZADORES
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
CATALIZADORES COMERCIALES DE GLUCOSA ISOMERASA
Fabricante
Sistemas de Inmovilización
NOVO
Células de Bacillus coagularía entrecruzada con glutaraldehido
ICI
Células de Arthorobacter sp. floculadas y fijadas térmicamente
Gist-Brocades
Células de Actinoplanes missouriensis atrapadas en gelatina y
entrecruzada con glutaraldehido
Clinton Corn
Enzima de Streptomycés sp. adsorbida en resinas de intercambio
iónico
Miles
Células de Flavobacterium sp, entrecruzadas y fijadas térmicamente
CPC
Enzima de Streptomycés sp. en soportes cerámicos
Reynolds Tobaco
Células de .Art/irobacfersp. fijadas térmicamente.
Baxter Labs
Enzima de Streptomycés sp. en resinas de intercambio iónico
Sanmatsu
Enzima adsorbida en resinas de intercambio iónico
Snam Progetti
Células atrapadas en fibras de acetato de celulosa
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Isomerización
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Isomerización
►Primeros catalizadores
comerciales fabricados con
enzimas extraídas de
Streptomyces sp.
►Reactores continuos, de preferencia de lecho fijo
►Condiciones de operación:
Temperatura de 55 a 60°C
pH de 7.5 a 8 (acondicionamiento previo del jarabe de glucosa)
►La enzima es fuertemente inhibida por Ca++, lo que hace imprescindible
una etapa de desionización del jarabe de glucosa previo a su
isomerización
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa a partir de almidón Isomerización
Proceso de producción de jarabes de alto contenido de fructosa
a partir de almidón
Isomerización
►La reacción catalizada por glucosa
isomerasa es completamente reversible
►En equilibrio se obtiene una mezcla
equimolar de fructosa y glucosa
►El punto de operación está desplazado del equilibrio
►jarabe con 42% de fructosa que posee igual poder edulcorante que un jarabe de
igual peso de sacarosa
►utilizado como edulcorante en la industria de alimentos, principalmente bebidas
de fantasía.
►Algunas aplicaciones requieren jarabes de mayor contenido de fructosa como
los empleados en bebidas de fantasía tipo "Cola“ con 55% de fructosa
OXIDOREDUCTASAS: PRODUCCIÓN QUIRALES A PARTIR DE PROQUIRALES
OXIDOREDUCTASAS:
PRODUCCIÓN QUIRALES A PARTIR DE
PROQUIRALES
Ejemplo de aplicación : OXIDOREDUCTASAS Reacciones de oxido-reducción: transferencia de electrones Dehidrogenasas SH
Ejemplo de aplicación : OXIDOREDUCTASAS
Reacciones de oxido-reducción: transferencia de electrones
Dehidrogenasas
SH 2 + NAD + S + NADH + H +
Oxidasas
SH 2 + ½ O 2 S +H 2 O
Deaminasas
R-NH 2 NH 3 (amonificación)
Catalasas
H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2
Desafío Tecnológico OXIDOREDUCTASAS ¿Por qué usarlas? Resolución química de mezclas racémicas (L-D) 50%
Desafío Tecnológico
OXIDOREDUCTASAS
¿Por qué usarlas?
Resolución química de mezclas racémicas (L-D)
50% rendimiento
¿por qué no partir de un proquiral?
Reacciones Redox
Proquiral Quiral
Molécula orgánica que carece de centros quirales, pero tiene uno o más átomos de
carbono unidos a dos sustituyentes idénticos y a dos sustituyentes diferentes.
OXIDOREDUCTASAS Reacciones redox Cetona Proquiral Quiral R-C-R´ + NAD(P)H + H + O R-CH-R´ +
OXIDOREDUCTASAS
Reacciones redox
Cetona Proquiral
Quiral
R-C-R´ + NAD(P)H + H +
O
R-CH-R´ + NAD(P) +
XH
O
NH
Alcohol
Acido Hidrodroxílico
Aminoácido
=
=
E 1 A B CoE ox CoE red
E 1
A
B
CoE ox
CoE red
E 1 A B CoE ox CoE red D C E 2
E 1
A
B
CoE ox
CoE red
D
C
E 2
E 1 A B Cofactores CoE ox CoE red NADH 2 , NADPH 2 ,
E 1
A
B
Cofactores
CoE ox
CoE red
NADH 2 , NADPH 2 , FADH
D
C
E 2
Retención del cofactor
derivatización
E 1 A B CoE ox CoE red D C E 2
E 1
A
B
CoE ox
CoE red
D
C
E 2
E 1 A B Regeneración del cofactor CoE ox CoE red D C E 2
E 1
A
B
Regeneración del cofactor
CoE ox
CoE red
D
C
E 2
E 1 A B Regeneración del cofactor CoE ox CoE red D C E 2
E 1
A
B
Regeneración del cofactor
CoE ox
CoE red
D
C
E 2
Ejemplo Nº 1 Ejemplo de Aplicación FDH: Formate dehydrogenase, LEUDH: Leucine dehydrogenase (Wichmann and Wandrey,
Ejemplo Nº 1
Ejemplo de Aplicación
FDH: Formate dehydrogenase,
LEUDH: Leucine dehydrogenase
(Wichmann and Wandrey, 2000; Wandrey,
2004)
Desafíos Tecnológicos E 1 A B CoE ox CoE red D C E 2
Desafíos Tecnológicos
E 1
A
B
CoE ox
CoE red
D
C
E 2
Producto de reacción asociada ✔ ✔
Producto de reacción asociada
Batch sin remoción de acetona [S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester [P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester
Batch sin remoción de acetona
[S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester
[P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester
(Wandrey, 2004)
Acetona
[S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester
[P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester
[S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester [P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester [S] [P]
[S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester
[P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester
[S]
[P]
Batch con remoción de acetona [S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester [P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester
Batch con remoción de acetona
[S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester
[P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester
(Wandrey, 2004)
Acetona
[S] Acido 5-Oxohexanoico Etil Ester
[P] Acido 5-Hidroxyhexanoico Etil Ester
Desafíos Tecnológicos E 1 A B CoE ox CoE red D C E 2
Desafíos Tecnológicos
E 1
A
B
CoE ox
CoE red
D
C
E 2
Enzimas Utilizadas E 1 ≠ E 1 = E 2 E 2 • Condiciones de
Enzimas Utilizadas
E 1
E 1
=
E 2
E 2
Condiciones de Operación
Compromiso
Óptimos pH y Tº
Relación
de
eficiencias
catalíticas
de
ambas
reacciones
(rxn limitante dependencia cinética)
Enzimas Utilizadas E 1 ≠ E 2 E 1 = E 2 • Igual concentración
Enzimas Utilizadas
E 1
E 2
E 1
=
E 2
• Igual concentración de enzima para la
reacción principal y de regeneración
de cofactor
• Eficiencia catalítica dada por V m /K m
(Bastos et al., 1999) Ejemplo de Aplicación TBADH SULCATONA SULCATOL NADPH NADP TBADH SULCATONA SULCATOL
(Bastos et al., 1999)
Ejemplo de Aplicación
TBADH
SULCATONA
SULCATOL
NADPH
NADP
TBADH
SULCATONA
SULCATOL
GLUCOLACTONA
GLUCOSA
GDH
NADPH
NADP
ACETONA
PROPANOL
TBADH
TBADH
SULCATONA
SULCATOL
NADPH
NADP
Conversión
100%
6PGLUCOLACTONA
GLUCOSA 6-P
G6PDH
Conversión
84%
Perspectivas y Potencial (Wandrey, 2004) Enzimas recombinantes Reduction of methyl acetoacetate (MAA) with the
Perspectivas y Potencial
(Wandrey, 2004)
Enzimas recombinantes
Reduction of methyl acetoacetate (MAA) with the recombinant Lactobaccillus alcohol
dehydrogenase highly overexpressed in Escherichia coli (recLbADH) to (R)-Methyl-3-
hydroxybutanoate (MHB). Cofactor regeneration is achieved with the same enzyme using
isopropanol as hydrogen source.
agente antibiótico que contiene un anillo β-lactámico en su estructura molecular amplia clase de antibióticos
agente antibiótico
que contiene un
anillo β-lactámico
en su estructura
molecular
amplia clase de
antibióticos
derivados de la
penicilina,
previenen
inactivación de
los antibióticos
b-lactámicos,
uniéndose
irreversiblemente
a b-lactamasas,
enzimas
bacterianas
(resistencia
antibióticos)
manufactura de
tetrahidrofurano
(THF), resinas
de polibutilen
tereftalato
(PBT), gama-
butirolactona,
poliuretanos,
fabricación de
fibra spandex y
plásticos
precursor de ácido
g-hidroxibutírico,
GHB usos
terapéuticos en
narcolepsia,
insomnio,
neuroprotector,
droga psicotrópica
sedante: rápida
pérdida de
consciencia (droga
de violación)
solución
oftálmica
tratamiento
de la presión
intraocular
elevada en
pacientes con
hipertensión
ocular,
glaucoma
cefalosporinas
PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
PRODUCCIÓN DE BIODIESEL
Metanol Biodiesel Etanol Propanol Transesterificación Química Butanol Álcalis: NaOH, KOH, carbonatos Ácidos:
Metanol
Biodiesel
Etanol
Propanol
Transesterificación Química
Butanol
Álcalis: NaOH, KOH, carbonatos
Ácidos: sulfúrico, clorhídrico
Transesterificación Enzimática
Triacilglicerol acilhidrolasas EC
3.1.1.3 (LIPASAS)
Transesterificación Química ventajas desventajas Relativo bajo costo Alto requerimiento energético Difícil
Transesterificación Química
ventajas
desventajas
Relativo bajo costo
Alto requerimiento energético
Difícil recuperación de glicerol
El catalizador alcalino debe ser removido
Catalizadores químicos no son específicos
No debe haber agua ni ácidos grasos libres
Reacciones de saponificación
Aguas residuales alcalinas
Transesterificación Enzimática
ventajas
desventajas
No se producen reacciones de
saponificación
Se pueden utilizar ácidos grasos
libres y triglicéridos como
sustratos en un solo paso sin la
necesidad de pretratamientos
costo de los biocatalizadores
el principal problema que
evita el escalamiento
industrial
Biodiesel
Esquema del proceso productivo de biodiesel por vía química.
Esquema del proceso productivo de biodiesel por vía química.
Esquema del proceso productivo de biodiesel por vía enzimática
Esquema del proceso productivo de biodiesel por vía enzimática
Transesterificación Enzimática Esquema de la reacción Ping-Pong con efecto inhibitorio del alcohol. A = alcohol
Transesterificación Enzimática
Esquema de la reacción Ping-Pong con efecto inhibitorio del alcohol.
A
= alcohol
T
= triglicéridos
E
= enzima
W = agua
S
= ácidos grasos
G
= glicerol
P
= FAMEs
Transesterificación Enzimática v: Velocidad de reacción Expresión matemática simplificada obtenida a partir de
Transesterificación Enzimática
v: Velocidad de reacción
Expresión matemática
simplificada obtenida a
partir de este mecanismo,
considerando sólo el efecto
inhibitorio de alcohol sobre
la enzima y sin considerar
la reversibilidad de las
reacciones
Vm: Velocidad máxima de reacción
A: Concentración de alcohol
S: Concentración de ácidos grasos
KS: Constante de afinidad entre los ácidos grasos y la enzima
KA: Constante de afinidad entre el alcohol y la enzima
KIA: Constante de inhibición del alcohol sobre la enzima.
Transesterificación Enzimática
Transesterificación Enzimática
PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS ESTRUCTURADOS
PRODUCCIÓN DE
LÍPIDOS ESTRUCTURADOS
Lípidos estructurados Ácidos grasos de interés LIPASA sn1 – sn3 ESTEREOPECÍFICA medio LIPASA sn1 –
Lípidos estructurados
Ácidos grasos de interés
LIPASA
sn1 – sn3
ESTEREOPECÍFICA
medio
LIPASA
sn1 – sn3
ESTEREOPECÍFICA
acuoso
medio
Triacilglicérido
de origen natural
orgánico
Triacilglicérido
estructurado
Se eliminan por separación /
cristalización
Betapol (Loders & Croklaan, Dinamarca) Triacilglicérido estructurado cuya estereoquímica es OPO, la misma
Betapol (Loders & Croklaan, Dinamarca)
Triacilglicérido estructurado cuya estereoquímica es
OPO, la misma estructura del triacilglicérido
mayoritario en la leche humana.
Catálisis en fase heterogénea: Enzimas Inmovilizadas
Catálisis en fase heterogénea:
Enzimas Inmovilizadas
En numerosos casos, la utilización a escala industrial de enzimas en su forma soluble resulta
En numerosos casos, la utilización a escala
industrial de enzimas en su forma soluble
resulta poco rentable por el constante
consumo del catalizador, que eleva los costos
del proceso.
Debido a esto es que nace la estrategia de
inmovilización enzimática.
De forma general se entiende por inmovilización enzimática al proceso en el que la enzima
De forma general se entiende por
inmovilización enzimática al proceso en el
que la enzima se confina a una región
definida para dar lugar a formas insolubles
que retienen su actividad catalítica. Esto
permite su reutilización puesto que se logra
una mejora de su estabilidad, haciendo
posible su empleo para muchas
aplicaciones de producción industrial.
Sin embargo la inmovilización de enzimas presenta también inconvenientes que es necesario tomar en cuanta
Sin embargo la inmovilización de
enzimas presenta también
inconvenientes que es necesario tomar
en cuanta si quiere pensar en una real
aplicación industrial.
El principal factor en contra es el precio
que supone el soporte y el proceso de
inmovilización, sumado al costo de la
enzima.
Enzimas en disolución rrrr Las enzimas son solubles en medio acuoso y no pueden reutilizarse
Enzimas en disolución
rrrr Las enzimas son solubles en
medio acuoso y no pueden
reutilizarse
rrrr Estabilidad limitada
Inmovilización de enzimas
Posibilidad de reutilizar la enzima
Aumento de la estabilidad del
preparado
Inmovilización de Enzimas Ventajas ∑Estabilización conformacional de la enzima, dónde la estructura terciaria de
Inmovilización de Enzimas
Ventajas
∑Estabilización conformacional de la enzima, dónde la estructura
terciaria de la enzima adquiere mayor rigidez haciéndose más resistente
a la desactivación térmica o química.
∑Reutilización de la enzima inmovilizada lo que aumenta la
productividad por unidad de enzima con respecto al uso de enzima
soluble.
∑Permite el diseño de reactores enzimáticos de elevadas cargas de
enzima, así como también su operación en continuo.
∑Obtención de productos con mayor pureza dado que el producto se
puede separar fácilmente del biocatalizador, eliminándose la etapa
posterior de inactivación de la enzima necesaria para las enzimas
solubles.
Inmovilización de Enzimas Limitaciones ∑Alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado
Inmovilización de Enzimas
Limitaciones
∑Alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado
nativo
∑Posible pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización.
∑Costo adicional dado por el soporte y el proceso de inmovilización.
∑Restricciones difusionales dadas por el impedimento de la difusión de
los sustratos hacia el centro activo de la enzima.
InmovilizaciInmovilizacióónn InmovilizaciInmovilizacióónn EnzimasEnzimas EnzimasEnzimas UniUnióónn
InmovilizaciInmovilizacióónn
InmovilizaciInmovilizacióónn
EnzimasEnzimas
EnzimasEnzimas
UniUnióónn QuQuíímicamica
UniUnióónn QuQuíímicamica
RetenciRetencióónn FFíísicasica
RetenciRetencióónn FFíísicasica
UniUnióónn aa SoportesSoportes
UniUnióónn aa SoportesSoportes
EntrecruzamientoEntrecruzamiento
EntrecruzamientoEntrecruzamiento
InclusiInclusióónn enen
InclusiInclusióónn enen
RetenciRetencióónn porpor
RetenciRetencióónn porpor
MolecularMolecular
MolecularMolecular
MatricesMatrices
MatricesMatrices
membranasmembranas
membranasmembranas
CLEAsCLEAs
CLEAsCLEAs
CovalenteCovalente
CovalenteCovalente
NoNo--CovalenteCovalente
NoNo--CovalenteCovalente
AdsorciAdsorcióónn
AdsorciAdsorcióónn
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difieren de las de
Propiedades de las Enzimas Inmovilizadas
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas difieren
de las de las enzimas en disolución debido a efectos
del material soporte y a cambios conformacionales de
la enzima
Inmovilización
Efectos sobre la estabilidad
Efectos en las propiedades cinéticas
Efectos en la Estabilidad Estabilización conformacional de la enzima por uniones multipuntuales enzima-soporte Mayor
Efectos en la Estabilidad
Estabilización conformacional de la enzima por uniones
multipuntuales enzima-soporte
Mayor resistencia a
desactivación térmica o química
Alteración del microentorno de la enzima
Por ejemplo mayor estabilidad en medios
orgánicos sobre soportes hidrofílicos
SOPORTESOPORTE SOPORTESOPORTE SOPORTE SOPORTE AGUAAGUA AGUAAGUA AGUA AGUA ENZIMAENZIMA ENZIMAENZIMA
SOPORTESOPORTE
SOPORTESOPORTE
SOPORTE
SOPORTE
AGUAAGUA
AGUAAGUA
AGUA
AGUA
ENZIMAENZIMA
ENZIMAENZIMA
SUSTRATOSUSTRATO
SUSTRATOSUSTRATO
ENZIMA
ENZIMA
SUSTRATO
SUSTRATO
SOLVENTESOLVENTE
SOLVENTESOLVENTE
SOLVENTE
SOLVENTE
Efectos sobre las propiedades cinéticas [S] < [S] [S] superficie < [S] disolución superficie disolución
Efectos sobre las propiedades cinéticas
[S]
< [S]
[S] superficie < [S] disolución
superficie
disolución
v
[
S
]
1 1
max
v =
[S
[S ]
+
[S]
2 ]
K
2
M
[S]
[S]
[S
[S ]
1 ]
[S]
[S]
1
dis.
dis.
Los valores de K M y v max
para las enzimas
inmovilizadas son
aparentes (K’ M y v’ max )
Capa de difusión
Capa de difusión
Disolución
Disolución
0
0
Distancia a la
Distancia a la
Superficie del soporte
Superficie del soporte
K´ M suele ser mayor que K M
Restricciones difusionales externas s S 0 Ss S Restricciones difusionales internas L
Restricciones
difusionales externas
s
S 0
Ss
S
Restricciones
difusionales internas
L