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IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION DIRECTOR GENERAL: Alfonso López de la
IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION DIRECTOR GENERAL: Alfonso López de la

DIRECTOR GENERAL:

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA IX WORKSHOP MRAMA Monitorizacion por bioimpedancia en la industria alimentaria. Xavier Ferrando

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA IX WORKSHOP MRAMA Monitorizacion por bioimpedancia en la industria alimentaria. Xavier Ferrando

Monitorizacion por bioimpedancia en la industria alimentaria.

Xavier Ferrando Martínez

05

Transgénicos, Nutrigenética y Nutrigenómica en alimentación.

Daniel Ramón Vidal

08

La polymerase chain reaction (PCR).

Armand Sánchez Bonastre

10

International harmonization of microbiological methods.

Cécile Lahellec

14

La automatización total en un laboratorio de microbiología. Experiencia con técnicas rápidas en la industria alimentaria.

Hilario Zapata Bozalongo

20

Método para comprobar la limpiabilidad in situ de equipos para el procesado de los alimentos. EHEDG Documento nº2.

Mª Irene Llorca Pellicer

22

Biosensores para bacterias patógenas en seguridad alimentaria.

María Isabel Pividori

25

Detección de Vibrio Parahaemolyticus, Vibrio Cholerae y Vibrio Vulnificus por PCR a tiempo real.

Verónica Blanco Abad y Jaime Martínez Urtaza

32

Sistemas BD para identificación.

BD (Becton, Dickinson and Company)

35

Sistema de Detección microbiológica BD MicroPro.

(Becton, Dickinson and Company)

36

Validación del sistema de microbiología rápida Bactrac 4300 según ISO 16140:2003.

Gomensoro

38

Introducing the new foodproof® RoboPrep+ Series for automated DNA extraction and PCR set-up.

BIOTECON

39

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XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Proteínas de trigo

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

Proteínas de trigo en el desarrollo de productos ricos en proteína Ejemplo aplicativo en galletas.

productos ricos en proteína Ejemplo aplicativo en galletas. Virginia Millán 40 Sensado con Micro Nano Sistemas

Virginia Millán

40

Sensado con Micro Nano Sistemas en Aplicaciones Agroalimentarias:

Perspectivas nacionales y europeas.

Luis Fonseca y Carles Cané

42

Innovations in carbohydrates – being “functional” with Palatinose™ .

Antje Jungclaus

44

Sugar reduction in an intelligent way – how to improve the physiological quality of a product.

Antje Jungclaus

46

Metabolómica y Lipidómica redox aplicadas al estudio de ingredientes y alimentos funcionales.

Manuel Portero-Otin, Alberto Espinel, José Serrano, Mariona Jové, Jordi Boada, Hugo Gonzalo, Anna Cassañé, Marco Antonio Delgado y Reinald Pamplona

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Sustainable Food processing, present and future opportunities.

Friso van Assema and Peter de Jong

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4 8 Sustainable Food processing, present and future opportunities. Friso van Assema and Peter de Jong
4 8 Sustainable Food processing, present and future opportunities. Friso van Assema and Peter de Jong
4 8 Sustainable Food processing, present and future opportunities. Friso van Assema and Peter de Jong

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA IX WORKSHOP MRAMA Medida de la impedancia en un cultivo: Una herramienta preci-

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA IX WORKSHOP MRAMA Medida de la impedancia en un cultivo: Una herramienta preci-

Medida de la impedancia en un cultivo: Una herramienta preci- sa y potente como técnica en Microbiología rápida. Las técnicas basadas en lo que deno- minamos Microbiología Clásica se ba- san en la proliferación de los micro- organismos en los diferentes medios

nutritivos de cultivo. Típicamente se basan en la observa- ción directa de colonias, que han de ser visibles a simple vista, para corro- borar la presencia de un determina- do microorganismo y obtener el re- cuento del mismo en el alimento de origen. Para conseguirlo existen diferentes métodos siendo los más comunes la siembra directa en placas estánda- res de medios nutritivos con agares semisólidos (siembra directa en su- perficie, siembra por vertido en masa

y siembra espiral con dilución entre

otras). Para obtener un resultado, es decir las colonias visibles, requerire- mos de un tiempo y de una tempera- tura de incubación que haga óptimo el

crecimiento de los microorganismos que conformarán una colonia. Esta colonia suele estar formada por un to- tal de 10^8 – 10^9 células aproxima- damente y los tiempos de incubación oscilan, en los métodos más genera- les, entre las 24 y las 72 horas apro- ximadamente (con la excepción de microorganismos esporulantes donde pueden ser más largos). Además en la mayoría de ocasiones vamos a requerir de diluciones del

contenido de la muestra para llegar a observar colonias bien definidas y ais- ladas de forma que hagan posible el recuento. Esto implica que el recuen-

to estará en relación a un factor de di-

lución de la muestra conocido y que

M Monitorizacion por

bioimpedancia en la industria

alimentaria

Xavier Ferrando Martínez

Responsable Área Microbiología Clinical Nutrition, S.A. xavier.ferrando@clinicalnutrition.es

será utilizado para calcular el núme- ro total de microorganismos en el ali- mento en origen. La medida por bioimpedancia, de la misma manera que en el anterior caso, se basa también en la capacidad proli- ferativa de los microorganismos en un medio de cultivo. En esta ocasión se monitoriza la actividad metabólica en un caldo nutritivo. El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que sustentan la vida y el crecimiento microbiano asimilando los nutrientes del medio.

La actividad metabólica de los microor- ganismos comporta la transformación de moléculas de nutrientes complejas y a menudo con poca polaridad en me- tabolitos más simples, de menor peso molecular y mayor polaridad (ácidos or- gánicos). Estos actúan como electroli- tos en el caldo nutritivo mejor que los nutrientes (peptonas, polisacáridos). En el caldo de cultivo la presencia de estos nuevos electrolitos confieren cambios en los parámetros electroquí- micos del medio líquido tales como la conductancia, la capacitancia y la im-

micos del medio líquido tales como la conductancia, la capacitancia y la im- Fig. 1.- Representación

Fig. 1.- Representación gráfica.

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA pedancia. Concretamente este último es al cual nos referimos en relación a la

pedancia. Concretamente este último es al cual nos referimos en relación a la técnica que describimos en este ar- tículo. Se trata de medir estos cambios elec- troquímicos en un caldo de cultivo y que son monitorizados continuamente durante todo el periodo de incubación, en unas condiciones nutritivas especí- fico-selectivas para un microorganis- mo/s objeto del estudio y a una tem- peratura de incubación óptima para su crecimiento. Quiere decirse con esto que al tratarse también de un cultivo microbiano se requiere también un tiempo total de incubación para el es- tudio, aunque generalmente en la ma- yoría de protocolos no será superior a las 24-48 horas. Los cambios registrados en la impe- dancia ofrecen resultados más rápidos en la detección y recuento de los micro- organismos de estudio. Esto se debe a que los cultivos líquidos son más apropiados para las necesidades nu- tricionales y las tasas de crecimiento serán mayores. Así por ejemplo, gra- cias del sistema basado en la Impedancia de Corte (1) los resultados se obtienen cuando la población del microorganismo en cuestión se en- cuentra en una tasa de 10^6 -10^7 cé- lulas en el medio de crecimiento. Esto es unos tres órdenes de magnitud de- cimal menos de lo que es necesario para obtener una colonia visible, ya sea recuento o investigación, en una placa estándar con agar nutritivo semi- sólido. La sencillez de la técnica reside tam- bién en que los medios nutritivos utili- zados son equivalentes a los utilizados en Microbiología clásica. La especifici- dad de estos se debe, de la misma ma- nera que los medios clásicos, a sus composiciones galénicas. La sensibi- lidad en esta técnica se considera des- de una unidad formadora de colonia (u.f.c.) por muestra puesto que, si tie- ne capacidad proliferativa, su actividad metabólica aportará desde la primera célula cambios en las propiedades electroquímicas del medio.

cambios en las propiedades electroquímicas del medio. Fot. 1.- Equipos BacTrac 4300 Sy-Lab. Desarrollo de la

Fot. 1.- Equipos BacTrac 4300 Sy-Lab.

Desarrollo de la señal en un ins- trumento BacTrac 4300 de Sy- Lab: Impedancia directa del medio, Impedancia directa del electrodo, Impedancia indirec- ta y Análisis de la Impedancia de Corte El aumento de metabolitos con carga polar va a producir, en el transcurso de la incubación, una disminución de la re- sistencia (impedancia) que opone el medio líquido cuando aplicamos una corriente eléctrica. Esta puede ser me- dida por el instrumento mediante unos electrodos inmersos en el medio de los que disponen unas celdillas especiales (Fot. 2). A través de estos electrodos el equipo registra cambios en la señal eléctrica del medio. Cuando los cam- bios registrados de la impedancia son en la superficie del electrodo, inmerso en el medio, diremos que se trata de una impedancia directa del electrodo y tiene un valor E. Cuando registramos cambios de la impedancia del medio (caldo de cultivo) se trata de una im- pedancia directa de valor M. Existe otra posibilidad que hace que los cambios del valor de la impedancia, de valor M, se realicen en un segundo es- pacio líquido que es diferente al medio de crecimiento. Se basa en la utiliza- ción de un medio valorable que, por ac-

ción también del metabolismo micro- biano, se va a ver modificado en sus propiedades electroquímicas. Se trata de la Impedancia Indirecta y el valor re- gistrado es la variación de la impedan- cia M medida normalmente en una so- lución de potasa llevada a saturación. Se fundamenta en la producción de dióxido de carbono como producto final de la respiración microbiana en condi- ciones aeróbicas. El dióxido de carbo- no se disuelve en la solución de pota- sa formándose carbonato potásico,

de carbo- no se disuelve en la solución de pota- sa formándose carbonato potásico, Fot. 2.-

Fot. 2.- Celdillas impedancia.

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IX WORKSHOP MRAMA En protocolos de esterilidad, realizados mediante impedancia indirecta, si no se detecta ningún

En protocolos de esterilidad, realizados mediante impedancia indirecta, si no se detecta ningún corte durante el tiempo total de la incubación el resultado será de ausencia de microorganismos

menos conductor que el hidróxido po- tásico, cosa que provocará un aumen-

to de la impedancia M en este medio.

CO2 + 2 OH- CO3 2 - + H2O

Los resultados se representan como cambios relativos en porcentaje del va- lor de la impedancia (M y E) a lo largo de la incubación respecto a un valor

conocido inicial. En la representación gráfica estos valores definen curvas del tipo sigmoideo (Fig. 1) en la que se pueden observar tres fases que refle- jan a su vez también las tres etapas de una curva típica de crecimiento pobla- cional de un microorganismo en un cul- tivo. Estas son: una fase inicial esta- cionaria donde los microorganismos se adaptan a las nuevas condiciones nu- tritivas del medio y sintetizan toda la maquinaria metabólica necesaria pa- ra la proliferación celular, seguida de una fase exponencial (correlacionada con la fase de exponencial de creci- miento) y una fase estacionaria final sin incrementos debido al agotamien-

% de un valor definido, sea impedancia

de M o de E, si esta variación supera-

se dicho umbral se debería a un fenó-

meno de proliferación celular. Este va-

lor

umbral excluye cualquier otra cau-

sa

que lo produzca de forma inespecí-

fica. El sistema avisa al usuario que se

ha

producido un corte que se registra

en

ese preciso momento debido a un

crecimiento en fase exponencial. Dada la relación existente entre un he- cho y el otro, la variación por encima de

un umbral por un lado y el crecimiento

activo en fase exponencial por el otro,

el BacTrac 4300 registra el momento

del corte con un valor de tiempo trans- currido hasta entonces denominado T.

A cada valor en tiempo de corte le co-

rresponderá una concentración u.f.c. /

ml de caldo de cultivo. Si somos capa-

ces de calibrar el sistema, es decir, co- nocer a diferentes tiempos T de corte

la

concentración microbiana del culti-

vo

en ese momento mediante un ban-

co

de diluciones y un posterior recuen-

to

de colonias, podremos correlacionar

regresivamente y de forma automática

to

de los recursos nutritivos, acumula-

el

recuento por impedancia. El softwa-

ción de metabolitos tóxicos y por fe-

re

de monitorización interpola ese tiem-

nómenos de exclusión in-

po

de corte detectado en el cultivo con

tra/interespecífica.

la

ecuación de regresión (gráfica % de

A

partir de que la cantidad de células

M

o E respecto tiempo de corte duran-

del cultivo de impedancia sea aproxi-

te

el cultivo) de forma que encuentre

madamente de 10^6 – 10^7 u.f.c/ml el

el

valor de la concentración de micro-

instrumento, BacTrac 4300 (Fot. 1) de Sy-Lab, será capaz de registrar una

organismos de la muestra a un tiempo inicial o To y conocer, por consiguiente,

señal de impedancia que se encontra-

el

recuento inicial en el alimento.

rá, lógicamente, en fase exponencial.

Si

por el contrario lo que nos interesa

Tomando un valor umbral de variación

no

es el recuento sino una investiga-

ción, sólo requerimos que el sistema registre que se ha generado una señal de corte a un umbral establecido de % de variación de M o de E. El siste- ma se puede configurar para avisar mediante un señal gráfico o incluso por un código de colores (rojo= corte; ver- de = no corte) que se ha detectado un crecimiento en el medio. Si este es es- pecífico y selectivo, como en un pro- tocolo de investigación Ausencia/Presencia, el sistema nos estará avisando que se ha detectado un presunto crecimiento del microorga- nismo objetivo de la investigación y nos avisará del resultado. Si no hay corte en toda la incubación el resulta- do será de ausencia para ese micro- organismo objeto del estudio. Si a todo esto consideramos que cuan- to mayor sea la concentración inicial de el/los microorganismo/s, ya sea un recuento o una investigación (preenri- quecimiento), antes se alcanzará una concentración de 10^6 – 10^7 u.f.c./ ml y el tiempo de corte será más corto. Esto propicia que para la mayoría de protocolos de recuento o de investi- gaciones tengamos resultados mucho antes de que finalice el tiempo total del protocolo de incubación dándose, co- mo encontramos en muchas ocasio- nes, cortes de presuntivos a las 4-11 horas de incubación (E. coli , S. au- reus, Salmonella) o recuentos de mi- croorganismos totales en 8-11 horas, todos ellos muy por debajo de los tiempos necesarios por métodos clási- cos. En protocolos de esterilidad, realiza- dos mediante impedancia indirecta, si no se detecta ningún corte durante el tiempo total de la incubación el resul- tado será de ausencia de microorga- nismos.

Bibliografía

1.- BacTrac 4000 Series Microbiological Operation Manual V1.05e © 2002, SY-LAB Instruments GmbH.

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA El empleo directo de la gené- tica en la agrolimentación: mejora genética de

El empleo directo de la gené- tica en la agrolimentación:

mejora genética de los ali- mentos La comunidad científica entiende por biotecnología el uso de un organis- mo vivo con un propósito industrial. Biotecnología de alimentos no es más que el uso de seres vivos en la producción de alimentos, lo que in- cluye toda la alimentación, porque todo cuanto comemos son, o han si- do, seres vivos, ya sean animales, vegetales, o alimentos o bebidas fermentadas por un microorganis- mo. Pero el consumidor, sobre todo el europeo, tiene una percepción distinta de lo que es y entiende que éste término hace referencia a la aplicación de la genética en la ali- mentación. En otras palabras, los consumidores europeos entienden por biotecnología de alimentos “po- ner genes en su sopa”. Hay que recordar a los consumido- res que la genética se ha aplicado en la alimentación desde que co- menzó la agricultura y la ganade- ría. Desde entonces el hombre ha mejorado empíricamente el genoma de las variedades vegetales comes- tibles, las razas animales y los fer- mentos. Esta mejora se ha funda- mentado en la aparición de mutan- tes espontáneos, la variabilidad na- tural, y la aplicación del cruce se- xual o hibridación. De esta forma se han obtenido variedades de trigo con espigas incapaces de disper- sar sus semillas en la naturaleza, pero capaces de generar unas ha- rinas panaderas con inmejorable aptitud tecnológica, o patatas co- mestibles al contener niveles míni- mos de alcaloides tóxicos. Desde hace treinta años los científicos aís- lan en el laboratorio fragmentos concretos que portan genes deter- minados. Esos genes se pueden va- riar en el tubo de ensayo y se pue- den reintroducir en el organismo na- tural o en uno distinto generando un transgénico. Al global de estas téc-

T ransgénicos, nutrigenética y nutrigenómica en alimentación

Daniel Ramón Vidal

Biópolis, S.L. daniel.ramon@biopolis.es

nicas las llamamos ingeniería gené- tica y cuando se aplica en el diseño de un alimento surgen los llamados alimentos transgénicos. Hoy se comercializan muchos ali- mentos transgénicos en todo el mundo, sobre todo en Estados Unidos, Australia, Canadá y China. Los más conocidos son la soja re- sistente al herbicida glifosato y el maíz Bt aunque existen muchos más. Son de gran importancia los que hacen referencia a la mejora nutricional de los alimentos. Desde algunas organizaciones ecologistas se acusa a los alimentos transgéni- cos de ser un veneno para la salud y el medioambiente. No es cierto. Desde hace más de quince años, FAO, OCDE y OMS han estableci- do grupos de trabajo para evaluar la seguridad para el consumidor de los alimentos transgénicos. Se ha lleva- do a cabo una evaluación de riesgos sanitarios de todos los alimentos transgénicos comercializados aten- diendo al contenido nutricional, la posible presencia de alérgenos y el nivel de toxicidad. Son los alimentos más evaluados de la historia de la alimentación y no disponemos de un dato científico que indique que re- presenten un riesgo para la salud del consumidor superior al que im- plica la ingestión del alimento con- vencional correspondiente. Este he- cho ha sido puesto de manifiesto por la OMS en su página de inter- net. Es interesante destacar que tras la publicación de esta decisión dichos grupos han variado su estra- tegia y apenas hablan de los riesgos sanitarios de los transgénicos pero si de los riesgos ambientales. Ahí las cosas son menos claras porque

hay una falta de metodologías para analizar este tipo de riesgos que afectan tanto a las plantas transgé- nicas como a las convencionales. Aun así debemos afirmar con con- tundencia que existen tres posibles riesgos: la transferencia de los ge- nes exógenos desde la variedad transgénica a variedades silvestres, la pérdida de biodiversidad y los efectos dañinos que ciertas plantas transgénicas resistentes a insectos pueden tener sobre poblaciones de insectos distintos de aquellos con- tra los que protegen. Todos estos riesgos ya existen con las varieda- des convencionales. Por ello, la cuestión clave es conocer si el em- pleo de transgénicos acelerará la aparición de estos riesgos. Parece que no, siempre que se mantengan y mejoren las normas de evaluación que empleamos actualmente con las plantas transgénicas. Finalmente debemos considerar los riesgos económicos. El 90% de los agricultores que utilizaron semillas transgénicas en el 2009 eran agri- cultores pobres de países en des- arrollo. Una realidad muy lejana del estereotipo que hace de lo transgé- nico un negocio en manos de pocas compañías multinacionales. Pero conviene debatir acerca de la opinión del consumidor sobre los transgénicos. En general, y desta- cando la falta de formación e infor- mación en biotecnología de nuestra sociedad, así como la constante pre- sencia de los grupos en contra en los medios de comunicación, los perci- ben como algo peligroso. Por ello re- sulta importante la divulgación de los datos reales que desde la Ciencia te- nemos de estos productos.

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA Las nuevas aplicaciones de la genética en la agroalimen- tación: nutrigenética y nutri-

Las nuevas aplicaciones de la genética en la agroalimen- tación: nutrigenética y nutri- genómica En el año 2003 se hizo pública la se- cuencia que conforma nuestro geno- ma, el genoma humano. Somos po- co más de 23.000 genes interaccio- nando con el ambiente. Pero lo que somos no depende de nuestro color

de piel, ni de nuestro credo político

o religioso; está escrito en ese alfa- beto molecular y se traduce en fun- ción de nuestro ambiente físico o

cultural. Es evidente el impacto de la genómica en nuestra vida cotidiana

y ello ha dado lugar a la aparición de

dos nuevas disciplinas científicas: la nutrigenética y la nutrigenómica. Por nutrigenética entendemos la discipli- na científica que estudia el efecto de las variaciones genéticas entre indi- viduos en la interacción dieta y en- fermedad. Por nutrigenómica aque- lla que estudia el efecto de los nu- trientes de los alimentos sobre la ex- presión de nuestros genes. Con su

empleo empezamos a entender co- mo se va a definir en el futuro una alimentación a la carta en función de

lo que podríamos llamar “pasaporte

genético”. Puede que a muchos les aterre, pero quizás no lo vean tan grave si piensan en la ventaja que para un recién nacido puede supo- ner que sus padres sean informados sobre una posible mutación en su genoma que le predisponga a des- arrollar una enfermedad cardiovas- cular si su alimentación no es ade- cuada. Es claro el enorme potencial que el conocimiento del genoma humano puede tener en las pautas de ali- mentación, pero no será menor el que tenga la secuenciación de los genomas de otros organismos vivos de interés agroalimentario. Hasta ahora se han secuenciado totalmen- te más de quinientos genomas dis- tintos y hay más de setecientos pro- yectos de secuenciación en marcha. Algunos de ellos se refieren a ani-

males, plantas o microorganismos de relevancia alimentaria, como por ejemplo el arroz, la levadura pana-

dera, la bacteria Bifidobacterium bi-

fidum (usada en muchos productos probióticos) o patógenos responsa- bles de toxiinfecciones alimentarias

como Escherichia coli. El conoci-

miento de los genes que componen

el genoma de estos organismos per-

mite conocer sus genes clave para así definir estrategias de mejora por genética clásica (la llamada mejora

asistida por marcadores) o por in-

geniería genética, desarrollar meca- nismos de defensa frente a su pato- genicidad, o descubrir nuevas fun- ciones fisiológicas con impacto nu- tricional. La secuenciación de genomas ha si- do hasta ahora una técnica costosa en tiempo y dinero. Hace apenas un año se describió una nueva técnica de secuenciación basada en el em- pleo de nanomateriales. Dicha técni- ca se denomina pirosecuenciación y permite secuenciar genomas de for- ma masiva en mucho menos tiempo

y a un menor costo. Por ejemplo, la

tecnología clásica de secuenciación aplicada en un laboratorio conven- cional tardaba en secuenciar el ge- noma de una bacteria láctica un tiempo variable entre uno y tres años. Con la tecnología de pirose- cunciación es posible hacerlo en tan sólo ocho horas y por un precio en costo de materiales diez veces me- nor al de la tecnología convencional. Sin duda la pirosecuenciación va a revolucionar la secuenciación de ge- nomas y también de los llamados metagenomas. Con este último sus- tantivo se hace referencia a la se- cuenciación de DNA extraído de un ecosistema, de forma que a partir de los datos de secuencia es posible in- ferir los organismos presentes en di- cho nicho ecológico. Su aplicación en alimentación y nutrición es más próxima de lo que muchos imaginan.

Por ejemplo, recientemente se han llevado a cabo proyectos de secuen-

ciación masiva en voluntarios huma- nos, determinándose que más de trece mil cepas bacterianas distintas pueblan nuestro tracto digestivo. También mediante el empleo de me- tagenómica se han detectado dife- rencias en la composición de la flo- ra microbiana del tracto digestivo de individuos obesos. Son los primeros resultados de una tecnología poten- te que permitirá conocer aspectos nuevos de nuestra fisiología y su re- lación con la alimentación. Podemos concluir por todo lo ex- puesto que el futuro de la genética en la alimentación es importante. La época en que los tecnólogos de ali- mentos eran expertos en el manejo de las tuberías de las instalaciones industriales ha quedado lejos. La nueva tecnología de alimentos pre- cisa de nuevos profesionales que entiendan la importancia de la bio- tecnología y la genética y también puedan discutir sobre conocimientos de otros campos del saber como la farmacología, la nutrición, el control automático de sistemas o las nano- tecnologías.

Bibliografía

1.- Fedoroff N. (2004). Mendel in the kitchen. Joseph Henry Press, Washington.

2.- Pafundo S, Agrimonti C, Maestri E, Marmiroli N. (2007). Applicability of SCAR mar- kers to food genomics: olive oil traceability. J. Agric. Food Chem. 55:6052-6059.

3.- Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER, Gordon JI.(2006). An obesity-associated gut microbiome with increa- sed capacity for energy harvest. Nature

444:1027-1031.

4.- Withee J, Dearfield KL. (2007). Genomics- based food-borne pathogen testing and diag- nostics: possibilities for the U.S. Department of Agriculture's Food Safety and Inspection Service. Environ. Mol. Mutagen. 48:363-368.

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA La reacción en cadena de la polime- rasa (conocida como PCR por sus

La reacción en cadena de la polime- rasa (conocida como PCR por sus

siglas en inglés, Polymerase Chain

Reaction) es un método de análisis de ácidos nucleicos, desarrollado por Kary Mullis a mediados de los años 80, para producir grandes can- tidades de un fragmento específico de ADN de secuencia y longitud de- finida a partir de una pequeña can- tidad de material inicial. La técnica permite amplificar selec- tivamente una molécula de ADN o ARN varios millones de veces en po- cas horas. Mediante la PCR pode- mos realizar la detección y análisis de secuencias específicas de un gen sin necesidad de aislarlo previamen- te por técnicas de clonación de ADN. Los análisis pueden realizarse a par- tir de unas pocas células o de una mínima cantidad de muestra biológi- ca sin la necesidad de aislar previa- mente grandes cantidades de ácidos nucleicos. La PCR ha revolucionado el campo del diagnóstico molecular y se ha convertido en una técnica de rutina en el ámbito de la genética, la micro- biología y la biotecnología.

Principios básicos de la PCR La PCR se fundamenta en la ampli- ficación enzimática de un fragmen- to de ADN flanqueado por dos se- cuencias de oligonucleótidos que hi- bridan en la cadena complementaria de la molécula molde que se va a amplificar (cebadores o “primers”) y que son utilizados por una ADN po- limerasa termoresistente (general- mente se emplea la de la bacteria

termófila Thermus Aquaticus, capaz

de crecer a elevadas temperaturas) para copiar la secuencia de la mis- ma. La reacción es un proceso que cons- ta de 3 etapas (repetidas unas 30-35 veces): desnaturalización, hibrida- ción de los cebadores y extensión de los mismos. Desnaturalización: Para que pueda iniciarse la reacción es preciso que

L a polymerase chain reaction (PCR)

Dr. Armand Sánchez Bonastre

Dep. de Ciencia Animal y de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Autónoma de Barcelona. armand.sanchez@uab.cat

las moléculas de ADN molde se en- cuentren en forma de cadena sim- ple. Esto se consigue calentando a temperaturas de 90 a 95ºC para que produzca la rotura de los enlaces

puente de hidrógeno intercatenarios

y la separación de ambas cadenas.

Para asegurar la completa separa- ción de la doble cadena del ADN es- ta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se des- naturaliza parcialmente éste tende- rá a renaturalizarse muy rápidamen- te dificultándose una eficiente hibri- dación de los primers y la posterior extensión de los mismos. Hibridación: Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura de la reacción hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda produ- cir la hibridación específica de los cebadores a las secuencias flan- queantes del fragmento que se de- sea amplificar. Esta etapa se deno- mina también fase de “annealing” y la temperatura a la que se realiza debe establecerse para cada reac- ción en función de la longitud de los cebadores y su secuencia (tempera- turas inferiores a la óptima nos pro-

ducirán hibridaciones inespecíficas de los cebadores y temperaturas su- periores nos dificultarán la eficiencia de la misma). Extensión: Durante esta etapa la ADN polimerasa termoresistente in- corpora nucleótidos en el extremo

3' del cebador utilizando como mol-

de la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reac- ción suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polime-

rasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para frag- mentos menores de 500 pares de bases, y 40 segundos para fragmen- tos por encima de 1.2Kb. Al finalizar cada uno de los ciclos el número de copias obtenidas se du- plica y después de 20 ciclos ya tene- mos aproximadamente 1 millón de copias de cada una de las molécu- las molde iniciales de ADN. La técnica puede usarse para la am- plificación de moléculas de ARN si previamente se realiza una copia de las mismas mediante la enzima transcriptasa reversa. De este modo podemos realizar estudios sobre moléculas de ARNm o bien la pode- mos aplicar para la detección de vi- rus ARN. La elección de los cebadores y el ta- maño del fragmento amplificado es de gran importancia para el resulta- do final. En pruebas de diagnóstico el tamaño del fragmento amplificado no debe superar los 100-150 pares de bases de ADN si partimos de muestras que puedan haber sufrido una degradación de los ácidos nu- cleicos y la elección de los cebado- res debe realizarse para fragmen- tos específicos de la diana que que- ramos amplificar para evitar falsos positivos. Una vez realizada la amplificación, se procede a la identificación de la secuencia obtenida mediante elec- troforesis, hibridación con sondas complementarias o técnicas de aná- lisis de polimorfismos. El análisis por PCR puede ser de dos tipos: cualitativo (detección de la presencia o ausencia de un frag-

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA mento de ADN determinado) o cuan- titativo (detección de la cantidad de un

mento de ADN determinado) o cuan- titativo (detección de la cantidad de un fragmento de ADN determinado).

Análisis cualitativo de ADN mediante PCR Este tipo de análisis se suele reali- zar cuando tan sólo es necesario co- nocer la presencia o ausencia de al- guna secuencia específica de ADN o ARN, como por ejemplo la detección de la presencia de un patógeno en una muestra. El análisis del produc- to amplificado suele realizarse me- diante electroforesis en gel o capi- lar y su visualización por tinción en bromuro de etidio o por detección fluorescente si previamente hemos utilizado uno de los cebadores mar- cado con algún tipo de fluorescen- cia. En algunos análisis resulta necesa- rio identificar la secuencia del pro- ducto amplificado y el producto de la PCR debe ser sometido a un análi- sis específico (secuenciación, diges- tión con enzimas de restricción etc.).

Análisis cuantitativo de ADN mediante PCR La PCR convencional no es una téc- nica cuantitativa ya que la amplifica- ción exponencial del ADN molde no se mantiene constante especialmen- te en los últimos ciclos de la reac- ción. Para poder realizar estimas cuanti- tativas se han desarrollado técnicas de PCR en “tiempo real” (PCR cuan- titativa) en las que es posible deter- minar la fase exponencial de la am- plificación y poder extrapolar de for- ma cuantitativa la cantidad de mol- de inicial que se esta amplificando. La metodología de PCR cuantitativa, facilita además la automatización y no suele requerir el procesamiento ulterior del producto amplificado lo que reduce el riesgo de contamina- ción. En la actualidad, existen en el mer- cado varios equipos y protocolos pa-

ra la realización de esta técnica. Desde el punto de vista de la detec- ción del producto amplificado en ca- da ciclo, existen tres métodos prin- cipales de análisis de PCR cuanti- tativa basados en técnicas de fluo- rescencia y que se diferencian en el tipo de detección de los productos de PCR. Estos métodos son: el que emplea una sonda con doble marca- do fluorescente (TaqMan ®) especí- fica de la secuencia amplificada, los basados en el uso de dos sondas que hibridan de forma adyacente en el fragmento que amplificamos y, por último, el que utiliza una sustancia intercalante que se une a la doble cadena de ADN denominado SYBR Green I y produce emisión de fluo- rescencia. El método más difundido, es el que emplea sondas TaqMan ® . Este mé- todo se basa en la actividad 5’-exo- nucleasa de la Taq polimerasa y en la amplificación mediante PCR de una determinada secuencia diana en presencia de una sonda fluorescen- te específica (sonda TaqMan ® ) que hibrida con la secuencia diana que estamos amplificando. La sonda TaqMan ® , de un tamaño aproxima- do de 20-30 bases, tiene unido un fluorocromo en posición 5’ y un se- gundo fluorocromo que actua por in- terferencia con el primero cómo amortiguador de fluorescencia en posición 3’. Además, esta sonda es- tá fosforilada en 3’ para evitar su ex- tensión durante la reacción de PCR. Si la secuencia diana está presente en la muestra, la sonda TaqMan hi- bridará específicamente con ella, si- tuándose entre los dos cebadores. Cuando se produce la etapa de ex- tensión en la reacción de PCR, la actividad 5’-exonucleasa de la Taq polimerasa degrada a la sonda TaqMan liberando el fluorocromo, que al quedar separado del amorti- guador emitirá una señal que puede ser captada por el sistema óptico del equipo. Este proceso de degrada- ción de la sonda tiene lugar en ca-

da uno de los ciclos y es directamen- te proporcional al número de molé- culas que están siendo extendidas en cada uno de ellos que podemos visualizar por el incremento de la se- ñal de fluorescencia. Además, la Taq polimerasa no digie- re la sonda libre sino únicamente la hibridada, por lo que la cantidad de señal fluorescente emitida es pro- porcional a la cantidad de producto acumulado. La medición de la inten- sidad de fluorescencia se realiza de forma continúa lo que nos proporcio- na una información dinámica en tiempo real del proceso. El sistema de detección permite establecer el

ciclo umbral (Ct-cycle threshold), ci-

clo de la PCR a partir del cual la can- tidad de fluorescencia emitida alcan- za el nivel de detección que haya- mos fijado, lo que a su vez se co- rrelaciona directamente con la can- tidad de ADN molde de la muestra analizada. La cuantificación del nú- mero de copias de una muestra se realiza mediante la comparación de la Ct de la muestra problema con la Ct de una serie de diluciones de una muestra-control positiva. La cuanti- ficación de la muestra control posi- tiva permite establecer una curva es- tándar que refleja el número de co- pias y el número de ciclo en el que ha sido realizada la detección de for- ma objetiva y reproducible. Cuando se realiza la cuantificación de una muestra problema, el ciclo umbral de su detección se lleva a la curva estándar lo que permite cono- cer el número de copias de la se- cuencia diana existente en la mues- tra analizada. El método de PCR cuantitativa basa- do en la química por hibridación de sondas, emplea dos sondas secuen- cia-específicas que hibridan en re- giones adyacentes espaciadas entre uno y cinco nucleótidos. Una sonda está marcada con un fluorocromo emisor en posición 3’ y la otra son- da está marcada con un fluorocromo aceptor en su extremo 5’. Esta son-

11

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA da además tiene bloqueado su extre- mo 3’ con un grupo fosfato para

da además tiene bloqueado su extre- mo 3’ con un grupo fosfato para evi- tar su extensión. Sólo cuando las dos sondas han hibridado y están próxi- mas se origina una emisión de fluo- rescencia por el fluorocromo acep- tor cuya intensidad aumenta propor- cionalmente a la cantidad de secuen- cia diana formada en la reacción de PCR. Esta metodología se diferencia de la química de sondas TaqMan ® en que no se requiere la hidrólisis de sonda para la emisión de fluores- cencia. El tercer tipo de detección de los pro- ductos específicos de PCR de la se- cuencia molde consiste en la utiliza- ción del agente intercalante SYBR Green I. Esta sustancia se une espe- cíficamente a la doble hélice de las moléculas de ADN formadas en ca- da ciclo de la reacción de PCR pro- duciendo la emisión de fluorescen- cia. De esta forma, la señal fluores- cente se incrementa en función de la cantidad de producto amplificado. La ventaja de esta opción es que no se precisa la síntesis de sondas fluores- centes específicas para cada tipo de detección, aunque su inconveniente reside en su inespecificidad ya que se detecta fluorescencia para todos los productos de ADN de doble cade- na presentes en la reacción (inclu- yendo los dímeros de cebador que suelen producirse en la mayor parte de reacciones de PCR). La realización de estas técnicas de PCR en tiempo real requiere dispo- ner de un equipo que disponga de un sistema de detección de fluorescen- cia. Existen actualmente en el mer- cado distintas alternativas cuyo cos- te suele estar relacionado con los ni- veles de sensibilidad y capacidad de análisis de muestras de los mismos. Actualmente existen además plata- formas de alto rendimiento en for- ma de chip para la realización de un elevado número de reacciones de forma simultánea. Basadas en el mismo tipo de químicas que las em- pleadas en los equipos de PCR

cuantitativa convencionales estas plataformas utilizan volúmenes de reacción muy inferiores (en la esca- la de nanolitros), en forma de reac- tivos liofilizados o utilizando técnicas de microfluídica en el chip, con el consiguiente ahorro de reactivos y disminución del coste de los análi- sis. La utilización de este tipo de equipos junto al incipiente desarrollo de téc- nicas que permiten amplificar selec- tivamente los ácidos nucleicos co- rrespondientes a células viables, có- mo el uso de EMA (ethidium bromi- de monoazide) o PMA (propidium monoazide), permite pensar en una rápida expansión de protocolos ba- sados en PCR en los laboratorios de microbiología de los alimentos.

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IX WORKSHOP MRAMA

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13

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA It is my great honor and pleasure to be here today and I

It is my great honor and pleasure to be here today and I would like to thank very warmly the organizers, Josep and Marta, for inviting me to

present the introductive paper of the

IX Workshop on Rapid Methods and

Automation held in Barcelona.

I must say that the world of rapid me- thods in which I have been submer- ged a very long time ago is really a fascinating one,in terms of techni-

I nternational harmonization of microbiological methods

Cécile Lahellec

(cecile.lahellec@sfr.fr) Honorary Research Director, French Food Safety Agency

IX Workshop on Rapid Methods and

Automation in Food Microbiology Barcelona. 23 November 2010

ques but also of scientists: they are

Finally and before my conclusion, I

explain from a simple example: if we

all

so enthusiastic and eager to find

would like to focus on recent appro-

want to define the contamination of a

new ways of working in Food micro-

aches which show the willingness of

poultry carcase, examining the skin

biology in order to decrease the cost

international harmonization in Food

or the muscle is not the same thing

of

analysis while increasing the num-

microbiology.

and results will surely be very diffe-

ber of samples! However, it took a long time for those alternative me-

General considerations and

rent. Considering the methods of analysis,

thods to be officially accepted; one

definitions

harmonization is of upper importan-

of

the reasons, of course, is that the

Harmonization, in a first approach,

ce to obtain the same or, at least,

results have to be recognized by the scientific community as well by official bodies; considering the fact that ha-

relates to music, to equilibrium bet- ween different registers but it con- cerns different fields and we can find

equivalent results. In Europe, a spe- cial emphasis on those problems has been given and can be seen when

monization of traditional methods was and remains a difficult topic, it is very easy to understand that, when rapid methods did appear on the market, other problems of acceptance had to

examples of harmonization every- where. According to ISO (the International Standards Organization about which I will tell a few words very soon),

reading the paper on microbiological criteria for food published 15 December 2005 in the Official Journal of European Communities; however, everybody knows that the

be

faced: that was unavoidable

standards are “documented agree-

harmonization of methods remains

In

spite of their importance, espe-

ments containing technical specifica-

a

difficult task and we can remem-

cially for international trade, different

tions or other precise criteria to be

ber that, a few decades ago, there

aspects of harmonization of micro- biological methods are not widely known.and, even if my knowledge of

used consistently as rules, guidelines or definitions of characteristics to en- sure that materials, products, proces-

were a lot of techniques used to de- tect or enumerate the same type of microorganism and each microbiolo-

the topic is far to be perfect, I thought

ses and services are fit for their pur-

gist wanted to keep his (her) own me-

it

would be useful, as an introductive

pose”;

thod….

presentation to that IX workshop held

Concerning Food microbiology har-

in

Barcelona, to share with you a few

monisation, we all know the neces-

Entering in the field of

data and comments on that topic and

sary conditions to be filled for a com-

Harmonization of

I

propose to divide my presentation

parable evaluation of the food quality.

Microbiological Methods

into four parts:

The food samples examined have to

A

long time ago, when I began to

be representative of the food exami-

work, I was in Ploufragan (Brittany)

• In a first time, I would like to pre- sent some general considerations and definitions.

• In a second time, if you allow me to do so, I will tell you a few words concerning the reasons which led me to be involved in the field of Harmonization of Microbiological Methods.

ned, in fact, I should say “should be”, in terms of size of the samples,as it is really impossible, for practical re- asons, to analyse a sample of a suf- ficient size (with the help of statisti- cians we can only try to be close to the reality). However, we can always follow the same rules in terms of type of sample and also of methods of

where I have been working for 27 ye- ars.At that time, there was no labora- tory in the place, only a control lab, far from a few kilometers. My project was to improve the quality of poultry products, in order to help industrials to improve their techniques and in- crease the shelflife of poultry meat (which was sold as refrigerated whi-

• Then, I will describe some of the main Standardization bodies

analysis, which is very important.

le

the conditions of processing were

around the world.

Considering the type of sample, I will

not so good) and to improve the

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA Considering the methods of analysis, harmonization is of upper importance to obtain the

Considering the methods of analysis, harmonization is of upper importance to obtain the same or, at least, equivalent results

I remember the visit of a politician in our lab: I was explaining him that with

a low quantity of media, in a very

short time, we could examine far mo-

re strains than usual. He told me: in

that case, you will decrease your staff! And I answered: NO ! the sa-

hygienic quality of their products. … Different options had to be taken concerning

the miniaturized methods used to de- tect or enumerate microorganisms from poultry was the subject of his presentation: he was using micropla-

me technicians will study far more than usual, that’all ! he said: OK… As you surely know, from the idea of Dr Fung (THINK SMALL !), a lot of kits appeared on the market; you are aware of the present situation …but the following is also a very beautiful story, i.e the creation of courses sho- wing rapid methods in microbiology all around the world. I want to re- member: once, I was in K.State University and, after my presenta- tion, I met a young Spanish scien- tist, eager of knowledge and new in- formations; that was just when Food safety Agencies in Europe were being organized; he told me: I was very interested in your talk but it would have been interesting to say

more

-

The types and size of the samples.

The types of microorganisms to be studied and the methods of analy- sis. Many years later, I can’t do otherwi- se than to observe that, without any

necessity or willingness of standardi- zation; from the beginnings, we had probably felt its necessity We were also convinced of the ne- cessity of studying a high number of samples in order to avoid “precision in error”; in fact, we had no idea of the poultry contamination and we had in mind the objective to set up gene- ral laws which regulate the level of

-

tes instead of tubes and a micro-ino- culator instead of platina loops …He had a very simple principle“THINK SMALL”. As I was working on poultry meat microbiology and was very much interested by rapid and econo- mic methods in order to study a lar- ge number of strains simultaneously,

I

met Dr Fung at the end of the ses-

sion, asking for informations and re- prints; I must say it was the begin-

ning of a long story

first because he

sent me reprints and even his thesis and, from that time we became very good friends but I must say, too, that

pointed

he looked somewhat disap- Was it the reason why he

contaminations

determine critical

it

opened me new horizons, new con-

invited me different times in Barcelona to present the introductive paper to the Spanish workshop ? I don’t know but, anyway, I am very happy to be here today and I think that what we are living is a perfect example of a chain in Science

points and try to improve the micro- biological quality. Later on, we deci- ded to try determining the origin of contaminations; then to look at pa- thogenic microorganisms along the production lines (“from farm to fork”) All that work was very expensive and the necessity of using alternative me- thods became obvious from that pe- riod. In France, some scientists had similar preoccupations and we began to exchange with Prs C.Bourgeois and P.Mafart in Quimper with Pr H.Leclerc in Lille. but the most deci- sive for our future work was my par-

ticipation in a symposium which was held in Kiel(D) in 1974. I can’t forget

tacts and a willingness to communi- cate about the possibilities which we- re offered to food microbiologists:

they could use rapid method which

were, till that period, used in the me-

dical field only

for me, it was the be-

ginning of a long story in science and

However, the necessity of validating those methods in order to make them accepted became obvious very

early.and, for me, personally, it was

friendship …

Dr

Fung visited our

Institute in 1976 and, from that time, miniaturized methods were introdu- ced in our laboratory and used to identify a lot of strains to trace Salmonella, then different types of pathogenic microorganisms “from farm to fork”; we were so enthusias- tic with those methods that we pre- sented the technique as well as the results during different meetings in different laboratories: we wanted tho- se methods be adopted by the scien- tific community … and were some- what successful. Here, I would like to tell you one short story:

a

big concern. In Afnor, the question

of

rapid, alternative methods became

one branch of standardization in the

1980’s.

As I was concerned by harmoniza- tion, not only for traditional methods but also, and mainly for rapid me-

it

I

did not present anything on that

thods, I was introduced, step by step,

day; I was just learning and listening

in

that world of standardization: at

at the different papers when, sud- denly, we had a very interesting and unusual presentation: the speaker, a young American Chinese was quite “dancing”, showing beautiful slides:

the time I was in charge of the Central Food Hygiene Laboratory in Paris, I was requested to be the con- venor of working group 6 of the tech- nical committee 275 of CEN (Comité

 

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA Européen de Normalisation); at that time, I also participated in some me- etings

Européen de Normalisation); at that time, I also participated in some me- etings of Codex alimentarius (to mention those related to standardiza- tion) In 1995, that group of CEN became concerned by rapid methods. Personally, I retired from CEN in 2005 but I remain in contact and, in 2009, I had the great pleasure to join my previous colleagues for the joined meeting ISO/CEN in Valencia (Spain)

Short history and description of some international organi- zations connected with Food microbiology The first historic writings show that governments took interest in co- difications of rules set up to protect the consumer, but the first laws, con- cerning mainly the chemical purity appeared during the first part of the 19 th century. AOAC (created as the Association of Agricultural Official Chemists) was created in 1884 but is more a validation than a standar- dization body; then, at the beginning of the 20th century, one can mention the existence of IDF (International Dairy Federation), of BSI (British Standards Institute), etc… but the fruitful period appeared just after the second World War and I shall focus on them a few minutes.

ISO (International Standards Organization) As you probably know, different offi- cial bodies are concerned by stan- dardization under different aspects for different types of production and everybody knows ISO, i.e. the International Standards Organisation; this organization was created in October 1946; its seat is located in Geneva (CH); the creation results from the fusion of two orga- nizations:

ISA which was the International Federation of National Associations of Standardization, founded in New- York in 1926 and

AOAC was created in 1884 but is more a validation than a standardization body

UNSC, i.e Committee for coordina- tion of standardization of United Nations, created in 1944. The first national Assembly was held

(Switzerland, Norway and Island). CEN elaborates technical standards in favor of international trade. CEN/TC275/WG6 was created in

in 1949 in the great amphitheater in Sorbonne (Paris) ISO is composed of 247 committees. All standards are obtained by con- sensus; however, they are not man-

1993 and I was nominated as the convenor; nowadays, from July 2005, Alexandre Leclercq from Institut Pasteur in Paris, is in charge of the group.

datory

The

technical committee in

From the beginnings, one main prin-

charge of Food microbiology is TC34 / SC9; the actual president is Bertrand Lombard (F); the meetings are held in a different country each year; for example, in 2009, the mee- ting was held in Valencia (Spain); In May 2010,so quite recently, the me- eting was held in Argentina; as usual, it was a joined ISO/CEN meeting

ciple has been followed during the work of this group, i.e the Vienna Agreement; this agreement requires that, as often as possible, ISO me- thods are taken into account. In order to avoid any overlap, there is also an agreement between diffe- rent groups of CEN that only one group is in charge of a particular me- thod (the “Vienna agreement”). For

CEN,

Comité

Européen

de

example, TC302 in charge of milk

Normalisation

(in

English

and dairy products analysis may cho-

“European

Committee

for

ose one specific technique. In this

Standardization “) has been created in 1961 in order to harmonize the standards elaborated in Europe; that means that the standards are man- datory in all countries of EC (at the contrary, the standards which are elaborated by ISO are facultative, which means a great difference … All members are members of ISO as well. The seat of CEN is located in Brussels (B).In the beginnings, it was created by the national organisms for standardization from France, Germany and Benelux coun- tries.Nowadays, the full members are the 27 countries of EU and the three contries of AELE (Association Européenne de Libre Echange) which own such an organism

case, it requests TC 275/WG6 to re- fer to this specific technique in the standard method. The necessity of taking into account the experience of other groups around the world, for example AOAC and IDF (International Dairy Federation), has also been emphasized from the be- ginning and, presently, the basis for a good cooperation has been set up. In order to maintain a good interna- tional cooperation, one part of the meeting concerns the liaison with other organizations, ie: International Dairy Federation (IDF) Codex Committee on Food Hygiene, AOAC (Association of Official Analytical Chemists), WHO (World’Health Organisation), IUMS (International Union of Microbiological Societies),

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA OIE, (Office International des Epizooties) and also NMKL (coope- ration agreement between NMKL

OIE, (Office International des Epizooties) and also NMKL (coope- ration agreement between NMKL (Nordic Committee on Food Analysis) and ISO/TC34SC9)and ISO TC347 and ISO TC147/SC4 Water microbio- logy.

Codex alimentarius

Of couse, all of you have heard of Codex alimentarius: the name means

a food code and is a compilation of

standards for food, which can be ap- plied in all countries. Codex has be- en created in 1962 when the organi- zation of United Nations for Food and Agriculture (FAO) and the World’s Health organization decided it was necessary to elaborate international standards which may be used by the Food industry which was in full ex- pansion in order to protect consume-

r’s health. in fact, in the first volume,

it is said that the objectives of Codex

alimentarius are: “to guide and pro- mote the elaboration and setting up of definitions and criteria for food, in order to contribute to their harmoni- zation and facilitate international ex- changes. Codex alimentarius has a noticeable effect on quality and safety of food around the world; it has allowed, everywhere, to improve the stan- dards which are applied at different steps of the food chain and to incre- ase a lot the international exchanges. In the Codex alimentarius, there is high number of committees, i.e two groups of world committees, one on

general problems, the other on food products. There are also some regio- nal committees. Food hygienists may be experts in many of those groups; personally, I participated different times in the committee “Food Hygiene“for which USA are the leader. All committees work in strong colla- boration with scientific organizations in order to elaborate standards and recommendations. As an example, I would like to re- member some sentences of one pa- per written in the “International Journal of Food Microbiology“in

The harmonization of methods is the major task of the standardization bodies. “Stricto sensu”, International stan- dards are axclusively elaborated by ISO (the technical work of ISO is highly decentralised and carried out in technical committees, subcommit- tees and working groups as TC34/SC9 for microbiological me- hods) Different national bodies: Afnor, BSI, DIN… in Europe, ANSI in USA (AN- SI is not an active member of ISO but close relationships have been esta- blished in the Food microbiological

It always take into account the follo-

1998:

sector.

During the 21st session of Codex Alimentarius which was held in Rome, Italy in July 1995, the Commission was invited to adapt as Codex general standards, a number

As an example, I’ll say a few words about the elaboration of a ISO stan- dard:

wing principles:

of draft texts submitted at step 8 of

The consensus: all points of view

the Uniform Procedure for the Laboratory Codex Standards and re-

are considered, whichever their ori- gin.

lated texts – i.e.general standards for contaminants and toxins in foods – methods of analysis and sampling “.

At the industry scale, the solutions must aim to satisfy all concerned parties around the world.

Chemical contaminants were consi-

It

depends on the willingness of the

dered first but, when, under CEN co- llaborative studies were carried out and that precision parameters were introduced into the ISO standards, they have been transmitted to Codex Alimentarius, so creating an interna- tional consensus.

Harmonisation of microbiolo- gical methods and of procedu- res for validation

partners Three phases of elaboration can be described:

• The need of a standard is usually submitted by a sector of the in- dustry which informs a national member of that need; the national member informs ISO. When the need of a standard for a given technique, product … has been ap- proved and accepted, the following task is to define the technical sub- ject of the future standard. That phase is carried on within working groups composed of experts of

countries interested in the ques- tion.

• When an agreement concerning

the technical aspects is obtained,

a second phase begins: it is the

consensus phase

• The last part of the work concerns the formal approval of the draft of international standard (the criteria

Codex has been created in 1962 when FAO and the World’s Health organization decided it was necessary to elaborate international standards

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA are that two thirds of the ISO members who have participated in the

are that two thirds of the ISO members who have participated in the elaboration procedure must approve the draft; also 75% of the voting members must appro- ve it). Then, the draft is accep- ted as an International ISO Standard. It is also possible, pre- sently, to publish drafts at diffe- rent stages. It seems important to know that so- me standards, obtained by consen- sus had not been validated by inter- laboratory tests; but the necessity of their validation appeared obvious especially for the acceptance of al- ternative methods: as it is always necessary to compare a given me- thod with a reference one. This is the reason why, under WG6 of CEN/TC275 and quite a short time after the creation of the working group, a proposal for a project en- titled “Evaluation of microbiological methods for detection and/or enu- meration of microbiological conta- minants in foods “was presented and then accepted as an EU project (SMT4/CT96-2098). The trials we- re carried on from 1996 to 2000; the results for all types of contaminants studied have been accepted by the equivalent group of ISO and publis- hed in the “International Journal of Food Microbiology“and later on, adapted as Codex standards. They have become Reference methods, which was essential for the deve- lopment of alternative methods … From that time, we had reference

methods for Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostidium perfringens, Listeria monocytoge- nes enumeration, for Salmonella and Listeria monocytogenes detec-

tion. The results obtained would make possible the comparison of al- ternative methods with the referen- ce ones and, hopefully, their vali- dation. The results obtained during that SMT Project were published in the International Journal of Food Microbiology.

At that time also, a close coope- ration began between CEN/ISO and AOAC and I’ll will always re- member one day in The Hague (NL) when we discussed around a table about the possible organiza- tion of common experiments con- cerning European and US labora- tories (that was a big concern as it was a European Project !) Finally some trials were organized by European and US laboratories in or- der to compare the ISO method for the detection of Salmonella (6579/ 2002)with the AOAC method. Finally, ISO 6579:2002 was recom- mended to be adopted as official First Action for the analysis of fresh cheese, fresh chilled and frozen poultry and dried egg product.I shall go back on that point in a few minu- tes. For the first time, one could re- ad “Hands touch over the sea “ Another point has to be added. How to introduce new technologies in that world of traditional methods?; that was also the subject of many dis- cussions. Finally, An important resolution was taken during the joined meeting of ISO/TC34/SC9 and CEN/TC275/WG6 held in Parma (It) in April 2004.

Each time a standard method is being revised, the possibility of using new technologies, including PCR, must be examined by comparing re- sults with those obtained when using the official conventional method”. For a given microorganism, in order

to complete the existing method, the development of standardised me- thods based on new technologies can be proposed when the purpose to be obtained (for example pathoge- nicity level) makes it necessary. When new technologies, including PCR, are used as alternative me- thods, they must be validated against the reference method.

Those sentences look probably as quite simple,but I am sure you cannot imagine the number of hours of discussions which were necessary to obtain a consensus:

that is “international cooperation

But the hours of discussions were

very fruitful

were accepted according to the EC regulation 2073 15 December 2005 concerning microbiological criteria:

“Test results are dependent on the analytical method used and, there- fore, a given reference method should be associated with each mi- crobiological criterion. However, Food business operators have the possibility to use analytical methods other than the reference method, in particular more rapid methods, as long as the use of these alternative methods provide equivalent results “

finally, rapid methods

as,

So, alternative methods were fi- nally, officially accepted in the EC

Recent approaches in the har- monization of Food microbio- logical methods

Finally, ISO 6579:2002 was recommended to be adopted as official First Action for the analysis of fresh cheese, fresh chilled and frozen poultry and dried egg product

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA But, of course, difficulties we- How to validate alternative methods was the first

But, of course, difficulties we-

How to validate

alternative methods was the first question.

As we have said, a lot of alternative methods can be found on the mar- ket and the present workshop is de- voted to those methods, but two main systems of validation do exist:

- The AOAC Validation process.

- The standard EN/ISO 16140.

They both are composed of two pha- ses:

• A method comparison (Pre-colla- borative study).

• An Interlaboratory Collaborative Study. Of course there are some differences between the two systems concerning especially the number of matrices (6 for AOAC, 1 for ISO/16140); the re- ference methods are also different (USDA, FDA, AOAC for AOAC, ISO for EN/ISO/16140) but the principles are similar, of course.Significant ef- forts have been realized for a mutual recognition.

I would also like to add a few words about recent advances concerning MicroVal.

- MicroVal is an “Eurekat“project (the Eureka programme was set upon 1985 to stimulate cross- border technological cooperation and ad- vancement throughout Europe). it started in 1993 with the aim of set- ting up European validation proce- dure in four years time and further- more of creating such conditions that the results of the procedure would be accepted as far as pos- sible by all interested parties in Europe Standardization and certi- fication play important roles in this respect. MicroVal started as a Dutch-French initiative. The project was ended by 21 full partners from 7 countries. Let’s me say a few words about the three working groups which were set up:

- Working group 1 studied informa- tion on the validation used or pro-

re not over

posed by AFNOR (Association Française de Normalisation), The AOAC Research Institute, the European Community (EC), the International Dairy Federation

(IDF) and the International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC). The final report of the first working group was pre- sented at the First Annual Meeting in Paris, 1994.

- Working group 2 drew up the ge- neral rules for the organization of the validation procedure and the Validation Certification Scheme. -The third group started in parallel with the second and focused on drawing up the technical rules for validation, the test protocol and the organization of the trial valida- tions in the second stage of the project.

- The fourth working group looked after the financial aspects of the project. The General Rules describe the me- thods and the organization to be used for the European certification of alternative methods for the food and drink industry by an independent or- ganization: MicroVal certification. In the spring 1996, the MicroVal ste- ering committee started the procedu- re for European Standardization by forwarding to the European Standardization Committee (CEN), a proposal for a European Standard based on criteria developed by MicroVal for the validation of alterna- tive microbiolgical methods. This proposal was accepted in June 1996 by CEN /TC 275/WG6 as a new work item for a European Standard “Protocol for the validation of alter- native microbiological me- thods“based on the two MicroVal do- cuments “General“and “Technical“rules for Validation crite-

That was the beginning of

ria

MicroVal One really important event is the ac-

ceptance of the results of combined validations Microval / AOAC, last

November during the 2nd MicroVal Symposium which was held in the Hague (NL). What does it mean ? It means that (cf Michele Smoot):

AOAC and MicroVal joined forces to combine a MicroVal (basis EN/ISO/16140) certificate with AOAC Validation (Official Methods of Analysis and/or Performance Tested Methods) Both organizations seek to fulfill their own requirements with respect to the procedures, rules, fees, etc, while de- signing a protocol that fits both AOAC and MicroVal requirements Those two examples I just mentioned seem to me to be very promising ….

What to say as a conclusion ?

Everybody knows that harmonization of Food microbiological methods will surely take a very long time even if one knows that “a broad acceptance of mi- crobiological methods and associated results would facilitate knowledge ex- change and would speed up the imple- mentation of new methods / technolo- gies across appropriate food matrices “(Michele Smoot, IAAP Europe) However, I think we can be somewhat optimistic: even if a recent observer could think that the progress is very low, alternative methods seem to be now fully accepted quite everywhere; some good reference methods do exist, even if the work is not complete …, some approaches to harmonize the systems of validation do exist and even combined validations have be- en set up ! And all that international Harmonization of Microbiological Methods will take a growing importan- ce with the extension of Food Microbiolgy to the primary produc-

may hope that, in the future,

tion

the situation will improve day by day …May we be allowed to consider International Harmonization of Microbiological Methods as a wonder- ful school to find the way of consen- sus in different situations of human li- ves ?

We

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA En la sociedad actual el término se- guridad alimentaria supone un com- promiso

En la sociedad actual el término se- guridad alimentaria supone un com- promiso muy serio de los producto- res con la sociedad, o mejor, de las empresas elaboradoras o manipu- ladoras de alimentos con los consu- midores finales de éstos. Las exi- gencias del mercado son cada día mayores, se demandan productos seguros y competitivos, este hecho condiciona la forma de actuar de to- da la cadena alimentaria, principal- mente de la industria transformado- ra, que se ve obligada a buscar téc- nicas de análisis rápidas que le per- mitan poner en el mercado los pro- ductos en el menor tiempo posible y con todas las garantías sanitarias. Mahn Mac no es una excepción, nuestra principal actividad es la fa- bricación de ensaladas refrigeradas, un producto de difícil definición, ya que no encaja en los denominados de cuarta gama, ni en los de quinta gama. Se trata de una comida pre- parada terminada o lista para comer, envasada y conservada sin trata- miento térmico. Esta definición nos permite incluir a nuestros productos dentro del grupo A según describe el Real Decreto 3484/2000 sobre comi- das preparadas. La característica de nuestro produc- to es su corta vida, fijada en 90 dí- as desde su fabricación; esto nos obliga a fabricar prácticamente so- bre pedido, no es posible mantener un stock ya que supondría consumir días de su vida útil en nuestros al- macenes perdiéndolos de los linea- les del cliente. Para asegurar la calidad sanitaria de nuestros productos durante toda si vida útil aplicamos una combinación de efectos barrera, es decir, aplica- mos barreras químicas y físicas a los microorganismos de forma que sola- mente puedan sobrevivir el menor número de microorganismos bana- les, y ningún patógeno. Para garan- tizar que esto se cumple aplicamos un protocolo de análisis microbioló- gicos en todas las etapas del pro-

L a automatización total en un laboratorio de microbiología.

Experiencia con tecnicas rápidas en la industria alimentaria

Hilario Zapata Bozalongo

Director Técnico Mahn Mac Delicatessen, S. L. hilario@mahnmac.com

ceso donde se incluyen microorga- nismos indicadores de higiene y al- gunos patógenos. Los microorganis- mos analizados son: microorganis- mos aerobios mesófilos, mohos y le- vaduras, enterobacterias, E. coli (co- liformes), Staphylococcus aureus, Salmonella y Listeria monocytoge- nes. Todos ellos incluidos en el Real Decreto 3484/2000 sobre comidas preparadas. Actualmente seguimos empleando esta batería de microor- ganismos a pesar de la nueva direc- tiva comunitaria. La evolución del número de análisis microbiológicos en los últimos ocho años ha sido muy importante, pasa- mos de 4 análisis por día a los 40 actuales. Esto supuso dos cosas: un mayor gasto en analítica y una ma- yor necesidad de recursos, tanto técnicos como humanos, para ges- tionar este volumen de trabajo. Por estas razones nos planteamos sus- tituir las técnicas tradicionales, algu- nas con más de 100 años de anti- güedad, por métodos alternativos más rápidos. Los métodos conven-

cionales tienen la ventaja de su sen- sibilidad, su fácil interpretación y el bajo coste en equipamiento; por el contrario necesitan mucho tiempo para la obtención de datos, son muy laboriosos y requieren un tamaño de muestra considerable. Cuando nos planteamos automatizar el labora- torio de microbiología, nos pusimos unas exigencias mínimas que debe- rían cumplir los nuevos métodos al- ternativos, deberían tener precisión y resolución, deberían ser fáciles de usar por los analistas, deberían ge- nerar datos de forma rápida, debe- rían tener aceptabilidad y validación internacional, su coste analítico de- bería ser razonable, debería tener un soporte técnico por parte del pro- veedor y no debería quedarse ob- soleto con el tiempo. Esto es, nues- tras necesidades se resumían en la búsqueda de un método fiable, efi- caz y de costes equilibrados. Todos las técnicas rápidas estudia- das presentaban las mismas venta- jas: permitían una reducción de ma- teriales y de tiempo, lo que se tradu-

La evolución del número de análisis microbiológicos en los últimos ocho años ha sido muy importante, pasamos de 4 análisis por día a los 40 actuales

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA cía en la posibilidad de realizar un número mayor de análisis con el
IX WORKSHOP MRAMA cía en la posibilidad de realizar un número mayor de análisis con el

cía en la posibilidad de realizar un número mayor de análisis con el mismo personal y en el mismo tiem- po; pero como desventaja se obser- vó que algunas determinaciones no reducían considerablemente el tiempo de ensayo y que el coste de alguno de estos análisis no solo no era menor, sino que era muy supe- rior, y además, alguna técnica pre- cisaba de personal especializado. Estudiadas todas las posibilidades, nos decantamos por la opción pro- puesta por Biomerieux Industries con sus equipos Mini Vidas y Tempo, ya que con ambos se cum- plían los requisitos exigidos de rapi- dez, fiabilidad, validación internacio- nal y costes equilibrados. Tanto el equipo TEMPO para el recuento de microorganismos indicadores de ca- lidad, como con el miniVidas para la detección de patógenos, nos per- miten reducir los pasos necesarios que necesitaban las técnicas tradi- cionales empleadas hasta el mo- mento: ya no es necesario preparar el medio, ni hacer diluciones, ni ino- cular, ni leer placas y tampoco era necesario hacer el informe final. Todas estas etapas se evitaban em- pleando los protocolo de trabajo de ambos equipos. Podemos ver los ahorros de tiempo entre las técnicas convencionales y las automatizadas en los siguientes cuadros (Figura 1). Durante los primeros tres meses se realizaron ensayos por duplicado, empleando técnicas tradicionales (métodos ISO y/o oficiales) y técni- cas rápidas (Tempo y miniVidas),

para comprobar la correlación en- tre ambas, los resultados demostra- ron que ambos sistemas son fiables y eficaces, el coeficiente de correla- ción fue superior a 0,98 en todos los parámetros testados. El siguiente estudio realizado sobre las técnicas rápidas empleadas, Tempo y miniVidas, consistió en ver su relación costo-beneficio, para ello se realizaron estudios de tiem- pos y de estructura del coste por análisis. En estudio de tiempos podemos ver como la microbiología tradicional emplea para la preparación del en- sayo un 68 % del tiempo, mientras que las técnicas rápidas emplean el 80%; para la realización propiamen- te del ensayo las técnicas conven- cionales destinan un 20 % del tiem- po, y las técnicas automatizadas destinan un 12%; para la lectura, in- terpretación y emisión del informe empleamos un 12% del tiempo en las técnicas tradicionales, mientras que con las técnicas rápidas emple- amos un 8 % del tiempo. Pero es- tos datos por si solos no nos dicen nada si no los comparamos entre ellos. Las técnicas convencionales necesitan, entre un 40 y un 60 % más de tiempo total que las técnicas automáticas. Si estudiamos la estructura de los costes por ensayo, podemos com- probar que la mano de obra en las técnicas tradicionales absorbe un 65% del coste, mientras que en las rápidas solamente supone un 30%. En el caso de los materiales y re- activos empleados, las técnicas

convencionales consumen el 20% del coste, mientras las técnicas rá- pidas absorben el 52%; el concep- to de otros gastos supone en ambas técnicas un 15-18% del coste final del análisis. Estas han sido razones principales por las que Mahn Mac ha automati- zado el análisis microbiológico y ha adoptado métodos de ensayo rápi- dos. Es importante destacar alguna de las ventajas encontradas en es- tas técnicas: a) la necesidad de li- berar lotes con mayor rapidez, b) ejercer una vigilancia rápida de to- das las etapas que componen el proceso de fabricación, c) la posi- bilidad de realizar un mayor núme- ro de controles que garanticen aún más nuestros productos, y c) un ahorro de costes a medio plazo. Todas ellas contribuyen a la mayor satisfacción de nuestros clientes. Podemos concluir diciendo que la automatización de un laboratorio de microbiología, así como el empleo de técnicas rápidas nos ha contribu- ye a evitar errores humanos, hemos ahorrado mucho trabajo manual, he- mos racionalizado los recursos hu- manos, ahorrado espacio, nos ha facilitado la eliminación de residuos y a medio plazo hemos conseguido un ahorro en los costos. Además, no precisamos de personal altamente cualificado, solamente con nuestro personal bien formado y adiestrado en la ejecución de las nuevas tare- as es suficiente para garantizar la correcta realización de los análisis microbiológicos con técnicas rápi- das como Tempo y miniVidas.

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA La inocuidad alimentaria es un objeti- vo común al sector agroalimentario, y una

La inocuidad alimentaria es un objeti- vo común al sector agroalimentario, y una clara exigencia y preocupación de los consumidores. Del mismo asegu- rar la inocuidad de sus productos, es objetivo primordial para el sector far- macéutico y cosmético. Para conse- guirlo la industria debe cumplir con una seria de medidas y controles que garanticen la obtención de productos inocuos. El mantenimiento de un elevado nivel de limpieza de los equipos y de las ins- talaciones y del entorno de trabajo, afecta de forma directa sobre la inocui- dad del producto final. Para conseguir- lo no solo deben ser regularmente lim- piados y desinfectados sino que su di- seño inicial debe facilitar la realización de estas operaciones eficazmente asi como garantizar que tanto las instala- ciones como los equipos por su dise- ño no se convierten en foco de conta- minación de los alimentos. El diseño de un equipo o instalación se considera “higiénico” si incorpora, con carácter preventivo, característi- cas que reducen o eliminan el riesgo de constituir una fuente de contamina- ción para los alimentos, tanto de for- ma directa como indirecta. Por ejemplo, gracias a un adecuado diseño higiénico es posible garantizar que un equipo o instalación determi- nada no transfiere ningún cuerpo ex- traño, sustancia química, ni microor- ganismo. Para ello, en el ámbito del di- seño higiénico de equipos e instalacio- nes se consideran factores tales como los materiales de construcción, super- ficies de contacto, drenabilidad, her- meticidad, accesibilidad entre otros muchos. Errores o deficiencias en el diseño hi- giénico de instalaciones y de equipos pueden hacer fracasar o dificultar la obtención de alimentos inocuos, au- mentando y/o dificultando las tareas de mantenimiento, limpieza, desinfec- ción, control de plagas y control del proceso fundamentalmente necesa- rias para asegurar unas condiciones de producción adecuadas.

M étodo para comprobar la limpiabilidad in situ de

equipos para el procesado de los alimentos. EHEDG Documento nº2

Mª Irene Llorca Pellicer

Dpto Calidad y Medio Ambiente ainia, centro tecnológico illorca@ainia.es

Por lo tanto para conseguir equipos e instalaciones higiénicas estas deben diseñarse y construirse cumpliendo re-

quisitos higiénicos. Pero aún así en al- gunos casos por razones funcionales no es posible cumplir totalmente con estos requisitos y se hace necesario disponer de métodos o ensayos que nos permitan comprobar que aún así

el equipo o instalación es limpiable o

esterilizable , según exigencias de uso.

EHEDG

EHEDG (European Hygienic Engineering and Design Group) es un consorcio europeo de fabricantes de equipos, industrias alimentarias, insti- tutos de investigación y autoridades públicas, fundado en 1989 con el ob- jeto de promover la higiene durante el procesado y envasado de alimentos. EHEDG tiene vínculos fuertes con va- rias organizaciones internacionales y tiene entre sus planes buscar relacio- nes globales adicionales. Como la Seguridad Alimentaria no ter- mina en los límites de Europa, EHEDG promueve activamente la armoniza- ción de las diferentes guías y normas. Las organizaciones americanas NSF y 3-A, están de acuerdo en cooperar con EHEDG en el desarrollo de sus guías

y,

por su parte, EHEDG colabora en

el

desarrollo de las normas 3-A y NSF.

EHEDG proporciona asesoramiento en aspectos de ingeniería higiénica pa-

ra la elaboración de alimentos inocuos.

A continuación se indican los princi-

pales objetivos de EHEDG

• Proporcionar asesoramiento en as- pectos de ingeniería higiénica para

la elaboración de alimentos inocuos.

• Ofrecer un forum o punto de encuen- tro a los fabricantes de equipos, la industria alimentaria, usuarios y re- guladores para tratar aspectos de di- seño higiénico y fomentar la obten- ción de alimentos seguros.

• Proporcionar documentos guía so- bre las prácticas y normas esencia- les de diseño higiénico, basadas en ciencia y tecnología, y revisarlas pe- riódicamente. Estas guías ofrecen asesoramiento a fabricantes de

equipos y usuarios sobre cómo cum- plir con la legislación nacional e inter- nacional.

• Desarrollar métodos de comproba- ción que puedan ser utilizados por terceras partes para la evaluación del diseño higiénico conforme a la legis- lación.

• Asegurar que el uso del nombre y lo- go de EHEDG se controlan conve- nientemente.

• Identificar áreas donde el conoci- miento del diseño higiénico es insu- ficiente y fomentar la investigación y el desarrollo en estas áreas. EHEDG dispone de un esquema de certificación del diseño higiénico de equipos que en el caso de equipos ce- rrados cuando existan dudas o no pue- da demostrarse el cumplimiento total de los requisitos de higiene por un ex- perto autorizado se debe someter a di- cho ensayo de comprobación de la lim- piabilidad. En la actualidad existen tipos de certi- ficados de diseño higiénico de equipos

• EL Class I. equipos cerrados que se limpian con sistema CIP

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA Aspecto superficies interna del equipo tras haber finalizado el ensuciamiento. • EL Class
IX WORKSHOP MRAMA Aspecto superficies interna del equipo tras haber finalizado el ensuciamiento. • EL Class

Aspecto superficies interna del equipo tras haber finalizado el ensuciamiento.

• EL Class II. Equipos semiabiertos o cerrados que requieren limpiezas húmedas.

• EL Aseptic. Equipos cerrados que se limpian con CIP, y son esterilizables con vapor y herméticas o imperme- ables a las bacterias.

• ED. Equipos cerrados o semi abier- tos con limpieza en seco.

Método de evaluación de la lim- piabilidad En el presente apartado se describe el método de EHEDG para comprobar la limpiabilidad CIP de equipos moderada- mente pequeños descrito en el docu- mento o guía nº2 de EHEDG. Se entiende por limpiabilidad in situ, la adecuación de un equipo para ser lim- piado fácilmente sin desmontarse. La evaluación de la limpiabilidad in situ se realiza por comparación con la limpia- bilidad de una tubería referencia. El mé- todo consiste en someter el equipo a evaluar y la tubería de referencia al mis- mo proceso de ensuciamiento y de lim- pieza CIP (Clean In Place). El procedimiento de ensayo está dise- ñado para indicar las zonas con un di- seño higiénico deficiente en los equipos y está basado en una comparación, de la limpiabilidad de un elemento someti- do a ensayo con la de un trozo de tu- bería recto, o tubo de referencia. El gra- do de limpieza se basa en la eliminación de una solución ensuciadora que con- tiene bacterias y se valora evaluando el crecimiento de las bacterias que que- dan después de la limpieza. El ensayo está pensado, por lo tanto, como ensayo básico de comprobación

del diseño de equipos higiénicos y no es indicativo del comportamiento en si- tuaciones de limpieza industrial.

Método de ensayo El equipo o elemento que se va a en- sayar con objeto de comprobar su lim- piabilidad y por tanto su diseño higié- nico, junto con la tubería de referen- cia se someten a un proceso de ensu- ciamiento y posteriormente a su limpie- za. Para su ensuciamiento se utiliza leche agria inoculada con GeoBacillus stea- rothermophilus ya que es de creci- miento rápido, tiene esporas que son resistentes a la solución detergente que se usa en el procedimiento de en- sayo y produce reacciones de color bien definidas en el medio de creci- miento utilizado El agar utilizado es MSHA Shapton y Hindes modificado, que con la presen- cia del Geobacillus provoca un cambio en el pH y el agar vira de color mora- do a color amarillo siendo muy fácil su detección. El equipo a ensayar, se llena con la so- lución ensuciadora y se presuriza 3 ve- ces a 5 bares durante 2 minutos. A

continuación se vacía y se seca con aire seco filtrado. La sección de ensayo ensuciada se monta en un banco de pruebas CIP:

a. Aclarar con agua fría (10-20ºC) durante un tiempo igual al tiem- po medio de residencia (t) y no inferior a 1 minuto.

b. Hacer circular una solución deter- gente al 1,0% (p/v) a 63ºC 2ºC durante 10 minutos (el volumen de solución detergente usado de- be ser al menos 20 veces el vo- lumen interior del elemento so- metido a ensayo).

c. Aclarar con agua fría (10-20ºC)

durante un tiempo igual al tiem- po medio de residencia (t) y no inferior a 1 minuto. Tras el proceso de limpieza se reti- ra el equipo y la tubería de referen- cia del banco de pruebas y se pro- cede a la evaluación de su limpiabi-

lidad para ello se procede a rellara tanto el equipo como la tubería con agar MSHA Después de que el agar se haya solidificado completamente, se coloca casi vertical en una estu- fa de cultivo a 58ºC durante 16-24

horas.

completamente, se coloca casi vertical en una estu- fa de cultivo a 58ºC durante 16-24 horas.

Banco de pruebas CIP

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA Banco de pruebas CIP: conexión sección de ensayo Evaluación de resultados Después de
IX WORKSHOP MRAMA Banco de pruebas CIP: conexión sección de ensayo Evaluación de resultados Después de

Banco de pruebas CIP: conexión sección de ensayo

Evaluación de resultados Después de la incubación, el equipo de ensayo y del tubo de referencia se exa- minan para buscar la presencia de zo- nas de coloración amarilla en el MSHA

púrpura. El tubo de referencia se abre y se ex- trae el agar solidificado para ello con una herramienta epecial, se extrae el núcleo central del agar. Luego se abre

el tubo de agar que se ha formado con-

virtiéndolo en una lámina plana y se coloca sobre una cuadrícula de re- cuento transparente. Por lo general, y asumiendo que exis- te una pequeña cantidad de color amarillo en el tubo de referencia, son

posibles tres resultados para el equipo

o elemento sometido a ensayo:

a. Presencia de zonas y/o colonias amarillas: se debe repetir el proce- dimiento de ensayo hasta un máxi- mo de cinco veces. La presencia de suciedad retenida en la misma

zona del elemento sometido a en- sayo en tres ocasiones distintas es indicativa de zonas que son de di- fícil limpieza y, por consiguiente, zonas en las que se deben consi- derar mejoras en el diseño higiéni- co.

La limpiabilidad del elemento so- metido a ensayo se compara con la del tubo de referencia evaluan- do las superficies porcentuales correspondientes de zonas ama- rillas:

• Si la superficie porcentual de

zonas amarillas en el elemento sometido a ensayo es similar a la del tubo de referencia, el grado de limpiabilidad es, por consiguiente, similar.

• Si la superficie porcentual de

zonas amarillas en el elemento sometido a ensayo es inferior o superior a la del tubo de referen- cia, el elemento sometido a en- sayo es, respectivamente, más o menos fácil de limpiar. En el ca- so de que sea igual o más limpia- ble que la tubería de referencia, el equipo sometido a ensayo es ap- to para certificar su diseño hi- giénico b. Sin zonas / colonias amarillas: Si estas condiciones se dan en tres ocasiones sucesivas, no es nece-

sario repetir más el ensayo y el elemento sometido a ensayo se puede describir como especial- mente fácil de limpiar o limpiable.

En ocasiones algunos materiales em- pleados en juntas de estanquidad pue- den tener propiedades antibacterianas que impidan que las esporas presen- tes en su superficie germinen y/o crez- can. Así, zonas con diseño higiénico deficiente pueden no aparecer como zonas amarillas, lo que da lugar a re- sultados falsamente negativos. Para conocerlo, se deben comprobar las propiedades antibacterianas de to- das las juntas tóricas y juntas de es- tanquidad, para ello se inocula con es- poras un volumen adecuado de MSHA (aproximadamente 102 ml-1 de agar) A continuación se colocan las juntas de estanquidad / juntas tóricas estériles en placas petri adecuadas, se cubren con el MSHA fundido y se incuban a 58ºC durante 16-24 horas. Si las jun- tas de estanquidad / juntas tóricas tie- nen propiedades antibacterianas, se ve una zona púrpura a su alrededor.

Centros autorizados por EHEDG para la realización del Test de limpiablidad En la actualidad EHEDG dispone de

un total de 6 centros autorizados pa- ra la realización de las pruebas de limpiabilidad y para la emisión de in- formes favorables necesarios para la certificación del diseño higiénico de equipos:

Alemania : Universidad de Munich Dinamarca: DTI España: ainia Holanda: TNO Reino Unido: Campden BRI. USA: Universidad de Purdue

Universidad de Munich Dinamarca: DTI España: ainia Holanda: TNO Reino Unido: Campden BRI. USA: Universidad de

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IX WORKSHOP MRAMA Las agencias reguladoras de la Unión Europea reconocen la necesidad de desarrollo e

Las agencias reguladoras de la Unión Europea reconocen la necesidad de desarrollo e implementación de siste- mas de control dirigidos al incremen- to de la seguridad y la calidad de los alimentos y a la mejora de los siste- mas de trazabilidad, definidos por su capacidad de rastreo de un alimento desde sus orígenes hasta los consu- midores. Para conseguir el cumpli- miento de estos programas preventi- vos, ha sido establecida como priori- dad el desarrollo de métodos de de- tección, de análisis y de diagnóstico que sean rápidos, sensibles y auto- matizables de un amplio espectro de agentes que amenazan la salud hu- mana. Los biosensores se presentan como los mejores candidatos por conseguir este nuevo reto.

Los agentes que afectan la se- guridad alimentaria La contaminación alimentaria repre- senta uno de los problemas de salud pública más extendidos del mundo contemporáneo y es una importante causa de mortalidad [1]. En los últi- mos años han existido numerosos casos de emergencias relacionados con la seguridad alimentaria que han provocado la desconfianza del con- sumidor en las distintas etapas de producción de alimento, procesa- miento, y comercialización. Como consecuencia, la Comisión Europea ha establecido la seguridad alimenta- ria como una de sus principales prio- ridades temáticas, impulsando una nueva política activa en alimentos, re- lacionadas con la modernización de legislación, el refuerzo de los contro- les «de la granja a la mesa» y el au- mento del asesoramiento científico, para garantizar un nivel alto de sa- lud humana y protección al consumi- dor. Una política de seguridad ali- mentaria eficaz requiere la evalua- ción y la supervisión de los riesgos para la salud del consumidor asocia- das con las materias primas, las prác- ticas agrícolas y el procesamiento del alimento.

B iosensores para bacterias patógenas en seguridad alimentaria

Las agencias reguladoras, los laboratorios de control de calidad y los propios consumidores podrán disponer en un futuro de dispositivos biosensores capaces de realizar análisis de manera más rápida, descentralizada y económica en muestras alimentarias complejas, tanto a pie de proceso en la industria como en los establecimientos de venta.

María Isabel Pividori

Grup de Sensors i Biosensors (GSB), Departament de Química, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193, Bellaterra e-mail: Isabel.Pividori@uab.cat Fax: +34 581 2379; Tel: +34 93 581 4937

http://webs2002.uab.es/ipividori/

De entre los agentes que pueden amenazar la seguridad alimentaria,

el término 'contaminante' se refiere

a sustancias peligrosas o microorga-

nismos que no son añadidos inten- cionadamente, mientras que un 'aditivo' representa un producto quí- mico añadido durante la producción

del alimento [2]. Los contaminantes pueden entrar en el alimento de for- ma accidental durante el crecimien-

to, cultivo, o preparación del mismo,

o bien acumularse en el alimento du-

rante su almacenamiento, o formar- se in situ en el alimento por la inter- acción de componentes químicos, o concentrarse desde sus componen-

tes naturales. Los aditivos fueron con anterioridad la principal preocu- pación de los consumidores, pero hoy por hoy, existe mayor preocupa-

ción por las contaminaciones, en concreto por las microbiológicas, se- guidas por la de los pesticidas y re- siduos de fármacos que pueden pro- ducir resistencia al tratamiento mé- dico [3]. Las agencias reguladoras han esta- blecido programas de control para evitar que los contaminantes entren en la cadena alimentaria. La calidad y la seguridad de los alimentos sólo pueden asegurarse mediante el uso de sistemas de control de calidad a lo largo de toda la cadena alimenta- ria. Una de las formas más eficaces para proteger la salud pública en el sector de la alimentación consiste en basar sus programas de producción de alimentos en el Análisis de Riesgo y Puntos Críticos de Control (HACCP, del inglés Hazard Analysis

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IX WORKSHOP MRAMA Figura 1.- Modelo de jerarquización de métodos analíticos para la seguridad alimentaria. Sistemas
IX WORKSHOP MRAMA Figura 1.- Modelo de jerarquización de métodos analíticos para la seguridad alimentaria. Sistemas

Figura 1.- Modelo de jerarquización de métodos analíticos para la seguridad alimentaria. Sistemas analíticos de vanguardia-retaguardia. Adaptado de Ref [5].

Critical Control Point). Las prácticas

basadas en HACCP consisten en un proceso sistemático preventivo pa- ra garantizar la seguridad alimenta- ria, asociado al control de riesgos y peligros potenciales durante la ope- ración y manipulación de alimentos

[4].

Métodos analíticos de van- guardia y retaguardia para la detección de bacterias pató- genas en alimentos Una aproximación realista y aplica- ble a programas HACCP para con- seguir la seguridad alimentaria con- templa la explotación de las caracte- rísticas particulares de los métodos analíticos existentes para la detec- ción de patógenos mediante la jerar- quización de los mismos en un mo- delo de vanguardia-retaguardia, tal como se muestra en la Figura 1 [5], siendo los métodos de vanguardia (o screening) aquellos utilizados pa- ra tomar decisiones rápidas, normal- mente fuera del ámbito del labora- torio analítico mientras que los de retaguardia se realizan en el labo- ratorio, y están basados en los mé- todos de referencia microbiológicos clásicos. En un modelo de este ti- po, cientos de muestras pueden so- meterse en un tiempo reducido a un sistema de screening, el cual propor- ciona de forma simple, rápida y eco- nómica información analítica de ti- po si/no, índices totales, o de alar- ma, que sirven para tomar decisio- nes rápidas. Sólo un escaso núme- ro de las muestras que han ofrecido una respuesta positiva son someti-

das a un proceso analítico tradicio- nal en el laboratorio: en el caso de bacterias patógenas, mediante mé- todos microbiológicos clásicos (que pueden tardar hasta una semana o más en dar un resultado confirma- torio). Los sistemas analíticos de scree- ning, proporcionan información ana- lítica de un modo simple y rápido. Son diseñados para procesar un al- to número de muestras por día, cuando se requiere una decisión rá- pida, y cuando el sistema analítico debe funcionar fuera del ámbito del laboratorio. O bien, cuando la infor- mación analítica cuantitativa no inte-

resa. Son características fundamen- tales de estos sistemas propiedades tales como simplicidad, rapidez de la respuesta analítica y bajo coste. No se debe cometer el error de pensar que la información analítica que dan estos métodos de screening es de peor calidad. Más bien, los paráme- tros tradicionales de un resultado analítico en términos de calidad pa- ra estos métodos de vanguardia o de screening deben ser redefinidos. Por ejemplo, los conceptos de sensibili- dad y especificidad de estos méto- dos aparecen reciclados desde la epidemiología. Así, en un método de screening, la sensibilidad se define como el % de muestras positivas co- rrectamente identificadas como tal, mientras que la especificidad se de- fine como el % de muestras negati- vas correctamente identificadas [6]. La especificidad y la sensibilidad se controlan mediante la definición de un valor de corte o cut-off. Por lo ge- neral, un sistema analítico de van- guardia se asocia a un método con- firmatorio, que actúa como un siste-

Los sistemas analíticos de screening, proporcionan información analítica de un modo simple y rápido

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IX WORKSHOP MRAMA Pueden incluirse dentro de los métodos de vanguardia o de screening todos aquellos

Pueden incluirse dentro de los métodos de vanguardia o de screening todos aquellos métodos rápidos para la detección de bacterias patógenas

ciente, constituyen un campo multi- disciplinar de I +D y un mercado muy atractivo. Originariamente la investi- gación en este campo provenía prin- cipalmente del sector clínico y bio- médico. Actualmente los biosenso- res no son patrimonio exclusivo de la investigación biomédica. A la in- dustria en general, y a la alimentaria en particular, le es necesario contro- lar de manera fiable parámetros analíticos en matrices muy comple- jas. Un sensor está formado por dos par- tes. Una de estas partes es el de- nominado «elemento de reconoci- miento molecular» o «receptor» que interacciona con un determinado componente de la muestra, de ma- nera específica, es decir, el resto de la muestra no interfiere en la medi-

ción. La otra parte se conoce como «transductor». Cuando el compo- nente que se busca determinar en la muestra compleja interacciona con el «receptor» del sensor, se produce un cambio que es detectado por el «transductor» y transformado en una señal eléctrica mensurable por un instrumento. Esta configuración tan simple de re- conocimiento y transducción es la que ha permitido el diseño de una instrumentación con características prácticas e innovadoras en el cam- po del análisis. Mediante este es- quema analítico tan simple es posi- ble eliminar varias etapas conven- cionales del proceso analítico, como son el tratamiento de la muestra o la separación del resto de la muestra del componente que se quiere deter- minar, los cuales complican un pro- cedimiento clásico de análisis cuan- do se usa equipamiento analítico complejo. Un biosensor es un sensor químico con un receptor constituido por ma- terial biológico para el reconocimien- to molecular del analito. El reconoci- miento molecular biológico es la cla- ve de la vida celular, de su organiza- ción y mantenimiento. Este tipo de reconocimiento, optimizado por la evolución biológica, se usa para el desarrollo de los biosensores. Efectivamente, las interacciones en- tre enzimas y sustratos o inhibido- res, entre anticuerpos y antígenos o haptenos, entre diversos receptores y hormonas, fármacos y neurotrans- misores y entre fragmentos de DNA han servido de modelo a varios sis-

ma analítico de retaguardia (Figura 1), por lo que, en la mayoría de los

casos un falso positivo no es tan pro- blemático como un falso negativo, debido a que posteriormente se va

a investigar.

Pueden incluirse dentro de los mé- todos de vanguardia o de screening todos aquellos métodos rápidos pa- ra la detección de bacterias patóge- nas, incluyendo los ensayos inmuno- lógicos tales como los ELISA (del in-

glés enzyme linked immunosorbent

assays), aquellos basados en la de- tección de ácido nucleicos tales co- mo las técnicas de amplificación in vitro del DNA basadas en la PCR (del

inglés polymerase chain reaction),

así como los dispositivos biosenso- res, que se tratarán a continuación.

Sensores químicos y biosen- sores Los sensores químicos existen des- de hace mucho tiempo. Se han es- tudiado en profundidad y han encon- trado en todo este tiempo un gran campo de aplicación. Se conocen muy bien por su uso cotidiano en el

laboratorio los electrodos selectivos

a iones, especialmente el de pH. Los biosensores, de aparición más re-

el de pH. Los biosensores, de aparición más re- Figura 2.- Izq. Diagrama esquemático de la

Figura 2.- Izq. Diagrama esquemático de la inmunoseparación magnética (IMS) de Salmonella en muestras de leche. Der. Imágenes de la microscopía electrónica de barri- do, luego de la inmunoseparación magnética de Salmonella (10 4 CFU/ml). Voltaje de ace- leración 15 kV.

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IX WORKSHOP MRAMA Figura 3.- Representación esquemática de los procedimientos basados en magneto electrodos m-GECs,
IX WORKSHOP MRAMA Figura 3.- Representación esquemática de los procedimientos basados en magneto electrodos m-GECs,

Figura 3.- Representación esquemática de los procedimientos basados en magneto electrodos m-GECs, incluyendo la i) modificación de las MPs, ii) la captura magnética de las MPs con el magneto electrodo y, finalmente, iii) la detección electroquímica del even- to de reconocimiento biológico. También se muestra el aspecto macroscópico del mag- neto electrodo desarrollado en el GSB comparativamente con una moneda de un euro.

temas biosensores, algunos ya co- mercializados. Debido a sus características, los bio- sensores representan unas herra- mientas de análisis con numerosas aplicaciones en la industria agroali- mentaria. Las características más destacadas de estos dispositivos que los convierten en opciones al- tamente atractivas son: y) su espe- cificidad, ii) alta sensibilidad, iii) cor- to tiempo de análisis, iv) capacidad de inclusión en sistemas integrados, v) facilidad de automatización, vi) capacidad de trabajar en tiempo re- al, vii) versatilidad, que permite el di- seño de dispositivos «a la carta», viii) su bajo coste, ix) no destructi- vos, lo que permite el control de pro-

cesos in situ, x) no contaminantes, amigables con el medio ambiente. [7] Los biosensores son, por lo tan- to, ideales para su implementación en protocolos de Análisis de Riesgos y Puntos Críticos de Control para el establecimiento, implementación y

mantenimiento de un plan de calidad en toda la cadena alimentaria. La separación magnética y los magneto sensores Uno de los materiales más prome- tedores en bioanálisis son las partí- culas paramagnéticas modificadas biológicamente, que se basan en el concepto de bioseparación magnéti- ca. Las partículas magnéticas (MPs) o sus contrapartes nanoestructura- das (MNPs) ofrecen nuevas y atrac- tivas posibilidades en biomedicina y bioanálisis debido a que se pueden recubrir de biomoléculas y pueden manipularse mediante la aplicación de un campo magnético externo. Así la molécula biológica analito (célu- las, proteínas, DNA, pequeñas mo- léculas orgánicas) puede unirse se- lectivamente a las MPs y luego re- moverse de matrices biológicas complejas tan sólo mediante la apli- cación de un campo magnético. La figura 2 muestra como ejemplo la in- munoseparación magnética de Salmonella en una muestra alimen- taria como es la leche, mediante la reacción de la bacteria con partícu- las magnéticas modificadas con el anticuerpo específico. Además, las MPs, constituidas por un núcleo de ferrita de propiedades paramagnéti- cas y recubiertas por un polímero inerte, se ofrecen comercialmente de una variedad de materiales y ta- maños, y modificadas con una gran variedad de grupos funcionales, lo que les otorga una gran flexibilidad analítica [8]. Así, pueden ser modifi- cadas con diferentes grupos orgáni-

Debido a sus características, los biosensores representan unas herramientas de análisis con numerosas aplicaciones en la industria agroalimentaria

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IX WORKSHOP MRAMA Figura 4.- (A) Estrategia genosensora del producto doblemente marcado con –BIO y –DIG
IX WORKSHOP MRAMA Figura 4.- (A) Estrategia genosensora del producto doblemente marcado con –BIO y –DIG

Figura 4.- (A) Estrategia genosensora del producto doblemente marcado con –BIO y –DIG basadas en estrept(avidina)-MPs integradas a un magneto sensor m-GEC. (B) Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de doble marcación, en la que se utilizan cebadores marcados en 5’ para obtener un producto doblemente marca- do. En el caso de la figura se muestran cebadores biotinilados y modificados con digoxi- genina. Otros datos experimentales en detalle en Ref [9].

Este procedimiento constituye una plataforma muy versátil para biosen- sores electroquímicos (tanto geno- sensores como inmunosensores) en matrices alimentarias complejas. El Grupo de Sensores y Biosensores (GSB), en colaboración con el Departament de Genètica i Microbiologia, de la Universitat Autònoma de Barcelona dirige sus lí- neas de investigación en este senti- do. A continuación se explican los principales avances conseguidos en el campo de la determinación de bacterias patógenas por este grupo.

Magneto genosensor electro- químico En nuestro laboratorio se ha diseña- do un método ultrasensible de de- tección de bacterias patógenas ba- sado en la amplificación del genoma por PCR utilizando cebadores mar- cados de forma que el producto am- plificado esté doblemente marcado, tal como se muestra en la Figura 4. Una de las marcas se utiliza para la inmovilización del amplicón, mien- tras que la otra, para acoplarse a un marcador enzimático para la detec- ción electroquímica. Esta estrategia ha demostrado aumentar la sensibi- lidad de dispositivos genosensores con diferentes pares de cebadores

cos para acoplarse covalentemente a biomoléculas (enzimas, DNA o an- ticuerpos), o ser modificadas direc- tamente con biomoléculas como es- treptavidina, Proteína A o poli(dT). El GSB diseñó una estrategia bio- sensora que se basa en la integra- ción de MPs a magneto electrodos con detección electroquímica que ofrece características analíticas me- joradas, y que se muestra esquemá- ticamente en la Figura 3. En lugar de la modificación directa de la super- ficie del electrodo, las reacciones biológicas (tales como la inmoviliza- ción, la hibridación, la marcación en- zimática o las reacciones de afini- dad, entre otras), así como los pa- sos de lavado, pueden realizarse de manera óptima en la superficie de las MPs. Luego de las modificacio- nes, las MPs pueden capturarse en la superficie de un magneto electro-

do basado en compósitos grafito- epoxi que tienen un pequeño imán en el interior (m-GEC), diseñado en nuestros laboratorios (Figura 3).

(m-GEC), diseñado en nuestros laboratorios (Figura 3). Figura 5.- Representación esquemática de la estrategia de

Figura 5.- Representación esquemática de la estrategia de determinación de Salmonella basada en un magneto electrodo. (i) Luego de la captación de las bacterias de la mues- tra alimentaria, y la reacción con un segundo anticuerpo marcado con la peroxidasa, las partículas magnéticas modificadas con el anticuerpo específico son captadas por el elec- trodo magnético. (ii) El electrodo se polariza a -0,1 V (vs. Ag/AgCl) y se detecta electro- químicamente la señal tras la adición de los reactivos necesarios.

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IX WORKSHOP MRAMA para diferentes pares de transducto- res/marcadores. Se ha demostrado la utilidad de este

para diferentes pares de transducto- res/marcadores. Se ha demostrado la utilidad de este sistema con el par de cebadores –BIO (para la inmoviliza- ción del amplicón en partículas mag- néticas modificadas con es- trept(avidina) (estrept(avidina)-MPs) y su posterior integración a un mag- neto electrodo m-GEC) y –DIG (para la marcación enzimática con el mar- cador antiDIG-HRP). Con esta estra- tegia rápida y sensible se pueden de- tectar escasas fmoles de producto amplificado y doblemente marcado (amplicón) del elemento IS200 espe- cífico de la Salmonella [9], así como del del gen eaeA, relacionado a la pa- togenicidad de la E. coli O157:H7 [10]. Además, hemos propuesto un método screening de la tuberculosis (TB) en ganado mediante la determi- nación a partir de la amplificación por PCR y doble marca del fragmento de inserción IS6110 específico de M. bo- vis, en tanques de leche de estable- cimientos lecheros [11]. El magneto genosensor mostró características prometedoras para la detección de tuberculosis en granjas de ganado le- chero a través de la determinación del DNA de M. bovis en muestras de leche procedentes del mismo, com- parándolas con pruebas de PCR de interlaboratorio así como con la reac- ción cutánea de tuberculina.

Magneto inmunosensor elec- troquímico El GSB ha diseñado un sistema elec- troquímico para la detección rápida y sencilla de Salmonella en leche, basa- do en la captura inmunomagnética de Salmonella y en una reacción inmuno-

inmunomagnética de Salmonella y en una reacción inmuno- Figura 6.- (A) Representación esquemática de la

Figura 6.- (A) Representación esquemática de la estrategia de determinación de Salmonella basada en la captura inmunomagnética (A), la lisis de la bacteria (B), libera- ción del DNA genómico y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de doble marca- ción de 0.04 CFU mL -1 (o 1 CFU en 25 g) de Salmonella en leche luego de un paso de preenriquecimiento de 6 h en medio LB. (D) Gel de agarosa obtenido del amplicón doble- mente marcado (calle Nº 3), del control negativo (0 CFU mL -1 , calle 2), así como el mar- cador de tamaño (genoma ΦX174-Hinf I, calle 1). (E) Señal electroquímica obtenida con el magneto genosensor del producto doblemente marcado (barra gris) y del control nega- tivo (barra negra). En todos los casos, n = 4.

lógica de tipo sándwich [12]. Para tal fin, se utilizaron partículas magnéticas recubiertas por anticuerpos específi- cos anti-Salmonella y un segundo an- ticuerpo anti-Salmonella marcado con la enzima peroxidada (Figura 5). Entre procedimientos diferentes, los mejores resultados se obtuvieron con las reacciones inmunológicas llevadas a cabo en un paso, hecho que trae asociado el acortamiento y la simplificación del proceso. El pro-

cedimiento IMS/m- GEC/inmunosensor fue utilizado por primera vez para la detección de Salmonella inoculada artificialmente en muestras de leche. Se obtiene con esta estrategia un límite de de- tección de 5 103 cfu mL-1 y de 7,5 103 cfu mL-1 en LB y en leche dilu- ída 1/10 en caldo LB, respectiva- mente, en 50 min sin ningún pretra- tamiento. Si la leche se preenrique- ce durante 6 horas, el método pue- de detectar tan sólo 1,4 cfu mL-1, mientras que si se preenriquece du- rante 8 horas, se pueden detectar tan sólo 0,108 cfu mL-1 (2,7 cfu en 25 g de leche, en 5 muestras de 5 mL, según el Real Decreto 1679/1994, BOE 24-09-94). Además, el método puede distinguir entre bacterias patógenas alimenti-

cias como Salmonella y E. coli.

El GSB ha diseñado un sistema electroquímico para la detección rápida y sencilla de Salmonella en leche

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IX WORKSHOP MRAMA Magneto genosensor electro- químico combinado con PCR y con separación inmunomagné- tica En

Magneto genosensor electro- químico combinado con PCR y con separación inmunomagné- tica En el GSB se ha desarrollado un mé- todo sensible de detección de bacte- rias que combina la separación inmu- nomagnética (IMS), la PCR con doble marcación y la detección electroquí- mica mediante un magneto sensor [13]. La bacteria se captura desde la muestra alimentaria mediante partícu- las magnéticas modificadas con el an- ticuerpo específico. Luego de la sepa- ración, y de la ruptura de la membra- na celular, el genoma de la bacteria se amplifica y se marca por PCR. Luego de la amplificación, se consi- gue la inmovilización de la secuencia amplificada a partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina, me- diante la reacción con la biotina, y la marca enzimática mediante el otro ex- tremo modificado con digoxigenina. Posteriormente, las partículas magné- ticas modificadas son captadas por el magneto electrodo y se realiza la de- tección electroquímica basada en la actividad enzimática (Figura 6). Esta estrategia puede detectar tan só- lo 1 CFU mL -1 de bacterias en LB así como en leche diluida 1/10 en LB, sin mostrar ningún efecto de matriz, a causa del uso de partículas magnéti- cas. El inmunoseparación magnética permite reemplazar el cultivo selecti- vo mientras que la PCR de doble mar- ca y detección electroquímica basada en el magneto sensor reemplaza las etapas de pruebas bioquímicas y con- firmación serológica del método de re- ferencia. El tiempo del ensayo se con- sigue reducir considerablemente des- de 3-5 días a 3.5 h. Es importante destacar que esta estrategia puede dar resultados positivos con células bacterianas dañadas o muertas, pe- ro sin embargo, y a diferencia de la PCR convencional, no da resultados positivos con DNA liberado durante el procesamiento del alimento. Además, los inhibidores de la PCR se evitan en esta estrategia al extraer el DNA en el

interior de la célula bacteriana y libe- rarlo una vez eliminada la muestra (y

los posibles inhibidores que conten-

ga). Si la muestra se preenriquece por 6 h en LB, se pueden detectar tan só-

lo 0.04 CFUs mL -1 de Salmonella con una señal/ruido de 20 (Figura 5). Este procedimiento es adecuado por el análisis in situ rápido y sensible de Salmonella en HACCP.

La especificidad de esta estrategia

está dada tanto por el reconocimien- to inmunológico del anticuerpo duran- te la separación inmunomagnética así como por el set de primers durante el

PCR, mientras que la sensibilidad vie-

ne dada por el magneto genosensor

electroquímico. El GSB está trabajando en la actuali- dad en el desarrollo de sistemas mul-

tiplexados de screening de microorga- nismos patógenos viables enteros, tal

y como

Escherichia coli, para la detección rá- pida de estos patógenos en muestras alimentarias complejas. Asimismo, también estamos trabajando en el di- seño de biosensores para otro tipo de contaminantes alimentarios no micro- biológicos, tales como residuos ali- mentarios (antibióticos, pesticidas, alergenos, aditivos alimentarios).

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Salmonella,

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13.- Liébana S, Lermo A, Campoy S, Barbé J, Alegret S, Pividori MI (2009). Magneto Immunoseparation of Pathogenic Bacteria and Electrochemical Magneto Genosensing of the Double-Tagged Amplicon. Analytical Chemistry

81:5812–5820.

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA El género Vibrio está compuesto por más de 35 especies cuyo hábitat pri-

El género Vibrio está compuesto por más de 35 especies cuyo hábitat pri- mario es el medio acuático, tanto aguas saladas como dulces. Algunas poblaciones de estas especies pue- den producir infecciones en huma- nos a través de la ingesta de agua contaminada o de alimentos marinos crudos o mal cocinados. Las tres es- pecies con mayor relevancia clínica

son Vibrio vulnificus, Vibrio parahae- molyticus y Vibrio cholerae.

Hasta la fecha no se ha establecido un marcador de virulencia universal para V. vulnificus, aunque se cono- cen muchos de los factores implica- dos en su patogenicidad, como por ejemplo el lipopolisacárido capsular (CPS), los pili, hemolisinas, metalo- proteasas y enterotoxinas. El poten- cial patogénico de V. parahaemoly- ticus ha sido asociado con la pre- sencia de la hemolisina TDH codifi- cada por el gen tdh que está presen- te en cerca del 95% de las cepas aisladas de casos clínicos. El prin- cipal marcador de virulencia para detección de V. cholerae es el gen ctx, que codifica para la enterotoxi- na colérica. Las infecciones causadas por Vibrio han sufrido una imparable expansión durante los últimos años, afectando a zonas del mundo en las que nun- ca se había detectado este patóge- no, lo que ha obligado a activar me- canismos de control para controlar el riesgo de infección por este organis- mo. Este fenómeno ha sido asocia- do a factores de origen antropogéni- co, como el transporte marítimo, así como factores oceanográficos, como el movimiento de masas de agua, que podrían estar influenciadas por el cambio climático. España no se ha quedado ajena de la expansión de estas enfermedades y se ha no- tado un incremento en el número de casos a partir de los años 90.

Identificación y detección La identificación de estos microorga- nismos por métodos convencionales

D etección de vibrio parahaemolyticus, vibrio

cholerae y vibrio vulnificus por pcr a tiempo real

Verónica Blanco Abad y Jaime Martínez Urtaza

Instituto de Acuicultura, Universidad de Santiago de Compostela E-mail: veronica.blanco.abad@usc.es

de cultivo en placa y confirmación bioquímica es larga y está sujeta a diferentes inconvenientes como el sobrecrecimiento en las placas de flora acompañante, al estado de via- ble pero no cultivable de los micro- organismos y sobre todo a la impo- sibilidad de discriminar aquellos es- pecímenes potencialmente patóge- nos. Una solución rápida y sencilla a estos inconvenientes es el empleo de técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente la PCR a tiempo re- al, más rápida, específica y sensi- ble que la PCR convencional porque añade a la reacción una sonda es- pecífica. Estas sondas son oligonu- cleótidos complementarios a la re- gión diana, situadas entre los ceba- dores, que están marcados en su extremo 5´por un fluorocromo que emite fluorescencia en el momento en el que la Taq polimerasa, al am- plificar la secuencia, lo separa de la sonda. Además, la PCR a tiempo re- al permite el uso de un control posi- tivo interno (IPC) evitando así resul- tados falso-negativos debido a la presencia de inhibidores, por otra parte tan frecuentes en los produc- tos alimentarios. Finalmente, pres-

cinde de la utilización de electrofo- resis en gel para la resolución del producto amplificado, se reduce la posibilidad de contaminación y todos los resultados se analizan y archivan de forma automática por un softwa- re. Hasta la fecha no existía en el mer- cado un kit o test comercial que per- mitiese la detección y cuantificación

de V. parahaemolyticus, V. vulnificus

y V. cholerae, incluyendo sus varian- tes potencialmente patógenas. Analizando las carencias en la de- tección de estos tres microorganis- mos y en colaboración con la empre- sa Applied Biosystems, se ha dise- ñado y optimizado un kit, en forma- to liofilizado, de detección de estos microorganismos empleando la téc- nica de PCR multiplex a tiempo real, incluyendo un control positivo inter- no (IPC) y realizándose la detección de todas las secuencias diana de forma simultánea en la misma reac- ción de PCR. Un aspecto importan- te de estos nuevos productos es que se distribuyen en formato liofilizado, por lo que solo es necesario añadir una solución acuosa con el ADN del organismo a detectar, lo que evita los numerosos problemas asociados

La identificación de microorganismos por métodos convencionales es larga y tiene inconvenientes

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA con la manipulación de los reactivos y con la contaminación cruzada. Diseño Como

con la manipulación de los reactivos

y con la contaminación cruzada.

Diseño Como dianas de detección de V. para- haemolyticus se ha seleccionado el gen regulatorio toxR y el gen tdh co- mo diana de detección de los especí- menes patógenos. V. cholerae se de- tecta por amplificación del gen ompW que codifica una proteína de membra- na, y los especímenes patógenos se reconocen por amplificación del gen de la enterotoxina colérica. La presen-

cia de V. vulnificus se determina por la presencia de un gen de regulación es- pecífico de este microorganismo. En aquellas muestras en las que esté pre- sente alguno de estos genes, habrá una emisión de fluorescencia que supere un valor límite o línea umbral. El IPC ha de emitir fluorescencia y su- perar la línea umbral en todas las muestras negativas para los genes diana (Figura 1). El protocolo de ci- clos-temperaturas es idéntico para las 6 sondas incluidas en el diseño. Las sondas se han diseñado con tec- nología TaqMan MGB (Applied Biosystems). En las Sondas TaqMan se une un fluorocromo al extremo 5’ de la sonda y un quencher al 3’. Cuando el fluorocromo es excitado, transfiere su energía al quencher. Cuando la Taq empieza amplificar el ADN diana, el extremo 5’ de la son- da es degradado por la actividad exo- nucleasa 5’-3’ de la Taq. Este proce- so libera el fluorocromo al medio se- parándolo del quencher, lo que oca- siona un aumento de la fluorescen- cia. Un MGB es una pequeña molé- cula unida al extremo 3' de la sonda

y que encaja en el surco menor del

ADN bicatenario. Cuando la sonda TaqMan se hibrida, el MGB estabiliza el apareamiento. La mayor estabili- dad hace que las sondas TaqMan MGB sean más cortas que las son-

das TaqMan estándar. El mejor rendi- miento espectral mejora la precisión

y permite coherencia superiores en-

tre los distintos ensayos, y la mayor

superiores en- tre los distintos ensayos, y la mayor especificidad de la hibridación permi- te una

especificidad de la hibridación permi- te una discriminación más precisa de las dianas. Además, al ser la sonda más pequeña se facilita el diseño de los ensayos, pues las sondas se pue- den encajar en regiones diana más cortas.

Flujo de Trabajo Desde la llegada de la muestra al la- boratorio, hasta la lectura de los re- sultados, el proceso de detección se resume en 5 pasos con una dura- ción total máxima de 24 horas (Figura 2):

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA a) Día 1. Preparación de la mues- tra y pre-enriquecimiento en cal- do
IX WORKSHOP MRAMA a) Día 1. Preparación de la mues- tra y pre-enriquecimiento en cal- do

a) Día 1. Preparación de la mues- tra y pre-enriquecimiento en cal- do de peptona alcalina (APW) a 37º durante 16-18 horas.

b) Día 2. Extracción de ADN me- diante el método de hervido y eli- minando los posibles inhibidores que puedan interferir en el funcio- namiento óptimo de la PCR. En el caso de cultivos puros, donde la presencia de inhibidores es prác-

ticamente inexistente, se propo- ne el uso de PrepMan ® Ultra (Applied Biosystems). En el caso de extracciones de ADN a partir de caldos de cultivo, con alta pre- sencia de posibles inhibidores, se propone un protocolo de extrac- ción que incluye un lavado con Chelex 100 al 5% (BioRad). c) Día 2. Preparación del test, que consiste únicamente en añadir el

ADN al ensayo en formato liofili- zado.

d) Día 2. Correr el test en un equi- po de PCR a tiempo real.

e) Día 2. Visualizar los resultados.

Siguiendo el flujo de trabajo propues- to y usando el kit de detección de

Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cho- lerae y Vibrio vulnificus por PCR a

tiempo real (Applied Biosystems) es posible tener los resultados de pre- sencia o ausencia de estos microor- ganismos y de sus especímenes pa- tógenos en la muestra en menos de 24 horas. El desarrollo y optimiza- ción de este kit se ha realizado con reactivos de Applied Biosystems, y el ensayo final se ofrece en formato lio- filizado, aportando al kit mayor faci- lidad de uso, menor tiempo de ma- nipulación, reducción del riesgo de cometer errores y del riesgo de con- taminación y mayor precisión y con- sistencia a los resultados obtenidos. La PCR a tiempo real también apor- ta rapidez al flujo de trabajo, permi- tiendo mayor flujo de muestras y en- sayos. Con las reacciones múltiples se ahorra tiempo y reactivos (ya que es posible analizar más de una dia- na en un único experimento) siendo posible gracias al diseño con tecno- logía TaqMan MGB (Applied Biosystems), que aporta estabilidad, eficacia y sensibilidad sobre todo en el caso de PCR múltiple. Debido a la sencillez de uso, estos ensayos analíticos pueden efectuar- se por personal técnico no especia- lizado, lo que permite generalizar los controles analíticos de Vibrio. La ex- tensión de estas técnicas a laborato- rios oficiales y a empresas del sector pesquero y acuícola redundará en un control más efectivo de estos pató- genos y permitirá centrar el esfuer- zo analítico de los laboratorios en la detección de las variantes patógenas de estos organismos y no en pobla- ciones totales no patógenas, permi- tiendo emitir resultados y tomar de- cisiones sobre productos retenidos en menos de 24 horas.

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA S istemas BD para identificación Becton Dickinson and Company • Sistemas rápidos (4-48

S istemas BD para identificación

Becton Dickinson and Company

istemas BD para identificación Becton Dickinson and Company • Sistemas rápidos (4-48 horas), se- guros y

• Sistemas rápidos (4-48 horas), se- guros y con resultados fiables.

• Sistemas herméticos de fácil mani- pulación, < 1 minuto por test.

• Gran número de sustratos bioquími- cos (15-30) para realizar una iden- tificación más precisa.

No necesita de muchas pruebas previas. Deben usarse con aisla- dos puros.

No necesita revelado de los resul- tados.

• La mayor base de datos de iden- tificación de microorganismos, in- cluyendo gran cantidad de bacte- rias ambientales.

BD BBL ™ ENTEROTUBE II

• Es un método para la identificación que utiliza15 substratos bioquími- cos para la identificación presun- tiva de bacteriasentéricas. Más de 80 especies con el BD Enterotube II por medio de 3 Bases de Datos.

• Selección del sistema usar:

Enterotube II para colonias oxida- sa negativas o Oxi/FermTube II pa- ra colonias oxidasa positivas.

BD BBL ™ CRYSTAL

• Sistema de identificación manual o semiautomático (Autoreader) para

la identificación de Bacterias emple- ando 29 ó 30 sustratos fluorogéni- cos, cromogénicos y azucares.

ID de 370 especies con 4 pane- les de BD Crystal (Entéricos/No Fermentadores (E/NF) y Gram Positivos (GP), Gram Positivo

(RGP),

Neisseria/Haemophilus (N/H) y Anaerobios (ANR).

Rápidos

( E/NF ) y Gram Positivos ( GP ), Gram Positivo ( RGP ), Neisseria/Haemophilus (
( E/NF ) y Gram Positivos ( GP ), Gram Positivo ( RGP ), Neisseria/Haemophilus (
( E/NF ) y Gram Positivos ( GP ), Gram Positivo ( RGP ), Neisseria/Haemophilus (

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA S istema de Detección microbiológica BD MicroPro™ Becton Dickinson and Company Las industrias
IX WORKSHOP MRAMA S istema de Detección microbiológica BD MicroPro™ Becton Dickinson and Company Las industrias

S istema de Detección microbiológica BD MicroPro™

Becton Dickinson and Company

Las industrias alimentarías requieren analizar un elevado número de muestras y obtener rápidos resulta- dos que permitan aplicar acciones

miento diseñado para la detección de microorganismos mediante citome- tría de flujo, con aplicación en Microbiología Industrial.

células vivas y muertas, gracias a distintos protocolos de marcaje, con colorante permeables e imper- meables a membrana.

correctoras inmediatas en sus proce- sos de fabricación. Cada vez es ma-

- Todos los reactivos son estables a temperatura durante 7 días.

yor la demanda de métodos rápidos y automatizados que permitan garan- tizar la seguridad y calidad micro- biológica de los alimentos comercia- lizados, sin que supongan un riesgo para la salud. La citometría de flu- jo ha cobrado gran importancia a ni-

Características técnicas del sistema

- Capacidad de 47 muestras por tan- da y rendimiento de 20 muestras / hora, pudiendo destinar el tiempo íntegro de duración del análisis a otras tareas.

- Sistema totalmente automatizado.

- Software sencillo proporciona re- sultados objetivos de fácil interpre- tación en cumplimento con la nor- ma 21 CFR.

Aplicaciones Análisis cualitativo – Test de

vel mundial debido a la versatilidad

El

sistema añade reactivos, mezcla

Ausencia / Presencia

de la técnica y a la amplia gama de

y

limpieza automática dentro del

Screening de para contaminación mi-

sectores para su aplicación:

sistema y eliminación de burbujas.

crobiana con resultados al día si-

Biotecnología, Industria de las bebi- das y alimentos, cosmético y farma-

- Límite de detección: Rango de concentración 10 1 a 10 6 UFC/mL

guiente para la mayoría de análisis

céutico. En BD somos conscientes

- Tamaño celular: El Sistema BD

- El sistema BD Micro PRO™ per-

Análisis cuantitativo– Enumeración

de esta necesidad y es por ello que ahora lanzamos al mercado un nue- vo sistema rápido basado en la ci-

Micro PRO™ permite detectar par- tículas de hasta 0,1 µm, detectan- do el número específico mediante

- Control microbiológico de agua pu- rificada y de proceso en tan sólo 4 minutos, no días.

tometría de flujo, el sistema BD Micro PRO™. El sistema BD Micro PRO™ es un equipo rápido, automa- tizado, sensible y de máximo rendi-

fluorescencia.

mite un análisis en tiempo real, permitiendo la diferenciación de

- Control de calidad en stock de cul- tivos. Cuantifica de una forma pre- cisa los cultivos puros, reducien- do trabajo en el laboratorio.

en stock de cul- tivos. Cuantifica de una forma pre- cisa los cultivos puros, reducien- do
en stock de cul- tivos. Cuantifica de una forma pre- cisa los cultivos puros, reducien- do

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA - Detección contaminación de su- perficies. Análisis de hisopos de superficie para contaminación

- Detección contaminación de su- perficies. Análisis de hisopos de superficie para contaminación mi- crobiana y de productos residuales sin necesidad de realizar cultivo, directamente de la torunda. Resultados en 5 minutos.

- Monitorización de fermentación mi- crobiológica.

Beneficios del sistema en la Microbiología rápida y auto- matizada Resultados rápidos, precisos y re- producibles mediante una solu- ción rentable. El sistema BD Micro PRO ™ proporciona resultados cuantitativos, rápidos, precisos y re- producibles en el formato cuen- tas/mL, con una óptima correlación con los obtenidos por métodos tra- dicionales. El sistema BD Micro ™ PRO puede generar resultados en menos de 5 minutos por muestra, donde con los métodos tradiciona- les pueden llegar a tardar hasta 21 días. El sistema implica un ahorro de cos- tes, minimizando los medios y per- dida de productos y mejoras los pro- cesos mediante una monitorización constante. La mayor rapidez en el análisis en comparación con los mé- todos tradicionales permite liberar in- ventario antes, disminuyendo mate- rial en stock y disminuyendo los cos- tes y riesgos asociados, así como detectar antes posibles contamina- ciones, tanto en la materia prima, en el producto terminado, como en muestras tomadas de cualquier par- te del proceso. Solución única. Detección de bac- terias, mohos y levaduras en UN úni- co test. Un test – Una solución. Permite el “screening” de bacterias, levaduras y mohos en un mismo en- sayo y a partir de una única muestra, con la mayoría de resultados obte- nidos en un día.

y mohos en un mismo en- sayo y a partir de una única muestra, con la
y mohos en un mismo en- sayo y a partir de una única muestra, con la

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IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA AFNOR Esta validación acredita el uso del sistema BacTrac 4300 como método cualitativo
AFNOR
AFNOR
IX WORKSHOP MRAMA AFNOR Esta validación acredita el uso del sistema BacTrac 4300 como método cualitativo

Esta validación acredita el uso del sistema BacTrac 4300 como método cualitativo alternativo de análisis de enterobacterias en productos lácteos. El estudio interlaboratorio se realizó en 2007 con la colaboración de 14 la- boratorios que analizaron las mues- tras mediante el sistema BacTrac. Se utilizaron muestras de leche pas- teurizada contaminadas aritificial-

V alidación del sistema de microbiología rápida

Bactrac 4300 según iso 16140:2003

El sistema de microbiología rápida BacTrac 4300 de la firma SyLab ha alcanzado la validación AFNOR del método de impedancia según la ISO16140 para la detección de Enterobacterias.

Gomensoro

mente con E. coli a tres niveles que oscilaban entre 0 células/10ml y 300

células/10ml.

Para la siembra se utilizó el medio selectivo de SyLab BiMedia 144A es- pecífico para Enterobacterias, con especial sensiblidad para la detec- ción de E. sakazakii Los resultados obtenidos con el sis- tema BacTrac 4300 respecto al mé-

todo de referencia fueron los siguien- tes:

Exactitud: 98% Especificidad: 97% Sensibilidad 98% Estos datos permiten la conclu- sión que la variabilidad del método alternativo (BacTrac 4300) es equi- valente al método de referencia de siembra en placa.

la variabilidad del método alternativo (BacTrac 4300) es equi- valente al método de referencia de siembra

IX WORKSHOP MRAMA

IX WORKSHOP MRAMA T T C T C A T C C C T Achieving accurate
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Achieving accurate and precise results is necessary for food labortories. Faster results through automation are key to efficiency. After an intensive and highly successful validation program performed at BIOTECON Diagnostics laboratories, the foodproof ® RoboPrep+ Series is now commercially available. This is the first validated au- tomated solution for DNA extraction and PCR-based microbial testing spe- cifically designed for the food industry. Six different versions of the foodproof ® RoboPrep+ robotic workstation are available with up to 96 samples being processed at one time. A technician need only load the sam- ples, reagents and consumables prior to starting the run. This automated tech- nology frees laboratory personnel from routine work, allowing time to devote to other necessary laboratory activities, and thus increasing a laboratory’s throughput ability. The foodproof ® RoboPrep+ Series uses the foodproof ® Magnetic Preparation Kit I for effective DNA ex-

F Fast and accurate pathogen detection for food just got

easier…. Introducing the new foodproof ® RoboPrep+ Series for automated DNA extraction and PCR set-up.

BIOTECON Diagnostics GmbH, Hermannswerder 17, D-14473 Potsdam, Germany Tel.: (+49) 331 2300-200, Fax.: (+49) 331 2300-299, Email: bcd@bc-diagnostics.com www.bc-diagnostics.com

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Email: bcd@bc-diagnostics.com www.bc-diagnostics.com traction as well as food proof ® real-ti- me PCR-based

traction as well as foodproof ® real-ti- me PCR-based detection kits, such as the foodproof ® Salmonella Detection Kit. The foodproof ® product line offers flexible proven solutions for the detec- tion of pathogens, spoilage organisms and GMOs for the food and beverage industry as well as for pharmaceutical and cosmetic manufacturers. Foodproof ® products offer the freedom of using hybridization or hydrolysis pro- bes on most open-platform PCR instru- ments. To see the food proof ® RoboPrep+ workstation in action, watch our video on YouTube (search term BIOTECON) or visit our website at: www.bc-diagnos- tics.com.

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XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Control del peso

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

ON INNOVATION XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Control del peso y proteínas Una parte de

Control del peso y proteínas

Una parte de la población debe perder peso para alcanzar un peso adecuado

y de este modo contribuir a la preven- ción de enfermedades crónicas como

la diabetes o los problemas coronarios.

Para perder peso y mantenerlo, lo que llamamos control del peso, se reco- miendan varias estrategias: rebalance- ar la dieta, disminuir el aporte calórico, practicar ejercicio físico regularmente y aumentar la regularidad de las comi- das. Las proteínas son bien conocidas por su poder saciante, que es superior al de los carbohidratos y la grasa [1]. Se sabe que hay un efecto a corto plazo inducido por una ingesta rica en prote- ína: 50 gramos de proteína son capa- ces de reducir la cantidad de ingerida de alimento en humanos [2]. Hay tam- bién un efecto continuo en la saciedad durante el día cuando la dieta es ge- neralmente rica en proteínas, es decir, con un contenido en proteína mayor al 20% [3]. Este aumento de la sensación de saciedad es la clave del éxito de es- tos programas de pérdida de peso, ya que la ingesta diaria de calorías se ve reducida. La proteína de trigo, presente en la gra- no del cereal en cantidad considerable (11% como valor medio), se compone en un 80% de gluten, que a su vez es- tá compuesto en un 55% de gluteni- nas y un 45% de gliadinas. Ambos ti- pos de molécula se diferencian tanto en su peso molecular como en su estruc- tura terciaria y cuaternaria, lo que les confiere distintas propiedades. El glu- ten vital de trigo se obtiene industrial- mente por extracción física de la hari- na. La compañía SYRAL, líder en la pro- ducción de gluten de trigo, ha desarro-

P roteínas de trigo en el desarrollo de productos ricos

en proteína Ejemplo aplicativo en galletas

Virginia Millán

virginia.millan@syral.com

llado una familia de proteínas hidroliza- das de trigo. Estas proteínas, de nom- bre comercial MERIPROTM, son solu- bles en determinados rangos de pH, actuando como emulsionantes, texturi- zantes, estabilizadores de espuma o fuente soluble y no funcional de prote- ína. Por otra parte, la proteína de trigo tiene una alta digestibilidad (90,3% di- gestibilidad real ileal en humanos), comparable a otras fuentes de proteí- na vegetal.

Contexto regulatorio El REGLAMENTO (CE) No 1924/2006 DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 20 de diciembre de 2006 relativo a las declaraciones nutriciona-

les y de propiedades saludables en los alimentos, establece las declaraciones nutricionales de “fuente de proteínas” y “alto contenido en proteínas”, que son aplicables a alimentos en los que las proteínas aportan como mínimo el 12 % o el 20% del valor

energético

del alimento

respectiva-

mente.

Respecto a

las declara-

ciones

propiedades

saludables

de

(art. 13), las siguientes alegaciones han sido presentadas y se espera que EF- SA publique su opinión en septiembre:

“Mantenimiento muscular”, “Mantenimiento de la masa muscular en atletas”, “Mantenimiento de la masa muscular en personas mayores”, “Saciedad / Control del peso” y “Salud de los huesos”. Cabe destacar que el Reglamento (CE) Nº 983/2009 de la Comisión recoge la opinión positiva de EFSA referente al Artículo 14, apartado 1, letra b) del Reglamento 1924 (declaración de pro- piedades saludables relativa al des- arrollo y la salud de los niños), y per- mite la siguiente alegación: “Las pro-

teínas son necesarias para el creci- miento y el desarrollo normales de los

huesos en los niños”. Esta declaración solo puede utilizarse en relación con alimentos que son, como mínimo, fuen- te de proteínas (12% del valor energé- tico del alimento proveniente de prote-

alimentos que son, como mínimo, fuen- te de proteínas (12% del valor energé- tico del alimento

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION ínas) y que cumplen con el perfil nutri- cional de
XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION ínas) y que cumplen con el perfil nutri- cional de
XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION ínas) y que cumplen con el perfil nutri- cional de

ínas) y que cumplen con el perfil nutri- cional de su categoría.

Desarrollo de galletas con alto contenido en proteína Con las premisas anteriormente ex- puestas, las galletas se presentan co- mo un interesante producto susceptible de ser enriquecido en proteínas para aportar un efecto saciante. Las galletas son ampliamente consu- midas en España (alrededor de 8 Kg hab/año), principalmente en el desayu- no. El periodo de tiempo que transcu- rre entre el desayuno y la comida es un buen objetivo para aumentar la sacie- dad, entendida como la inhibición del deseo y/o la necesidad de comer des- crita en la “Cascada de la Saciedad” de Blundell [4]. Un desayuno rico en pro-

teínas puede ayudar a eliminar el pi- coteo entre horas. En el presente desarrollo, realizado en el Centro de Aplicaciones de SYRAL si- tuado en Marckolsheim, Francia, se han observado los requerimientos nu- tricionales de las galletas en cuanto a lo límites de grasas saturadas (8g/100g), azúcares (25g/100g) y sal (500mg/100g), según los Perfiles Nutricionales definidos en el borrador de 17 de marzo de 2009 de la Comisión. MERIPRO TM es una proteína de trigo de sabor neutro y alto contenido en pro- teína (>78.5% en sustancia seca). Se obtiene por hidrólisis enzimática de glu- ten y es altamente soluble (>85%) en todo el rango de pH. Su composición en aminoácidos es rica en acido glutá- mico (42%) y prolina (15%) y deficita- ria en algunos AA esenciales como li- sina dado su origen de cereal. La combinación de varias fuentes de proteína puede aportar un mayor valor nutricional para equilibrar la composi- ción de aminoácidos. Adicionalmente, se obtienen mejoras tecnológicas. En este desarrollo MERIPRO TM ha sido combinado con un aislado de proteína láctea. Finalmente, dado que una dieta rica en proteína puede tener posibles repercu- siones negativas de sobre la flora intes- tinal [5], se ha incorporado a la receta una fibra prebiótica (Fructo-oligosacá- ridos Actilight ® ). La galleta obtenida enriquecida en pro- teína ha sido comparada con una re- ferencia sin proteínas añadidas. En ambas se han analizado la reología de la masa, cohesividad, dureza y resis- tencia a la rotura de las galletas, así co- mo las pruebas organolépticas (colour, análisis sensorial). La fórmula de la galleta contiene un 13% de MERIPRO TM y un 4% de pro- teína láctea. Esto permite alcanzar un porcentaje del 22,5% de proteína en el producto final, permitiendo las decla- raciones nutricionales: “alto contenido en proteína” y “rico en fibra”. Tanto la viscoelasticidad de la masa co-

mo el laminado no se ven afectados por la adición de proteína. La dureza y la cohesividad no son significativamen- te diferentes. Sin embargo, los análi- sis efectuados con el texturómetro in- dican que las galletas ricas en proteína tienen mayor resistencia a la rotura que la referencia. Los análisis sensoriales (test de Friedman) no encuentran diferencias significativas en los parámetros anali- zados ni en la apreciación global. En conclusión, es posible elaborar ga- lletas con alto contenido en proteína con la proteína de trigo MERIPRO TM sin impacto significativo en sus propieda- des físicas u organolépticas. Las ga- lletas cumplen con el Perfil Nutricional de su categoría y permiten la declara- ción de “alto contenido en proteínas” y “rico en fibras” Otras posibles alegaciones de salud como “las proteínas tiene efecto sa- ciante” están pendientes de aprobación por la Unión Europea. La combinación de bajas grasas satu- radas, alto contenido en proteína y al- to contenido en fibra dietética confor- man una galleta con una equilibrada composición nutricional.

Bibliografía

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41

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Los Sistemas Miniaturizados Inteligentes basados en Micro Nano Tecnologías (MNT)

Los Sistemas Miniaturizados Inteligentes basados en Micro Nano Tecnologías (MNT) son importante avances tecnológicos que se están in- troduciendo rápidamente en todos los sectores industriales como tecnolo- gías horizontales habilitadoras de nuevas soluciones y productos. Las MNT, como ya ocurrió con la Microelectrónica en décadas anterio- res, aportan ventajas de bajo coste, pequeño tamaño, reproducibilidad, bajo consumo y altas prestaciones

que son hoy en día vitales en las áre-

as

Telecomunicaciones, Transporte, Energía, Medio Ambiente y más re- cientemente en el de la Salud. A ni- vel mundial se observa que el sector de las Micro Nano Tecnologías está creciendo de forma mucho más ace- lerada que otros sectores más tradi- cionales. La consecución de una ‘in- teligencia distribuida’ basada en una red sistemas de medida multifuncio- nales, autónomos y miniaturizados es el objetivo último de las MNT desde el punto de vista aplicativo. Por otro lado, el sector alimentario, de gran valor estratégico para España y también a nivel europeo, precisa de continua innovación debido a los cam- bios en los hábitos de los consumi- dores y a la necesidad de crear nue- vos y mejores productos alimentarios de forma segura y eficiente. Sin em- bargo, se trata en general de un sec- tor muy tradicional en cuanto a sus procesos de fabricación y especial- mente a nivel nacional requiere de un importante apoyo para no perder competitividad respecto a otros paí- ses emergentes con menores costes de producción. La mejora de la cali-

de la Electrónica,

dad y de la seguridad es vital para mantener cuotas de mercado, y la op- timización de los procesos es necesa- ria para aumentar la competitividad de los productos españoles. Se pretende por tanto, implementar una nueva generación de soluciones analíticas y de sensado en las cua- les se incorporen aportaciones impor-

S ensado con Micro Nano Sistemas en Aplicaciones

Agroalimentarias: Perspectivas nacionales y europeas

Luis Fonseca, Carles Cané

IMB-CNM (CSIC) Luis.fonseca@imb-cnm.csic.es, carles.cane@imb-cnm.csic.es

tantes gracias a que los materiales y los dispositivos sean de dimensiones micro o nanométricas, o se fabriquen, mediante micro y nanotecnologías. Esta aproximación “Nano around fo- od” en la que los micro y nano ele- mentos están incorporados a los sis- temas sensores pero no forman par- te de los propios alimentos, proporcio- na todas las ventajas deseadas, sin adolecer de las problemáticas emer- gentes de la aproximación “Nano in Food” en cuanto a determinados in- terrogantes sobre su toxicidad y otras preocupaciones sociales. Con ella se persigue:

- Un mejor control y caracterización de la materias primas, ingredientes y productos finales.

- Un incremento de productividad y un mejor control de la calidad y se- guridad durante el procesado.

- Un mejor seguimiento de la evolu- ción y trazabilidad de la calidad de producto a lo largo de la cadena ali- mentaria.

- La optimización de recursos y ma- terias primas debido a un mejor control de procesos. El reto consiste en ser capaces de proporcionar la tecnología y las meto- dologías necesarias para ofrecer sis- temas de detección eficaces y con ventajas de aplicación o de valor aña- dido con respecto a los sistemas ac- tuales. La temática alimentaria se ci- ta frecuentemente entre los objetivos prioritarios de investigación del prin- cipal programa de investigación euro- peo en micro y nanotecnologías (el Tema ICT del Programa Marco), pero

rara vez resulta exitosa. El paso que se dio con el primer proyecto integra- do europeo en esa temática (el pro- yecto GoodFood (2004-2007), coordi- nado por el CNM-CSIC, y con abun- dante presencia española) no ha teni- do continuidad a pesar de que el mis- mo equipo investigador ha presenta- do varias propuestas desde entonces. La realidad es que las aplicaciones alimentarias se han visto tradicional- mente ensombrecidas en este terre- no por el gran peso de las aplicacio- nes biomédicas, y de las medioam- bientales en la actualidad. Aun así, puede haber nuevas oportunidades pues el tema se mantiene en el pro- grama de trabajo de las próximas convocatorias (2011-2012). En cualquier caso, el potencial de un proyecto europeo para dinamizar la temática desde una perspectiva na- cional es limitado, pues por su propia naturaleza europea, el número de so- cios españoles es igualmente limita- do. Por otro lado, los proyectos están- dar del Plan Nacional son de una cuantía económica y una duración temporal demasiado modestas para cumplir esa función. Por ese motivo, una serie de instituciones de investi- gación ha hecho la apuesta ambicio- sa de solicitar el proyecto SENS4FOOD dentro del programa CONSOLIDER para crear por prime- ra vez un núcleo español de inves- tigación multidisciplinar formado por grupos de los campos de las Tecnologías Micro-Nano-Bio, las Tecnologías de la Información y Comunicación y las Tecnologías de

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION los Alimentos , para afrontar los retos científicos del desarrollo

los Alimentos, para afrontar los retos científicos del desarrollo y demostra- ción de nuevos sistemas de detección

y sensado para aplicaciones agroali-

mentarias, en reconocimiento de la singular relevancia económica en España de este sector productivo. SENS4FOOD, actualmente en la se- gunda fase de evaluación, pretende

promover acciones estratégicas capa- ces de marcar un punto de inflexión

y propiciar un salto de calidad en la in- vestigación conjunta de las MNT y las tecnologías alimentarias, así como la generación de estructuras estables de colaboración multidisciplinar. Los objetivos de SENS4FOOD se re- sumen en:

- Promover investigación de excelen- cia, más allá del estado del arte, en el campo MNT y de tecnologías de alimentos mediante la creación de un grupo estable de alto nivel que sirva de semilla de futuras acciones integradas a Nivel Nacional para to- do el sector.

- Demostrar la viabilidad y las venta- jas de las soluciones basadas en MNT para el campo alimentario, co- mo contrapartida a las técnicas tra- dicionales habitualmente utilizadas en el sector, a través de la investi- gación en escenarios de mejora de seguridad y calidad alimentaria en un conjunto de productos (vino, car- ne y pescado) que son vitales en la dieta mediterránea (y por tanto para la salud del consumidor), y además son estratégicos para el sector alimentario nacional.

- Atraer a nuevos grupos de investi- gación en el campo de las MNT y alimentario a esta nueva línea de investigación multidisciplinar.

- Promover y fortalecer la interacción entre ciencia básica y aplicada, así como las relaciones con la industria española del sector, generando co- nocimiento innovador a nivel de nuevos (nano)materiales, nuevos dispositivos, sistemas y métodos de detección asegurando la adecuada transferencia de conocimiento y de

asegurando la adecuada transferencia de conocimiento y de Figura 1.- Relaciones previas entre los integrantes del

Figura 1.- Relaciones previas entre los integrantes del consorcio SENS4FOOD.

tecnología al sector académico e in- dustrial.

- Formar a jóvenes investigadores en un amplio abanico de metodologías y técnicas tanto del campo de las Micro y Nano Tecnologías como del alimentario, para el futuro benefi- cio de la industria alimentaria nacio- nal que los vaya a incorporar. La actividad de SENS4FOOD está or- ganizada en torno a tres líneas princi- pales de investigación (LIs). Muy bre- vemente: se avanzará con ayuda de las MNT en la optimización de nano materiales y microdispositivos ca- paces de sensar en los dominios físi- co, químico, bioquímico y biológico (LI-1), para desarrollar sistemas mi- niaturizados inteligentes (LI-2) que ayuden a definir nuevas metodologí- as que puedan solventar necesidades reales de detección en el campo ali- mentario (LI-3). Como muestra del interés del tema entre la comunidad micro-nanotecno- lógica nacional esta propuesta reúne por primera vez a los principales ac- tores de la I+D españoles con capaci- dad de fabricación de micro y nano- sistemas, habiendo todos ellos dedi- cado parte de sus esfuerzos al cam- po de la alimentación en alguna oca- sión. Dichos grupos están comple- mentados por socios investigadores en el campo de la tecnología de los alimentos que a su vez han mostra- do inquietudes previas en el potencial de las micro y nanotecnologías

(MNT). Así mismo, entre varios de los miembros del consorcio existe un historial previo de colaboración cien- tífica, tanto en proyectos naciona- les como europeos, que aseguran una armonía de intereses desde el primer momento y una coordinación eficaz (Ver figura 1). Más allá del destino final de SENS4FOOD cual- quier interesado en la aplicación de este tipo de nuevas tecnologías en

el campo alimentario puede ponerse

en contacto con los firmantes para futuras colaboraciones en este ám- bito. En resumen, el desarrollo de micro- nanosistemas para el campo alimen- tario es un tema ideal para promover investigación de excelencia en tec- nologías disruptivas que den lugar

en el futuro a productos explotables con unos inherentes beneficios eco- nómicos y sociales a nivel nacional

y europeo. Este objetivo está ade-

más en plena concordancia con la Estrategia Europa 2020 para un crecimiento inteligente, sosteni- ble e inclusivo: la aproximación propuesta contribuirá ciertamente a

desarrollar una economía basada en

el conocimiento, a la optimización de

recursos y a actividades ‘más ver-

des’, y también a la cohesión social

y territorial al proporcionar nuevas

tecnologías a un sector productivo de máxima relevancia en países del arco mediterráneo, así como en las áreas rurales de cualquier país.

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XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Carbohydrates represent a large part in our diet and are

Carbohydrates represent a large part in our diet and are present in ne- arly all foods we consume. In view of this it is surprising that they still re- ceive comparably little attention with respect to their nutritional benefits. Apart from the distinction between nutritive carbohydrates (e.g. starch, maltodextrins and sugars) and non- nutritive carbohydrates like polyols (sugar replacers) or dietary fibers, carbohydrates are largely classified according to their degree of polyme- risation in mono- and disaccharides (sugars), oligosaccharides, and polysaccharides. This, however, do- es not say much about their physio- logical properties, which may be very different even within each group. Moreover, the diversity of food car- bohydrates has increased over the last years and there are a number of carbohydrates available today which provide functional benefits be- yond their nutritional value. Therefore, it is worth to take a more differentiated look at carbohydrates and to look out for those with physio- logical benefits and a potential role to promote a healthy diet. In view of this, Palatinose™ is introduced as an example for a novel carbohydra- te with unique functionality.

What is Palatinose™?

Palatinose™ is a toothfriendly and slowly released carbohydrate which supplies the body the full carbohy- drate energy in a slower, more ba- lanced way and for longer time than conventional carbohydrates.

Isomaltulose, as Palatinose™ is ca- lled by its generic name, occurs na- turally in honey and sugar can jui- ce. It is a disaccharide, which – like sucrose – is composed of glucose and fructose. It is obtained from su- crose by enzymatic rearrangement of the α-1,2 linkage in sucrose into an α-1,6 linkage in Palatinose™. The different linkage gives Palatinose™ a unique set of physio- logical properties which largely dif-

I nnovations in carbohydrates – being “functional” with Palatinose™

Antje Jungclaus PhD

Manager Nutrition Communication, BENEO Group Gottlieb-Daimler-Str. 12, 68165 Mannheim, Germany, www.beneo.com, info@beneo.com

fers from those of sucrose and other common sugars:

1. Palatinose™ is kind to teeth:

Palatinose™ is more resistant to the use by the oral flora as subs- trate for bacterial fermentation. As result of this, no significant amounts of acids are produced and therefore demineralisation of teeth, as known from nutritive carbohydrates, does not occur with Palatinose™. While up to know the only toothfriendly alter- natives to sugars have been pol- yols, Palatinose™ is the first fully digestible sugar with toothfriendly properties and allows an exten- sion of the toothfriendly concept to new product categories like, for instance, beverages.

2. Palatinose™ is a slow release carbohydrate: In the small intes- tine, Palatinose™ is digested be- fore it can be absorbed by the body. Its hydrolysis takes place by a traditional enzyme called

isomaltase, which is also involved in the digestion of starch. The ra- te of hydrolysis is thereby much slower in comparison to common readily available sugars like su- crose (factor of about 4 to 5) or maltose (factor of about 10 to 12). Palatinose™ is nevertheless fully digested and absorbed by the end of the small intestine, which means that Palatinose™ provides the full carbohydrate energy (4 kcal/g), while it enables a slow glucose release into the body with all the benefits associated with this. 3. Palatinose™ is a low glycemic carbohydrate: The slow yet com- plete intestinal release of Palatinose™ is reflected in its blood glucose response, where Palatinose™ shows a lower, mo- re balanced blood glucose rise over longer time. Its low effect on blood glucose and insulin levels is expressed in the Glycemic and

blood glucose and insulin levels is expressed in the Glycemic and Figure 1.- origin and structure

Figure 1.- origin and structure of Palatinose(TM).

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Figure 2.- Characterisation of the blood glucose response of Palatinose(TM)
XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Figure 2.- Characterisation of the blood glucose response of Palatinose(TM)

Figure 2.- Characterisation of the blood glucose response of Palatinose(TM) in compari- son to sucrose.

Insulimic Indices: Palatinose™ has a GI of 32 and an II of 30. While most sugars and sweete- ning carbohydrates have a me- dium to high GI, Palatinose™ is one of the very few carbohydra- tes with a low GI. A carbohydrate-based low-glyce- mic diet is discussed to be bene-

ficial with respect to a healthy diet and the prevention and manage- ment of overweight, diabetes and coronary heart disease. The long- term maintenance of normal blo- od glucose concentrations is se- en as a beneficial physiological effect in this respect. Palatinose™ can beneficially in- fluence carbohydrate metabolism markers as result of its low glyce- mic properties: A 4-week inter- vention study in people with im- paired fat metabolism (hyperlipi- demia) found a significant reduc- tion of fasting blood glucose and insulin resistance after 4 weeks of daily Palatinose™ intake (50 g/d) as part of a controlled diet, while no significant differences were seen with sucrose.

4. Palatinose™ is the carbohy-

drate for balanced and prolon- ged energy supply: The exam-

ple of Palatinose™ shows that not only the calorie intake matters but also the way the energy is de- livered to the body. Glucose me- ans energy; and the way of gluco- se supply reflects the supply of energy to the body. Palatinose™ provides the same amount of car- bohydrate energy but in a more balanced way and over longer ti- me - a unique property of Palatinose™ as result of its slow intestinal release. This offers a whole bunch of physiological ad- vantages as e.g. continuous energy availability with less seve- re insulin reactions and a higher level of fat oxidation, as well as an optimum energy supply for

physical activity with the potential to enhance endurance-type physical performance and sustai- ned mental performance. Palatinose™ is different from sugars with respect to its physiological pro- perties and thus needs thinking be- yond the classical boundaries of car- bohydrates. On the other hand, Palatinose™ fits very well into futu- re trends in functional sweetening carbohydrates: In an omnibus survey (published in the Mintel Sugar and Sweetener Report in November 2007) on the question, which of the sugars and sweeteners was most in- teresting, most respondents were in- terested in sugar alternatives with additional health benefits like prolon- ged energy or in a type of real sugar alternative with a low GI. Palatinose™ is used as functional carbohydrate in a wide range of fo- od products. It has a natural sugar-li- ke taste with a mild sweetness (about 50% that of sucrose). Its low hygros- copicity and good flowability make it interesting for powder applications (e.g. instant drink applications). Its high stability under acidic conditions is important in liquid applications and brings a further advantage for appli- cations in sports drinks and isotonic drinks. Other product applications in- clude functional beverages, sports nutrition, dairy products, meal repla- cements, chocolate and bars, cere- als, confectionery, baked goods and many more.

A carbohydrate-based low-glycemicdiet is discussed to be beneficial with respect to a healthy diet

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XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Predictions by the World Health Organisation say that by 2015,

Predictions by the World Health Organisation say that by 2015, over 2.3 billion of the adult population will be overweight and more than 700 million will be obese. In contrast to this over-all trend, there is a growing proportion of the population who are becoming more health conscious and concerned about their weight, so are demanding alternative food pro- ducts that will help them lead a he- althier lifestyle. A number of initiati- ves have been set up to combat the obesity rise and as a result, the ne- ed is for manufacturers to improve the physiological quality of consumer food products with particular focus on the salt, sugars and fat contents. With respect to sugar reduction, the- re are many ways to reformulate fo- od. Most of them can be attributed to the following three types of approa- ches:

(1) The “food chemist’s approach” with focus on carbohydrate chain length: e.g. replacing su- gars (mono- and disaccharides) by higher molecular weight car- bohydrates like e.g. maltodex- trin. (2) The “technologist’s approach” with focus on portion size and sugar percentage: e.g. adding water or air to a product on order to reduce the energy density; re- ducing the amount of sugar wi- thout replacement, or simply re- ducing the portion size. (3) The “nutritionist’s approach” with focus on the nutritional and physiological properties of a pro- duct: e.g. replacing sugars by in- gredients which bring additional nutritional value to the product (e.g. polyols, dietary fibers). The demand for products reduced in sugar have become even more po- pular and as such, familiar consumer products are now appearing on shel- ves with new, “improved” recipes but not all have necessarily led to impro- ved quality products. The physiologi- cal advantages of ‘reduced sugar’

S ugar reduction in an intelligent way – how to

improve the physiological quality of a product

Antje Jungclaus PhD

Manager Nutrition Communication, BENEO Group Gottlieb-Daimler-Str. 12, 68165 Mannheim, Germany, www.beneo.com, info@beneo.com

products come into question where fat content is increased or if longer molecular-weight carbohydrates are used. BENEO has its heart and ex- pertise based on the third approach and can achieve sugar reduction as well as provide further health bene- fits with its ingredients, as described in the following.

Traditional sugar replace- ment with polyols and/or in- tense sweeteners Polyols are commonly used to fully replace sugar 1:1 in foods and con- fectionery like candies, chewing

gum, chocolate, baked foods, mar- malade and others that are energy reduced or with no added sugars. The bulk sweeteners (polyols) are thereby often combined with inten- se sweetness to adjust for their lo- wer sweetness level. Isomalt is the only sugar replacer de- rived from pure beet sugar yet with only half the calories. When isomalt is used in food products, consumers can be sure that they are consuming fewer calories. Isomalt also allows promoting dental health and has a very low effect on blood glucose and insulin levels.

Predictions by the World Health Organisation say that by 2015, over 2.3 billion of the adult population will be overweight and more than 700 million will be obese

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION Critical voices may ask: Half the ca- lories and mainly

Critical voices may ask: Half the ca- lories and mainly used in confectio- nery – does this have any physiolo- gical benefits? The answer is “yes”:

Goran and colleagues demonstrated in 1999 1 that even small imbalanced in energy intake and output make a difference. According to their calcu- lation, only 30 kcal per day excess energy intake can lead to childhood obesity. This is equivalent to 5 min playing instead of watching TV. Or it is equivalent to eating five sugar-free isomalt candies instead of five regu- lar candies of 3g each. Every calorie counts!

Sugar and fat reduction with functional fibers Both oligofructose and inulin are die- tary fibers derived from chicory. Oligofructose can be used to par- tially replace sugar in a wide range of food products because of its su- gar-like physical properties with si- milar structure and a similar visco- sity, a high solubility and a sugar-li- ke sensorial profile. Inulin can function as fat replace- ment by partially or completely repla- cing fat in a range of food product wi- thout sensorial and textural compro- mises. This is because inulin and water form a particle gel with creamy consistency and a fat-like mouthfeel and structure, which is neutral in tas- te and colour. These fibers can reduce the sugar or fat content in a product, respectively, and bring additional nutritional value to the product at the same time. With maximum 2 kcal/g, they have fewer calories, and they provide fibre en- richment. Their fiber-like properties are beneficial for stool regulation, gut transit time and short chain fatty acid production. Being prebiotic they stimulate gut health and have shown to enhance mineral absorption and

bone mineral density as well as to af- fect energy intake.

Thinking outside the box”:

Modifying the sugar quality with the novel sugar Palatinose™ As well as ingredients enabling high quality sugar reduced recipes, new functional carbohydrates such as Palatinose™ (isomaltulose) give new possibilities for healthy nutrition, and given that it is a disaccharide carbohydrate, it poses the question of whether the focus should be on sugar reduction or carbohydrate mo- dification. From a physiological point

of view, Palatinose™ is not a sugar at all. Differing from sucrose solely in the linkage between the glucose and the fructose moieties, this new linkage turns Palatinose™ into a car- bohydrate with a unique combination of physiological properties: It allows a slow yet full release of glucose to the body (slow calories). Being low- glycaemic as well, it provides balan- ced and sustained energy to the body and contributes to modern energy management characterised by a more steady carbohydrate energy supply and a higher contribu- tion of fat oxidation. Apart from that, Palatinose™ is kind to teeth.

Critical voices may ask: Half the calories and mainly used in confectionery – does this have any physiological benefits? The answer is “yes”

IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION M etabolomica ́ y Lipidomica ́

M etabolomicá y Lipidomicá

Objetivos La protección del consumidor así co- mo el diseño y producción industrial de alimentos funcionales se debe ba- sar en la mejor investigación y des- arrollo racional de la mejor evidencia científica. En este contexto, el objeti- vo de este trabajo es evaluar la efica- cia de una nueva vía multidisciplinar para el establecimiento de propieda- des nutricionales de un alimento pre- sente en el mercado, englobando el máximo de indicadores disponibles en modelos experimentales relevantes. Se aplicó esta vía al estudio de los efectos de este alimento sobre uno de los mecanismos fisiopatológicos bá- sicos, el estrés oxidativo y su implica- ción en enfermedad cardiometabólica.

Metodología Para el objetivo propuesto, se plan- teó el estudio del efecto del alimento, una bebida de soja, desde una pers-

redox aplicadas al estudio de

ingredientes y alimentos funcionales

Manuel Portero-Otín, Alberto Espinel 1 , José Serrano, Mariona Jové, Jordi Boada, Hugo Gonzalo, Anna Cassañé, Marco Antonio Delgado1 y Reinald Pamplona

Nutren-Nutrigenomics, UdL-IRBLLEIDA- PCITAL, Lleida y 1 I+D+i Grupo Leche Pascual, Aranda de Duero

pectiva tecnológica, nutricional, fisio- lógica y médica orientada al servicio de la I+D+i. Así, tras el análisis biblio- gráfico, se plantearon de forma suce- siva tres modelos experimentales de complejidad creciente: i) el de cultivo celular en diversas variantes para el esclarecimiento de posibles vías de señalización implicadas en los efectos biológicos del alimento o sus nutrien-

tes; Ii) un modelo experimental de en- fermedad cardiometabólica y iii) un es- tudio de intervención aleatorizado en voluntarios sanos. En los tres modelos se utilizó una de las herramientas de implantación más reciente que permiten la consecución del objetivo, la biología de sistemas o también conocida como disciplinas "- ómicas". Asimismo, como validación de los resultados obtenidos se estu- diaron parámetros fisiológicos relacio- nados mediante herramientas como inmunohistoquímica, inmunodetección y respirometría de alta resolución.

Resultados La metodología propuesta permite dar respuesta a ¿con qué se está alimen- tando? mediante el análisis bromato- lógico de trazabilidad y comparación con mercado; a ¿estamos alimentan- do?, estudiando marcadores de bio- disponiblidad y/o adherencia; ¿es es- ta alimentación útil para el propósito inicial?, analizando el efecto sobre marcadores de función biológica; ¿có- mo puede funcionar este alimento?, generando hipótesis sobre cambios en el metaboloma y en la expresión del genoma y finalmente, ¿puede fun- cionar en todas las personas de igual manera?, mediante el análisis de la interacción entre el nutrigenoma y los cambios fisiológicos. El sistema pro- puesto es suficientemente flexible y adaptable a las circunstancias en con- creto, pudiendose establecer módulos de análisis de alimentos, de modelos

establecer módulos de análisis de alimentos, de modelos Figura 1.- Perfil metabolómico completo del plasma de

Figura 1.- Perfil metabolómico completo del plasma de modelos experimentales de enfermedad cardiometabólica. Tras la obtención del plasma, 5 microlitros fueron someti- dos al análisis mediante la plataforma basada en LC/Q-TOF y posteriormente fue anali- zada mediante el software Genespringr. Se muestran en columnas los perfiles de10 muestras y cada segmento de colores corresponde a un ion compatible con un metabo- lito, generándose en este caso un total de 1883 características moleculares diferentes.

IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION preclínicos, de estudios de interven- ción

preclínicos, de estudios de interven- ción y en todos ellos restringiendose

al análisis ómico o siendo ampliables

a comprobación de los mecanismos

implicados. En el caso concreto de la bebida de

soja, la utilización simultánea de lipi- dómica y metabolómica redox en las muestras generadas, permite perfilar cual puede ser el mecanismo que per- mite esta mejora en el estado metabó- lico, más allá de indicar si aumenta o disminuyen indicadores relativamente inespecíficos de estrés oxidativo, que no siempre definen mecanismos ni constituyen evidencia científica inter- nacionalmente reconocida. Así, como se muestra en la Figura 1,

el perfil metabolómico del plasma del

modelo experimental murino de enfer- medad cardiometabólic,a obtenido

mediante la utilización de estas he- rramientas, evidencia una alta comple- jidad de moléculas circulantes. Entre éstas, tras el análisis bioinformático pertinente (Figura 2), se separan aquellas que son sensibles a la inges- ta de la bebida de soja. Esta aproxi- mación permite no sólo establecer bio- marcadores de ingesta, sino también indicar cuáles pueden ser las vías me- tabólicas que están afectadas, produ- ciendo nuevas evidencias científicas o incluso contribuyendo al estableci- miento de nuevas propiedades funcio- nales. En este ejemplo en concreto, algunos de los marcadores apuntan a una actuación de la bebida de soja so- bre la función de las mitocondrias, el sistema de producción energético ce- lular, en músculo esquelético, sugi- riendo que, en el modelo experimen-

esquelético, sugi- riendo que, en el modelo experimen- Figura 2.- Perfil metabolómico diferencial del plasma de

Figura 2.- Perfil metabolómico diferencial del plasma de modelos experimentales de enfermedad cardiometabólica. Tras la obtención del plasma, 5 microlitros fueron someti- dos al análisis mediante la plataforma basada en LC/Q-TOF y posteriormente fue anali- zada mediante el software Genespringr. Se muestran en columnas los perfiles de10 muestras y cada segmento de colores corresponde a un ion compatible con un metabo- lito, indicando en este caso las masas diferenciales en respuesta a la bebida de soja

(n=157).

tal, se puede mejorar el metabolismo gracias a una adaptación mitocondrial, que se ha comprobado mediante he- rramientas como el western-blot o la respirometría de alta resolución. La utilización simultánea de cultivo ce- lular llevó a esclarecer que las isofla- vonas presentes en la bebida condu- cen a una mejora de la respuesta a in- sulina del músculo esquelético y del adipocito parcialmente gracias al mis- mo mecanismo. Con estas evidencias sobre mecanis- mo funcional, se ha procedido al es- tudio del efecto de la bebida de soja

en un grupo de voluntarios sanos du- rante 2 meses. El estudio de las varia- bles relacionadas con el enfermeda- des metabólicas, guiado por los da- tos obtenidos in vitro e in vivo con mo- delos experimentales, ha llevado a la confirmación de que la bebida de so-

ja

mejora, de forma dependiente con

la

cantidad ingerida, marcadores re-

lacionados con el metabolismo de car- bohidratos y lípidos, siendo beneficio-

so en aquellos casos donde exista una

predisposición, sea genética o debi- da al estilo de vida, a una alteración en el metabolismo energético.

Conclusiones

La incorporación e integración guiada de técnicas ómicas, con experimen- tación animal y en humanos, permite apoyar el desarrollo de alimentos e in- gredientes funcionales basado en la evidencia, mejorando el conocimien-

to del proceso nutricional y aportando

valor añadido al alimento, a través de nuevas propiedades y/o confirmación

de las conocidas.

Apoyado por el Grupo Leche Pascual,

a través del programa CENIT del

Ministerio de Industria (CDTI) y por un consorcio de compañias liderada por La Morella Nuts con la participación de KRAFT, BTSA (Biotecnologías Aplicadas), Selecció Batallé, Industrial Técnica Pecuaria, Neuron BioPharma, Shirota Functional Foods e Innaves. Agradecemos el soporte del programa Tecnio, Generalitat de Catalunya.

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IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION

IX WORKSHOP MRAMA – XIII FOOD STUDIES MEETING ON INNOVATION S ustainable Food processing, present and

S ustainable Food processing, present and future opportunities

Friso van Assema and Peter de Jong

NIZO food research Kernhemseweg 2 6718 ZB EDE The Netherlands Friso.vanassema@nizo.nl

Nowadays, and even more in the futu- re, the world of food processing chan- ges by factors that were not foreseen 30 years ago.

At present, sustainability is a target in all (food) processing companies. However, although the term “sustaina- ble development” has celebrated its 20th anniversary in 2007, most proces- sing equipment that is presently used in many of the production plants was developed a long time ago. Clear examples of these are dewatering pro- cesses, such as evaporation and spray drying. These processes are responsi- ble for a major part of the total energy consumption of the food industry but still look like 30 years ago. To meet the today and future require- ments on sustainable food production,

it is necessary to come up with new

equipment designs that reduce the car- bon foot print by more than 50%. This

is a challenging task. Not only to design

a process with diminished energy con-

sumption but also to keep the product quality according to competitive specs. In other words, what is the impact of new process technology on different in- terfaces such as consumer perception, logistics, process safety, etc. In the presentation, a number of “low hanging fruit” technologies and me- thods will be given that can help the in- dustry to reduce their energy consump- tion and meet the present and near fu- ture criteria in sustainable food proces- sing. Examples are optimization of cle- aning procedures and the prevention of fouling by optimizing equipment set- tings. A view towards sustainable pro- cessing methods for the long term futu- re will also be given. Examples of the- se methods are self cleaning equip- ment; high solids processing and ad- vanced process control. Finally, an overview will be given of recent projects NIZO has initiated to develop technolo- gies enabling to shape our view for fu- ture sustainable food processing.

NIZO has initiated to develop technolo- gies enabling to shape our view for fu- ture sustainable