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Los resultados de las pruebas InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm son comparables a aquellos obtenido en el Western blot. En lugar de la necesidad de correr 2 blots que consumen tiempo, la reactividad para los anticuerpos a los VIH tipos 1 2 puede confirmarse rpidamente en una prueba simple y sencilla.

Principio de la prueba
La prueba de InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es un ensayo inmunoenzimatico indirecto de fase slida (EIA). La fase slida es un peine con 12 proyecciones (dientes). Cada peine tiene 6 pares de dientes, con seis puntos de antgeno por par (3 puntos en cada diente). El diente izquierdo de cada par tiene un punto superior sensibilizado con inmunoglobulina humana (control interno), y los dos marcadores p24 (gag) y p31 (pol). El diente derecho tiene tres puntos de protena derivadas de env gp41, gp120 y gp36. La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F), cada fila contiene una solucin de reactiva lista para uso en diferentes fases del anlisis. La prueba se desarrolla fase por fase, desplazando el peine de una fila a la otra, con incubacin en cada una de las fases. Para iniciar la prueba se adicionan muestras de suero o plasma al diluyente en los pozos de la fila A de la bandeja de desarrollo. Luego el peine se inserta en los pozos de la fila A. Los anticuerpos Anti-VIH, si estn presentes en las muestras se enlazaran especficamente a los antgenos de VIH sobre los dientes del peine (figura 1). Los componentes no ligados se lavan en la fila B. En la fila C, el Anti-VIH IgG capturado en los dientes, y la inmunoglobulina humana en las puntos superiores (control interno) reaccionarn con los anticuerpos anti IgG humanos marcados con fosfatasa alcalina (FA). En las siguientes dos filas los componentes no unidos se remueven lavando. En la fila F, la fosfatasa alcalina unida reaccionar con componentes cromognicos. Los resultados son visibles como puntos gris-azulados en la superficie de los dientes del peine.
Formacin del complejo: pptido de HIV - anticuerpo; 30 min anticuerpo Unin del conjugado anti-IgG humano; 20 min

HIV 1 & 2 CombFirm

Cdigo: 60434002

Formato: 3 x 6 pruebas

Para uso diagnstico in vitro solamente


El kit InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es una prueba confirmatoria. La prueba confirma la presencia del virus de inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2), incluyendo el VIH-1 subtipo O, en las muestrasde suero o plasma humano inicialmente VIH reactivos. Pueden desarrollarse 18 pruebas con una kit.

FA

FA

Conjugado anti-IgG humano


FA

Introduccion
El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente etiolgico del Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Dos tipos, el VIH-1 y el VIH-2, han sido identificados, presentando pronsticos y tasas de transmisin diferentes. Las rutas principales de la transmisin del VIH son el contacto sexual, la contaminacin por productos sanguneos o por sangre, y la transmisin de madre a hijo. El VIH predominantemente infecta los linfocitos CD4, los cuales juegan un papel clave en el sistema humano. La disminucin progresiva de CD4 durante el desarrollo de la enfermedad lleva a una condicin inmunocomprometida, facilitando infecciones oportunistas, con consecuencias fatales. El virus VIH consta de una molcula de RNA genmica asociada con una transcriptasa reversa, protegida por una cspide y una envoltura. La envoltura del virus es el objetivo principal para la respuesta del anticuerpo humoral. Por consiguiente, las pruebas de tamizaje de VIH altamente sensibles estn principalmente basadas en la deteccin de anticuerpos contra antgenos derivados de los componentes de la envoltura (env). Para distinguir las reacciones reales de las falsas, un resultados positivo mediante un anlisis de tamizaje debe re-probarse y confirmarse mediante una prueba de alta especificidad. La confirmacin serolgica de una infeccin de VIH, comnmente desarrollada usando el anlisis Western blot se basa en la deteccin diferencial de anticuerpos dirigidos contra los antgenos VIH. La prueba InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm emplea cinco antgenos recombinantes distintos y sintticos para la determinacin serolgica rpida del perfil de anticuerpos VIH. Dos antgenos son protenas pol y gag-derivadas de ambos tipos de VIH, mientras que tres antgenos son pptidos o protenas del env, especficas para el VIH-1 o el VIH-2. Los antgenos se posicionan separadamente a concentraciones fijas y libres de los antgenos tisulares, los cuales pueden contaminar las preparaciones de antgenos a partir de lisados vrales comnmente usados en los anlisis Western blot. 60434002/S6/OR

Reaccin enzimtica de color; 10 min

sustrato cromognico

Figura 1. Princio de la prueba


El kit incluye un control positivo (anticuerpos anti VIH-1 y VIH-2) y un control negativo que debe incluirse en cada corrida del anlisis. Al terminar la prueba, el par de dientes usados con el control positivo debe mostrar todos los 6 puntos gris-azulados, y aquella usada con el Control Negativo debe indicar nicamente el punto de control interno. El punto de control interno tambin debe aparecer en todos los dems dientes para confirmar que el kit funciona adecuadamente y que la prueba ha sido desarrollada de forma correcta.

Contenido del kit Peines


El kit contiene tres peines plsticos, cada peine tiene 6 pares de dientes, un par para cada prueba (Figura 2). Ambos dientes de un par llevan nmeros idnticos. Cada par de dientes est sensibilizado en seis reas reactivas: Posicion El diente izquierdo En el diente derecho Superio Inmunoglobulina Humana (Control Interno) Media Glipropotena recombinante derivada de env-VIH-1 la gp 120. Protena recombinante del core Glicoproteina env gp 41 derivada de pptidos derivada de gag la p24 sintticos VIH-1 de la (reconocidas por los anticuerpos al ViH-1 y al VIH-2) transmembrana

Gliproproteina env Inferior Proteina derivada de pol recombinante p31(reconocidas transmembrana VIH-2 por los anticuerpos al VIH-1 y al peptido sinttico Derivado de gp36 VIH-2)

ImmunoComb II
34 34 34 34 34 34

Almacenamiento del kit


Almacene el kit en su caja original entre 2 y 8 C. Bajo estas condiciones, el kit permanecer estable hasta la fecha de vencimiento en la etiqueta. No congele el kit.

Manejo de las Muestras


Interno Control p24 p31 gp120 gp41 gp36

Figura 2. Peine
Los peines se suministran en empaque de aluminio que contiene una bolsa de secante.

Bandejas de Desarrollo
El kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo, con unacubierta de aluminio, cada Bandeja de Desarrollo contiene todos los reactivos necesario para la prueba. La Bandeja de Desarrollo consta de 6 filas (A-F). La fila A se divide en 6 pozos, mientras que las dems filas se dividen en 12 pozos cada una. El contenido de cada fila es el siguiente: Fila A Fila B Fila C Fila D Fila E Fila F diluyente de la muestra solucin de lavado anticuerpos anti-IgG humanos de cabra marcados con fosfatasa alcalina. Solucion de lavado Solucion de lavado solucin de substrato cromognico que contiene 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro azul tetrazolio (NBT).

Es posible usar suero o plasma en la prueba. Las muestras pueden ser almacenadas por 7 das a temperaturas de 2 a 8C antes de la prueba. Para almacenar las muestras por ms de 7 das, conglelas a -20C o a temperaturas ms bajas. Todas las muestras congeladas deben centrifugarse a 10.000 rpm, por 5 minutos a temperatura ambiente. Remover cuidadosamente el lquido sobrenadante. Si se forma una capa de lpidos en la superficie, asegurese de tomar la muestra del lquido claro debajo de la capa. Evite congelar y descongelar repetidamente. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sdico no han mostrado tener efecto sobre los resultados del test. Procedimiento de la Prueba Equipo Necesario. Pipeta de precisin con puntas desechables para dispensar 50 ul. Tijeras. Cronmetro o reloj de laboratorio.

Preparacion de la Prueba
Lleve todos los componentes, bandejas de desarrollo, peines, reactivos y muestras a temperatura ambiente (22 a 26C). y desarrolle la prueba a temperatura ambiente. 1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37C durante 30 minutos; o djela a temperatura ambiente (22 a 26C), durante 3 horas. 2. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente para poder desecharlo como desperdicio bio-contaminante al final de la prueba. 3. Mezcle los reactivos agitando la Bandeja de Desarrollo. NOTA: No remueva la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo. Rompa la cubierta del estuche usando una punta desechable de la pipeta o el perforador, nicamente cuando las instrucciones de la prueba as lo indiquen. Preparacin del peine.

Figura 3. Bandeja de Desarrollo


Control positivo-1frasco (tapa de color rojo) de 0.4 mL de plasma positivo humano diluido para anticuerpos anti-VIH-1 y anti-VIH-2, inactivados mediante la adicin de b-propiolactona y por tratamiento de calor. Control negativo-1 frasco (tapa de color verde) de 0.4 mL de plasma humano inactivado por calor diluido, negativo para anticuerpos al VIH. Perforador-para perforacin de la cubierta de aluminio que cubre los pocillos de la bandeja de desarrollo.

Seguridad y Precauciones
El kit es nicamente para uso de diagnstico in-vitro. Maneje el Control Positivo como si fuese potencialmente infeccioso e incluso cuando haya sido inactivado. Todos los dems materiales de origen humano usados en la preparacin de los controles fueron probados y se encontr que no eran reactivos para antgeno de superficie de la Hepatitis B, para anticuerpos al virus de Hepatitis C y al virus del VIH. Debido a que ningn mtodo de prueba puede proporcionar una seguridad completa de la ausencia de contaminacin viral, todas las soluciones de referencia y todos las muestras humanas deben manejarse como potencialmente infecciosos. Use siempre guantes quirrgicos y ropa de laboratorio. Siga los procedimientos de laboratorio aceptados para trabajar con suero o plasma humano. No pipetee con la boca. Deseche todos las muestras, peines usados*, Bandejas de Desarrollo, y otros materiales usados con el kit como desechos bio-contaminante.
* A menos que sea archivado para consulta posterior

Precaucion Para asegurar un funcionamiento adecuado de la prueba, no toque los dientes del peine. 1. Abra el empaque de aluminio del peine por el borde punteado. Remueva el peine. 2. Usted puede usar todo el peine y la Bandeja de Desarrollo solamente una parte de ellos. Para usar una sola parte del peine haga lo siguiente : a. Determine cuantos pares de dientes necesita para probar las muestras y controles. Usted necesita solo un par dientes para cada prueba. Cada par de dientes muestra el nmero de cdigo 34 del kit para permitir la identificacin de los dientes desprendidos. b. Doble y rompa el peine verticalmente o crtese con tijeras (vase figura 4), para desprender el nmero requerido de pares de dientes (nmero de pruebas incluyendo 2 controles). c. Devuelva la parte no usada del peine al empaque de aluminio (con la bolsa de secante). Cierre y ajuste el empaque. Por ejemplo, con un gancho para papel, para mantener seco el empaque. Almacene el peine en la caja del kit original a 2-8C para uso posterior.
ImmunoComb II
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Figura 4. Fraccionamiento del Peine

No mezcle los reactivos de lotes diferentes. No use el kit despus de la fecha de vencimiento.

Instrucciones de la prueba
Reaccin Antgeno-Anticuerpo (fila A de la Bandeja de Desarrollo). 1. Pipetee 50 ul de la muestra. Perfore la cubierta de aluminio en el pozo de la fila A de la Bandeja de Desarrollo con la punta de 2

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la pipeta o con el perforador y dispense la muestra en el fondo del pozo. Mezcle vaciando y rellenando repetidamente la solucin. Deseche la punta de la pipeta. Repite el psoe 1 para los otras muestras, incluyendo un Control Positivo y un Control Negativo suministrado con el kit. Use un pozo nuevo en la fila A y cambie las puntas de la pipeta para cada muestra o Control. a. Inserte el peine (la parte impresa frente a Usted) en los pozos de la fila A que contienen las muestras y controles. Mezcle: retire e inserte el peine en los pozos varias veces. b. Deje el peine en la fila A durante exactamente 30 minutos. Active el cronmetro. Al aproximarse a los 30 minutos, perfore el papel de aluminio en la fila B usando el perforador. No abra ms pozos de los necesarios. c. Al final de los 30 minutos, tome el peine y squelo de la fila A. Absorba el lquido adherido a las puntas de los dientes sobre papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal de los dientes. Primer lavado (fila B). Inserte el peine en los pozos de la fila B. Agite: retire e inserte vigorosamente el peine en los pozos durante por lo menos 10 segundos para lograr un lavado adecuado. Repita el agitamiento varias veces durante el transcurso de 2 minutos; mientras tanto perfore el papel aluminio de la fila C. Despus de 2 minutos, retire el peine y absorba el lquido adherido como en el paso 3c. Unin del conjugado (fila C). Inserte el peine en los pozos de la fila C. Mezcle tal como en el paso 3a. Active el cronmetro durante 20 minutos. Perfore el papel de aluminio de la fila D. Despus de 20 minutos, retire el peine y absorba el lquido adherido. Segundo lavado (fila D). Inserte el peine en los pozos de la fila D. Agite repetidamente durante 2 minutos, tal como en el paso 4. Mientras tanto perfore el papel de aluminio de la fila E. Despus de 2 minutos retire el peine y absorba el lquido adherido. Tercer lavado (fila E) Inserte el peine en los pozos de la fila E. Agite repetidamente durante 2 minutos, mientras tanto perfore el papel de aluminio de la fila F, despus de 2 minutos, retire el peine y absorba el lquido adherido. Reaccin de Color (fila F) Inserte el peine en los pozos de la fila F. Mezcle. Active el cronmetro durante 10 minutos. Despus de 10 minutos retire el peine. Detencin de la Reaccin (fila E). Inserte nuevamente el peine en la fila E. Despues de 1 minuto, retire el peine y deje secar al aire. Diposicion de Desechos Deseche las bandejas de desarrollo, puntas de pipeta, papel absorbente, y guantes como desechos bio-contaminantes

Contro Positivol

Contro Negativol

Resultados Invlidos

Figura 5. Validacin de la prueba

Interpretacin de los Resultados


La sola aparicin del control interno indica que la muestra correspondiente es negativa para los anticuerpos VIH-1 o VIH-2. Una muestra que produce solamente un punto circular aislado, coloreado de antgeno VIH, o ambos puntos, p24 y p31 sin un punto en el diente derecho, se considerada indeterminada. Una muestra que produce mnimo 2 puntos circulares coloreados de antgenos de VIH, incluyendo uno que representa al gp41 o al gp36 (vase figura 2) se define como VIH positivo. En stos caso la diferenciacin entre el VIH-I y el VIH-2 puede obtenerse de la siguiente forma: Ausencia de un punto para el gp36 y presencia del gp41 y/o gp120 indica que la muestra es positiva para los anticuerpos VIH-1. Presencia de un punto para el gp36 indica que la muestra es positiva para los anticuerposl VIH-2. Los patrones ms prevalentes y su interpretacin se resumen en la tabla 1.

Tabla 1. Interpretacin de los resultados.


Puntos de HIV presentes en Diente izquierdo Diente derecho p24 y/o p31 gp41 Sin punto gp41 y gp120 p24 y/o p31 gp36 solo o con gp41 p24 y/o p31 p24 y/o p31 Sin punto Sin punto gp36 y gp41 y gp120 Sin punto o gp120 gp41 o gp120 y/o gp36 Sin punto } Interpretacion Positivo HIV-1 HIV-2 HIV-2 solo , o Coinfeccin con HIV-1 Indeterminate Negativo

Importante Cualquier punto ligeramente coloreado en los dientes debe interpretarse como reactiva. En caso de resultado indeterminado, tome una nueva muestra de sangre y repita la prueba. Documentacin de los resultados Debido a que el color desarrollado sobre el peine es estable, los peines pueden almacenarse para documentacin.

Limitaciones
El InmunoComb II VIH 1 & 2 CombFirm es un anlisis suplementario dirigido a confirmar la presencia de los anticuerpos a los antgenos de VIH en las muestras inicialmente reactivas. En ausencia de criterios uniformemente aceptados para la interpretacin de los perfiles de VIH, la interpretacin arriba descrita debe considerarse como una gua recomendada. De todas formas, la reactividad para anticuerpos para el VIH-1 y VIH-2 no debe considerarse como un criterio nico para el diagnstico del Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) o para la infeccin con el VIH. Debido a que la produccin de anticuerpos puede retrasarse despus de la exposicin inicial al VIH o puede suprimirse debido a una condicin inmunocomprometida de un paciente, un resultado negativo con sta prueba no debe considerarse como evidencia concluyente de que el paciente no ha estado expuesto o ha sido infectado por el VIH.

Almacenamiento partes no usadas del kit


Bandeja de Desarrollo Si usted no us todos los pozos de la bandeja de desarrollo, puede almacenarla para uso posterior: Selle los pozos usados con cinta adhesiva ancha de manera que no se derrame nada por fuera del pozo, incluso si la bandeja de desarrollo se voltea. Otros materiales del kit Vuelva a colocar la Bandeja de Desarrollo, Peines, perforador, controles y las instrucciones en la caja originaldel kit. Almacene de 2 a 8C.

Resultados de la prueba Validacin


Para confirmar que todas las pruebas funcionan adecuadamente y demuestran que los resultados son vlidos, deben cumplirse las siguientes tres condiciones (vase figura 5). El Control Positivo debe producir 6 puntos de color azul grisceo sobre la superficie del peine en el par de dientes. 2. El control negativo debe producir una punto superior (control interno) en el diente izquierdo del par y ningun otro punto. 3. Cada muestra probada debe producir una punto superior (control interno) en el diente izquierdo del par. Si ninguna de estas tres condiciones se cumplen, los resultados son invlidos, y las muestras y controles deben volverse a probar. 1.

Caractersticas del Ensayo*


Un estudio multicntrico se ha llevado a cabo en 559 muestras incluyendo 154 individuos VIH negativos, 318 pacientes VIH-1 positivos, 35 pacientes que fueron positivos con el examen ELISA e indeterminados (Ind) para VIH-1por el anlisis Western blot (WB), tanto como 52 individuos que fueron positivos por el examen ELISA y negativos con el WB. La poblacin negativa incluy mujeres embarazadas, personas con enfermedades auto-inmunes y con infeccin de Hepatitis. Los resultados estan detallados en la siguiente tabla 2.
*Datos detallados se suministran bajo solicitud.

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Tabla 2. Estudio Multicntricoa


HIV-1 Condicin ELISA WB Negativo Positivo
A B

Negativo Positivo Ind. Negativo

ImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm Negative HIV-1 Ind. Positive 150 0 4 2 305 12 b 20 6 9 44 1 7

Leyenda de los smbolos


CARD PLATE CONTROL + CONTROL

ImmunoComb tarjeta Bandejas de Desarrollo Control positivo Control negativo Perforador Consulte las instrucciones de uso Atencin,ver instrucciones de uso

Resultados preliminares incluyendo 6 WB que muestran nicamente p17 o p55.

Se calcularon las caractersticas del ensayo, encontrndose los siguientes reultados inequvocamente negativos o positivos. Sensibilidad - 99.7% Especificidad - 100% B. MUESTRAES DE PACIENTES DE ORIGEN AFRICANO Se llevo a cabo un estudio en muestras de individuos de origen africano. La poblacin consisti de 48 individuos VIH negativos, 51 pacientes infectados con VIH-1, 84 infectados con VIH-2, y 9 coinfectados con VIH-1 y VIH-2. Los resultados se detallan en la tabla 3.

PERFORATOR

IVD

Producto sanitario para diagnstico in vitro Limite de temperatura

Tabla 3. Especmenes de origen africano


HIV Condicion
a

Contenido suficiente para n ensayos Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea

Positivo

Negativo HIV 1 HIV 2 HIV1 + 2

ImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm Neg. HIV 1 HIV 2 HIV Ind. 1+2 48 0 0 0 0 0 51 0 0 0 b 0 0 70 10 4 0 0 0 9 0

REF LOT

Nmero de catlogo Cdigo de lote Fecha de caducidad Nmero de serie

A B

Por ELISA y WB Reactivo solamente con el gp36.

Los datos, excluyendo resultados indeterminados, muestran un 100% de sensibilidad y especificidad para el VIH. Todos las muestras VIH-1 positivas, incluyendo 5 con el subtipo O, fueron correctamente identificados. Entre las muestras VIH-2 positivas 10 mostraron reaccin cruzada contra el gp120, rmostrando una especificidad diferencial general del 93.8%

Bibliografia
Centers for Disease Control. 1989. Interpretation and use of the Western Blot assay for serodiagnosis of Human Immunodeficiency Virus type 1 infections. MMWR 38 (S-7): 1-4. Dax EM. 1993. HIV testing and staging, disease progression, and markers. Curr Opinion Infect Dis 6:191-199. Groopman JE, Chen FW, Hope JA, Andrews, JM, Swift RL, Benton CV, Sulllivan JL, Volberding PA, Sites DP, Landesman S, Gold J, Baker L, Craven D, Boohes FE. 1986. Serological characterization of HTLV-III infection in AIDS and related disorders. J Infect Dis 153:736742. Higgins JR, Pederson NC, Carlson JR. 1986. Detection and differentiation by sandwich enzyme-linked immunosorbent test for human T-cell lymphotropic virus III, lymphadenopathy-associated virus (LAV) and acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus-like clinical isolates. J Clin Microbiol 24:424-430. Jackson JB testing for human , Balfour HH. 1988. Practical diagnostic immunodeficiency virus, Clin Microbiol Rev 1:124-138. Lacroix M, Penney CL, Dwyer RJ, Stern MD, Bellini F, Dionne G, Tsoukas C. 1989. A peptide-based microtiter ELISA kit for the detection of antibodies to HIV-1 and to HIV-2, Fifth International Conference on AIDS. Montral. W.B.P.111. Gnann Jr,JW, McGormick JB, Mitchell S,Nelson JA, Oldstone. 1987. Synthetic peptide immunoassay distinguishes HIV type 1 and type 2 infections. Science 237:1346-1349. Myers RA, Patel JD, Joseph JM. 1992. Identifying HIV-2-seropositive individuals by reevaluating HIV-1 indeterminate sera. J Acquir Immunedef Syndr 5:417-423. Sarngadharan MG, Veronese F, Lee S, Gallo RC. 1985. Immunological properties of HTLV-III antigens recognized by sera of patients with AIDS and AIDS-related complex and of asymptomatic carriers of HTLV-III infection. Cancer Res 45:4574s-4577s.

Version: 60434002/S6/OR (05/2009)

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Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba

2
Tomar las muestras y controles

3
Agregar muestras y controles en la fila A. Mezclar Sacar el Peine del empaque

Preincubacin de la Bandeja de Desarrollo: 3 hrs. a temperatura ambiente o 20 min. a 37C

5
Insertar el Peine y mezclar en la fila A. Incubar Perforacin de la fila B

8
Insertar Peine y agitar en la fila B. Incubar

Absorber liquido adherido a los dientes

Despus de mezclar/agitar e incubar en filas C, D y E...

10
Resultados

Reaccin de color en la fila F

Resumen del Procedimiento de la Prueba


Las instrucciones abreviadas a continuacin son para personas experimentadas en el uso del kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 CombFirm. (Para instrucciones detalladas favor de referirse al texto completo) 1. 2. 3. Ponga todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente y realice la prueba a temperatura ambiente. Vierta 50 l de cada muestra y control en pocillos separados de la fila A de la Bandeja de Desarrollo y mezcle. Inserte el Peine en la fila A y contine segun se describe en la Tabla 1:

Tabla 1. Resumen del Procedimiento de la Prueba Paso Reaccin antgeno-anticuerpo Lavado Unin del Conjugado Lavado Lavado Reaccin de Color Detencin de la reaccin Fila A B C D E F E Proceda como se indica Mezcle; incube 30 minutos; absorba. Agite; incube 2 minutos; absorba. Mezcle; incube 20 minutos; absorba. Agite; incube 2 minutos; absorba. Agite; incube 2 minutos; absorba. Mezcle; incube 10 minutos. Incube 1 minuto; seque al aire.

2
Manera de romper el Peine

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