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Microbiologa de los Alimentos

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La persistencia de Salmonella entrica fro durante la deshidratacin y posterior almacenamiento

Nadia Gruzdev a, b, Riky Pinto A, Shlomo Sela (Saldinger) a, *
un

Microbiano Inocuidad de los alimentos Unidad de Investigacin, Departamento de Calidad y Seguridad Alimentaria, Instituto de Post-cosecha y Ciencias de la Alimentacin, la Organizacin de Investigacin Agrcola (ARO), El Centro Volcani, POB 6, Bet Dagan 50250, Israel b Departamento de Bioqumica y Ciencias de la Alimentacin, Robert H. Smith de la Facultad de Agricultura, Alimentacin y Medio Ambiente, de la Universidad Hebrea, Rehovot, Israel

Artculo Informacin

de

RESUMEN
A pesar de que Salmonella enterica serotipo Typhimurium SL 1344 ha servido como un patgeno modelo en muchos estudios, informacin sobre su respuesta desecacin es an escasa. En este estudio, se investigaron las condiciones ambientales que afectan a la supervivencia de Salmonella despus del almacenamiento en fro y posterior deshidratacin, utilizando un modelo de poliestireno de 96 pocillos. El SL 1344 cepa mostraron alta supervivencia en comparacin con otras cepas y serotipos typhimurium S. enterica. Adems de la caracterizacin de la tolerancia a la desecacin en esta cepa revel que la temperatura, la fase estacionaria de crecimiento, medio slido, y la presencia de concentraciones crecientes de NaCl (0,5 e 5,0%) en el medio de crecimiento mejorada desecante-cacin tolerancia. La deshidratacin a pHs bsicos (8 e 10), o en trehalosa, sacarosa, pero no en glicina -betana, la mejora de la persistencia bacteriana. Salmonella deshidratadas sobrevivieron ms de 100 semanas a 4 1C con una w 5-log de reduccin en nmeros. Sin embargo, la tincin de viabilidad revel slo una w 50% de reduccin en las clulas viables, lo que sugiere bacteriana transicin a un estado viable -pero-no-cultivable (VBNC). La adicin de cloranfenicol redujo la supervivencia bacteriana lo que implica que la adaptacin al estrs desecacin requiere la sntesis de novo de protenas. En consonancia con esta fi nding, acortando el tiempo de deshidratacin como resultado una menor supervivencia. Este estudio pone de rel ieve el impacto de las condiciones ambientales sobre la suerte de Salmonella en los alimentos secos cadena y destaca el potencial transicin del patgeno para el estado VBNC.
2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

Historia del artculo: Recibido el 24 de noviembre 2011 Recibido en forma revisada 05 de agosto 2012 Aceptado 06 de agosto 2012 Disponible en lnea 24 de agosto 2012 Palabras clave: Salmonela Desecacin Viable-pero-no-cultivable Persistencia De almacenamiento en fro

1. Introduccin Salmonella enterica es el agente causante de salmonelosis, una enfermedad que van desde gastroenteritis leve y diarrea, la fiebre y la muerte. La mayora de los brotes de salmonelosis resultado del consumo de productos animales y lcteos, pero la enfermedad tambin puede transmitirse a travs de frutas y hortalizas contaminadas o agua (Brandl, 2006; Tauxe, 1991). La reduccin de la disponibilidad de agua en los alimentos es un mtodo largamente establecida para controlar el crecimiento bacteriano, ya que la mayor deterioro y especies patgenas no pueden crecer en condiciones de baja actividad de agua-condiciones (Fennema, 1985). Sin embargo, algunos brotes de salmonelosis grandes multi-estatales e internacionales se han asociado con alimentos de bajo contenido de agua, como el chocolate, aperitivos, almendras, pimiento rojo y negro, mantequilla de man y leche deshidratados para lactantes (Annimo, 2007, 2010b; Isaacs et al ., 2005;

Abreviaturas: CFU, unidad formadora de colonias; DT, tolerancia deshidrataci n; LTP, a largo trmino persistencia; humedad RH, relativo, agua SDDW, agua estril bidestilada. * Autor para correspondencia. Tel.: 972 3 9683750, fax: 972 3 9683692. E-mail: shlomos@volcani.agri.gov.il (S. Sela (Saldinger)). 0740-0020 / $ e ver texto preliminar 2012 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados. http://dx.doi.org/10.1016/j.fm.2012.08.003

Rowe et al, 1987;. Shohat et al, 1996;. Werber et al, 2005).. Salmonella ocasionalmente se han detectado en granola, pistacho y maz escamas (Annimo, 2008, 2009, 2010a). Los estudios tambin han demostrado la capacidad de Salmonella para sobrevivir por perodos prolongados en cscaras de huevo (Messens et al., 2005), granos de almendras (Uesugi et al., 2006) secar las materias primas de c onfitera (Komitopoulou y Pealoza, 2009), as como en superficies secas o secado (de Cesare et al, 2003;.. Hiramatsu et al, 2005) y el suelo seco (Bernstein et al, 2007;. Zibilske y Weaver, 1978). Algunos de estos estudios revel el papel crtico de la temperatura de almacenamiento en Salmo-nella persistencia. Salmonella fue capaz de sobrevivir a ms de 550 das en granos de almendras durante el almacenamiento a 20 y 4 1 C sin signifi reduccin significativa en el tamao de la poblacin, sin embargo 550 das de almacenamiento a 23 y 35 1 C result en una w 4 log de reduccin y la erradicacin total, respectivamente (Uesugi et al., 2006). Cepas de Salmonella inoculada en mitades de pacanas (Beuchat y Heaton, 1975) y en la mantequilla de man o mantequilla de man (spreads Burnett et al., 2000), tambin mostr una mayor supervivencia a los 5 1C en comparacin con el 21 1C. Adems, Salmonella sec sobre discos de papel sobrevivieron durante 24 meses a 4 1 C, mientras que la supervivencia fue limitado a 35 y 70 das a 25 y 35 1C, respectivamente (Hiramatsu et al., 2005). A largo plazo temperaturas de almacenamiento de

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varios productos de bajo contenido de agua oscila entre 4 1 C a la temperatura ambiente temperatura, sin embargo, el almacenamiento a 4 1C se recomienda con el fin de alargar su vida til en entornos domsticos (Heldman y Hartel, 1997). Estudios previos han puesto de relieve la importancia de la cepa especi fi ciudad en la evaluacin de la tolerancia Salmonella en ambientes de baja actividad de agua (Mattick et al., 2000). Mientras que la S. enterica serotipo Typhimurium cepa SL 1344 es ampliamente utilizado como un patgeno modelo en numerosos estudios, la informacin relativa a su persistencia durante la desecacin es an escasa. Anteriormente, hemos examinado el efecto de desecacin sobre la tolerancia de S. typhimurium SL 1344 a otros tipos de estrs (Gruzdev et al., 2011). En el presente estudio, se carac-zados los factores ambientales que afectan a S. typhimurium SL 1344 tolerancia deshidratacin y seguido durante persistencia posterior almacenamiento a largo plazo a baja temperatura. 2. Materiales y mtodos 2,1. Cepas bacterianas, la preparacin del inculo y condiciones de crecimiento Cepas bacterianas utilizadas en este estudio se describen en la Tabla 1. Las cepas de Salmonella se hicieron crecer en xilosa lisina desoxicolato (XLD) agar (Difco Laboratories, Sparks, MD). Para la mayora de experimentos de rehidratacin deshi-, una colonia bacteriana fresca se extendi sobre LB LuriaBertani (LB) (Lennox, Difco Laboratories) placas de agar con un hisopo estril y se incubaron durante 20 horas a 37 1 C. Cuando se indica, las placas se incubaron a 25 1 C durante 60 h. Estas condiciones de crecimiento result en nmeros comparables de unidades formadoras de colonias (CFU) por placa (datos no mostrados). Las clulas se recogieron mediante resuspensin en agua estril doble desionizada (agua SDDW) utilizando una goma de polica estril, se lavaron tres veces en agua SDDW (3800 g 5 min) a temperatura ambiente, y el fi nal sedimento se resuspendi en agua SDDW a una fi nal de concentracin w 2,0 109 CFU / ml (OD600-1.0). En algunos experimentos, las bacterias se cultivaron en placas de LB sin sal (LBNS; 1,0% de Bacto-triptona, 0,5% de extracto de levadura; Difco Laboratories), o suplementados con 0,5, 1,0 o 5,0% de NaCl. Para la evaluacin de la tolerancia desecante-cin de caldo cultivado bacterias, una colonia de Salmonella solo
Tabla 1 Las cepas bacterianas utilizadas en el estudio. Colar # 311 316 317 321 Designacin de la cepa Salmonella enterica sv. Typhimurium SL 1344 SMR Salmonella enterica sv. Typhimurium Rq18933T Salmonella enterica sv. Typhimurium grupo-2 Salmonella enterica sv. Typhimurium grupo-2 Aislado Laboratorio tensin Aves Aves Aislado clnico Previsto M. Brandl (USDA, ARS, WRRC) A. Lublin (Veterinaria instituto, Bet Dagan) A. Lublin (Veterinaria instituto, Bet Dagan) Ministerio israel de Salud (Central Laboratories, Jerusaln) Ministerio israel de Salud (Central Laboratories, Jerusaln) Ministerio israel de Salud (Central Laboratories, Jerusaln) Ministerio israel de Salud (Central Laboratories, Jerusaln) M. Brandl (USDA, ARS, WRRC) Ministerio israel de Salud (Central Laboratories, Jerusaln)

se inocul en 5 ml de caldo LB y se incub a 37 1 C con aireacin. Early-, registro medio y estacionaria bacterias fase de crecimiento se recogieron a las 1,5, 3 y 20 h, respectivamente. Las bacterias se lavaron y se resuspendieron en agua SDDW a una fi nal de concentracin w2,0 109 CFU / ml, como se describi anteriormente. 2,2. Condiciones de deshidratacin y largo plazo del ensayo persistencia Cincuenta microlitros de bacterias ( w108 CFU) se deshidrataron en 96 y placas de poliestireno durante 22 horas a 25 1C y 40% de humedad relativa (HR) en una incubadora con temperatura controlada (CLIMACELL, MMM Group; Munich, Alemania). El nmero de clulas supervivientes despus de desecante-cacin en los tiempos designados durante el almacenamiento en fro se determin como sigue: las bacterias secas se recuperaron mediante la adicin de 100 m l de agua SDDW y 5 min de incubacin a temperatura ambiente. Las bacterias se resuspendieron mediante pipeteo vigoroso, y el recuento de viables se determinaron como se ha descrito previamente (Gruzdev et al., 2011). Tolerancia deshidratacin (DT) se calcul como el porcentaje de bacterias viables a las 22 h; el nmero de bacterias en el tiempo cero (antes de la desecacin) se consider 100%. Para la prueba de persistencia a largo plazo (LTP), las placas secas se colocaron en un refrigerador (4 1C, 40eRecuentos de 45% de humedad relativa) y viables se determin despus del almacenamiento a 2, 4, 8, 12 semanas. En algunos casos, el tiempo de incubacin fue extendida hasta 100 semanas. LTP se expres como el recuento viable total (UFC) de bacterias sobrevivientes en cada punto de tiempo. Para modificar el tiempo necesario para conseguir la desecacin completa, una cant idad i gu al d e b act erias (1 08 CFU / p oci llo) s e su spend i en la dis minu cin d e los vol men es de agu a SDDW (5 0, 25, y 15 m l) y se seca, como se describe anteriormente. Bajo estas condiciones, la deshidratacin completa de los pocillos se logr en 22, 11, y 6,5 h, respectivamente. Deshidratacin completa se determin sobre la base de la actividad del agua medidatos, como se describe anteriormente (Gruzdev et al., 2011). 2,3. La deshidratacin en diferentes condiciones ambientales Antes de la deshidratacin, las clulas se resuspendieron en agua SDDW que tena han ajustado a valores de pH de 3 a 11 mediante la adicin de HCl o NaOH. Los experimentos de control incluyen suspensiones bacterianas (no deshidratado) se incubaron durante 22 h en los mismos valores de pH. En otros casos, las bacterias se resuspendieron en diferentes medios (caldo LB, o 100 mM de cualquiera de trehalosa, sacarosa o g licina betana-) antes de la deshidratacin. Para probar el efecto de cloranfenicol en DT y LTP, las bacterias fueron deshidratados en agua SDDW suplementado con cloranfenicol (30 mg / ml). 2,4. La viabilidad de tincin Clulas secas de Salmonella se resuspendieron en 100 m l agua SDDW como se ha descrito anteriormente. Las clulas se centrifugaron (3000 g, 5 min) y el sedimento se resuspendi en 30 m l de solucin de tincin y se tieron segn el fabricante ' s d e i n s t ru cci on es ( LIV E / D E A D BacLight kit de viabilidad bacteriana; sondas moleculares; Eugene, Ore -gon). Agua SDDW-lavado las clulas de Salmonella frescos (antes de la deshidratacin) se tieron de manera similar. Las clulas teidas se visualizaron bajo un lser confocal de barrido microscopio (Olympus IX81, Tokio, Japn). El porcentaje de viabilidad se calcul dividiendo el nmero de viables (verde) clulas por el nmero total de vivo (verde) y muertas (rojas) de las clulas bacterianas. Los datos se obtuvieron a partir de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Cada replica incluido datos de cuatro microscpico fi(ELDs400). 2,5. Condiciones de recuperacin Para determinar el efecto de medio de recuperacin, las clulas deshidratadas se incubaron durante 90 min a 25 o 37 1C en agua SDDW, caldo LB,

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Salmonella enterica sv. Typhimurium 1Epsilon

Aislado clnico

324

Salmonella enterica sv. Typhimurium DT104

Aislado clnico

301

Salmonella enterica sv. Enteritidis B 249-01

Aislado clnico

312 916

Salmonella enterica sv. Newport MB 17 RM 1655 Salmonella enterica sv. Infantis C-1

Semillas de alfalfa Aislado clnico

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trptica caldo de soja (TSB; Difco Laboratories), y la infusin de cerebrocorazn (BHI) (Acumedia Manufacturas; Baltimore, Maryland). Despus de la incubacin el nmero de bacterias supervivientes (CFU) fue determinado, como se ha descrito anteriormente (Seccin 2,2). 2,6. El anlisis estadstico Todos los experimentos se realizaron por triplicado, a menos que se se indica, y los resultados se presentan como valores medios con desviaciones estndar. Comparacin de los medios de DT y LTP se realiz por medio de un anlisis de la varianza (ANOVA) y Tukey e Kramer comparaciones de mltiples pruebas utilizando GraphPad software Instat3 (GraphPad Softwa re Inc., La Jolla, CA). Las diferencias se consideraron signifiperalte en P < 0,05. 3. Resultados y discusin 3,1. DT y LTP en cepas de S. enterica otro DT de la cepa SL 1344 se compar con fi ve diferente S. Typhicepas Murium y tres otros serotipos de S. enterica (Tabla 2). Log10 CFU reduccin deshidratacin siguiente (tiempo 0) fue variable entre las cepas diferentes, que van de 0,31 0,25 log UFC de cepa # 311 (SL 1344) a 2,12 0,44 log UFC de cepa # 323. De igual modo, signi fi diferencias significativas entre las cepas se observ durante todo el periodo de almacenamiento a 4 1C, que van desde 1,32 0,37 log CFU reduccin de la cepa n 311 a 6,50 0,43 log CFU reduccin de la cepa n 323, a las 12 semanas. Los otros tres serotipos de S. enterica similar sobrevivieron 22 h de deshidratacin, sin embargo, diferan en LTP durante el almacenamiento en fro. Mientras serotipo Enteritidis y Newport tenido reducciones comparables de registro de UFC a las 12 semanas (1,20 0,44 log CFU y 1,84 0,74 log UFC, respectivamente), serotipo Infantis era mucho ms susceptibles, y tena un 3,2 0,50 log CFU reduccin a las 12 semanas. Nuestros datos sugieren que la S. typhimurium SL 1344 cepa exhibe DT alta en comparacin con las cepas de Typhimurium otros y de los tres serotipos de S. enterica. En general, una gran variabilidad tanto en DT y LTP se ha observado entre los diferentes serotipos de Salmonella, as como dentro de un nico serotipo (Typhimurium). Los hallazgos que DT y LTP posterior almacenamiento en fro son de tensin especificados fic coinciden con algunas variaciones informes anteriores del estudio de la respuesta de Salmonella a baja actividad de agua entornos (Mattick et al., 2000). 3,2. Efecto de la fase de crecimiento y en medio slido DT y LTP durante almacenamiento en fro N u m e r o s os es t u d i o s h an i n fo r m a d o d e q u e l a fa s e es t a c i on a r i a bacterias estn ms adaptados a las mltiples presiones en comparacin con

fase logartmica bacterias (Meng et al, 2008;.. Navarro Llore ns et al, 2010; Rychlik y Barrow, 2005). Esta caracterstica ha sido atribuirse principalmente a la induccin de la rpoS regulon -estrs (Hengge-Aronis, 1996;. Navarro Llorens et al, 2010), que controla varios genes de respuesta al estrs. De hecho, la expresin de rpoS se ha demostrado previamente ser esencial para la tolerancia a la desecacin ptima en Salmonella (Jorgensen et al., 2000). Para probar el efecto de la fase de crecimiento en la DT y LTP, principios de log-y la fase estacionaria S. typhimurium SL 1344 se deshidrataron como se ha descrito anteriormente (Seccin 2,2). En paralelo, DT y LTP se ensayaron tambin para las bacterias de agar LB-cultivadas (Fig. 1). Clulas en fase estacionaria exhibido signi f i s i g n i fi c a t i v a m e n t e ( P < 0,05) DT mayor d e s h i d r a t a c i n s i g u i e n t e ( 3 9 , 2 3 ,4 %) en comp araci n con los p ri meros -y el regi s t ro d e med i ad os d e b act eri as (6 ,2 2,3% y 6,4 3,2%, respectivamente), sin embargo, las bacterias de agar cultivadas parecen sobrevivir incluso mejor (52,5 8,8%). Asimismo, LTP fue mxima para las bacterias cultivadas en agar-y mnima para la fase de registro clulas (Fig. 1). Cultivos estacionarios similares a Salmonella, Enterobacter fase de sakazakii y varias bacterias probiticas se inform a mostrar una mayor resistencia a la desecacin de cultivos en fase de inicio de sesin (Breeuwer et al, 2003;. Meng et al, 2008.). Curiosamente, las clulas de Salmonella en medio slido eran ms tolerantes al almacenamiento en fro deshidratacin y posteriormente frecuente de lo c ultivadas en caldobacterias. Esto podra ser correlacionada con la reciente fihallazgos que en la transicin de lquido a un medio slido, las clulas crecido exponencialmente, inducen la expresin de varios de respuesta al estrs regulons (Cuny et al., 2007). Este aumento de la tolerancia tambin podra estar asociado con la biofi crecimiento lm Caractersticas de los slidos de cosecha propia bacteria. Durante mucho tiempo se ha establecido que los bio fi clulas LM son fisiolgicamente ms adaptado a las t ensiones ambientales que sus contrapartes planctnicos (Rmling, 2005; Scher et al., 2005). 3,3. Efecto de las condiciones de crecimiento en DT y LTP durante el almacenamiento en fro Las condiciones de cultivo pueden influir en la respuesta al estrs bacteriano debido a las diferencias en la expresin gnica o la exposicin al estrs, que pueden inducir tolerancia cruzada a otros tipos de estrs (Abee y Wouters, 1999; Rychlik y Barrow, 2005; Schimel et al, 2007;. Vorob ' eva, 2003). S. Typhimurium crecido a 37 1 C presentaron un mayor DT comparado con el 25 1 C e bacterias cultivadas (49,7 12,7% frente 12,0 5,5%). Por otra parte, la PLP parece ser similar a las bacterias cultivadas a ambas temperaturas (Fig. 2). En un estudio reciente (White et al., 2006) se inform de que la Salmonella crecido a 25 1 C sobrevivir a la desecacin mejores que las bacterias cultivadas a 37 1 C. Esta fi nding estaba vinculada a la expresin de sustancias polimricas extracelulares (EPS) componentes de la matriz, agregado fino fimbriae y la celulosa a la temperatura inferior. En contraste, se observ una mayor DT en Salmonella crecido a 37 1 C. Estos fi hallazgos podran estar relacionados con

Tabla 2 El promedio diario de la reduccin de UFC ( SD) de las cepas de S. enterica desecado durante la deshidratacin y posterior almacenamiento a largo plazo en 4 1C. Colar # Designacin de la cepa Log ufc tiempo de incubacin a 4 reductiona 1C (semanas) 0 311 316 317 321 323 324 301 312 916
un

2 0.31A (0.25) 0.61A (0.07) 2.22B 2.51B 0.72A 3.59C 0,75 A 0.49a (0.15) (0.53) (0.42) (0.15) (0.87) (0.08) (0.12) 0.74A

4 0.74A (0.24) 2.93B 3.03B 0.81A 4.07C 0.83A 0.63A (0.18) (0.45) (0.59) (0.22) (0.41) (0.18) (0.15) 0.90A

8 0.76A (0.20) 3.49C 3.35C 0.93A 4.84D 0.84A 0.72A (0.26) (0.58) (0.53) (0.25) (0.64) (0.21) (0.19) 1.21B

12 1.32A (0.37) 4.90B 4.44B 1,63 A 6.50C 1.21a 1.20A (0.57) (0.56) (0.64) (0.50) (0.43) (0.49) (0.44) 1.84A

Salmonela Salmonela Salmonela Salmonela Salmonela Salmonela Salmonela Salmonela (0.74) Salmonela

enterica enterica enterica enterica enterica enterica enterica enterica enterica

sv. Typhimurium SL 1344 sv. sv. sv. sv. sv. sv. sv. Typhimurium Rq18933T Typhimurium grupo-2 Typhimurium grupo-2 Typhimurium 1Epsilon Typhimurium DT104 Enteritidis B 249-01 Newport MB 17 RM 1655

1.27C (0.37) 1.03c (0.32) 0.62B (0.25) 2.12D (0.44) 0.54B (0.12) 0.29A (0.15) 0.57A, B 0.64B (0.18)

sv. Infantis C-1

1.66D (0.39)

1.78D (0.54)

1.90B (0.50)

3.28D (0.50)

Log CFU reduccin se calcul restando el valor de log CFU despus de la desecacin del valor log UFC antes de la desecacin, en cada punto de tiempo para cada cepa. Los valores son

medios de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Los valores entre parntesis indican la desviacin estndar de la media (n 9). Medias seguidas por una diferente carta indican signifi diferencias significativas entre las cepas en cada columna (P < 0,05).

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1.E 08

1.E 08

N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)

1.E 06 1.E 05 1.E 04 1.E 03 placa 1.E 02 1.E 01 1.E 00 0 2 4 6 8 10 12 estacionario semilogartmica temprano-log

N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)

1.E 07

1.E 07 1.E 06 1.E 05 1.E 04 0% NaCl 1.E 03 1.E 02 0,5% de NaCl 1,0% de NaCl 5,0% de NaCl 1.E 01 1.E 00 0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (semanas)

Tiempo (semanas)
La figura. 1. Efecto de la fase de crecimiento y en medio slido Salmonella LTP. Inmvil, semilogartmica temprano-log o medio slido (placa)-derivados de las bacterias se deshidrataron y se LTP grabado posterior conservacin en fro. La figura. 3. Efecto de la salinidad sobre el crecimiento medio de LTP. Las bacterias se cultivaron en LB-agar, contiene concentraciones crecientes de NaCl (0 e5,0%), se deshidrataron y LTP fue recorded durante el almacenamiento en fro posterior.

diferencias en las cepas o los ensayos de desecacin utilizado en los dos estudios. Aunque Salmonella puede crecer bajo una amplia gama de sal concentraciones (Alford y Palumbo, 1969;. Gibson et al, 1988), la exposicin del patgeno a la sal durante el crecimiento puede i nducir tolerancia cruzada a otras presiones. Salmonella se cultiv en caldo LB sin NaCl (LBNS), o en LBNS suplementado con concentraciones crecientes de NaCl. Salmonella DT fue mayor cuando se cultiva en 0,5 y 1,0% de NaCl (46,1 10,1% y 64,4 7,6% respectivamente) en comparacin con LBNS (13,0 4,1%), sin embargo, ningn aumento adicional se demostr en medio suplementado con 5% de NaCl (68,9 7,8%). Las clulas secas LBNS cultivados mostraron LTP disminuido a 4 1C en comparacin con las bacterias cultivadas en medio suplementado con sal, independientemente de la concentracin de NaCl (Fig. 3). Se puede concluir que la presencia de concentraciones crecientes de sal (0,5 e 5 ,0 % de NaCl) en el medi o de crecimi ent o mej ora la DT Salmon ella y LTP p os teri or. Un fen men o parecid o s e h aba in formad o anteri orment e en ri zobios (Mar a et al, 1986 .), Y pueden ind icar el desarrollo de t olerancia cru zada a d i vers as ten si on es ambi ent ales, la exp os ici n a un estrs ind i vidu al (Ab ee y Wout ers , 1999 ; Boor, 2006 ; Gru zd ev et al, 2011 ;. Ku ltz, 2 005 ; Vorob'eva, 2003).

3,4. Efecto de las condiciones ambientales en la DT y LTP en fro almacenamiento Pre-exposicin de las clulas bacterianas a una tensin solo se sabe que aumentar su tolerancia a una amplia gama de tensiones (Abee y Wouters, 1999; Gruzdev et al, 2011;. Rychlik y B arrow, 2005;. Schimel et al, 2007; Vorob 'eva, 2003). Por ejemplo, la pre-exposicin de Salmonella a pH leve ha mostrado aumentar la tolerancia a un pH ms bajo, el calor, NaCl (2,5 M), el cristal violeta y polimixina B (Leyer y Jhonson, 1993), as como frente a la temperatura baja (4 1C) (Xu et al., 2008). Deshidratacin en varios pHs (3 e 11) signi fi significativamente afectado el destino de las bacterias (Fig. 4A, B). DT fue mxima a pH 8,0 y disminuy a valores de pH inferiores o superiores. En el extremo d e pH de 11,0, DT fue muy baja (0,08 0,05%), pero la supervivencia era comparable a la de las clulas no deshidratadas (control) (0,33 1,1%). En contraste, las bacterias no sobrevivi a la deshidratacin en el extremo de pH 3,0, mientras que una parte de las clulas de control todava eran viables (0,33 1,5%). LTP fue siempre menor en los ambientes cidos (Fig. 4B). Por ejemplo, las clulas deshidratadas a pH 4,0 y 5,0 demostrado aproximadamente 6 log CFU reduccin dentro de las 12 semanas de almacenamiento, mientras que las clulas deshidratado en ambientes bsicos, mantuvieron su tamao de la poblacin original. Salmonella parecen ser ms tolerable a pH bsico y la exposicin slo a pH extremo (11,0) dio como resultado un signifiimportante disminucin en la supervivencia bacteriana. Transcriptomic (Wilks et al., 2009) y el anlisis de protenas (Stancik et al., 2002) revel que el pH bsico induce la expresin de enzimas metablicos cidos aminados, que participan en la arginina y las vas de la biosntesis de glutamato. Estas vas catablicas de carbono en cidos canal en lugar de producir aminas alcalinas, minimizando de este modo el cambio hacia un pH alcalino (Stancik et al., 2002). Adems, el glutamato acta como un soluto compatible en muchas bacterias, incluyendo Salmonella (Csonka et al, 1994; Kempf y Bremer, 1998; Wood et al, 2001.)., Mientras Ng-acetil-2, 4 diaminobutyrate (NADA) , un producto intermedio en la va biosinttica de la arginina, sirve como un precursor para la ectona soluto compatible. Ectona fue demostrado que funcionan como un agente osmoprotector en Salmonella (Garcia-Estepa et al., 2006). Podra ser la hiptesis por lo tanto, que el aumento de expresin de la arginina y glutamato vas durante el estrs pH bsico podra facilitar DT y LTP. Para hacer frente al estrs hyperosmotic, las bacterias se acumulan varios solutos compatibles a travs de la absorcin o la sntesis de novo. Durante desecante-cin, las bacterias tambin se someten a estrs hyperosmotic (Billi y Potts, 2002; Potts, 1994), y por lo tanto, hemos probado si solutos compatibles tambin podra contribuir a la tolerancia a la desecacin en Salmonella.

N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)

1.E 09

1.E 08

1.E 07

25 C 37 C

1.E 06

1.E 05 0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (semanas)

La figura. 2. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento de LTP. Las bacterias se cult ivaron a diferentes temperaturas en LB-agar, deshidratado y LTP se registr durante el fro posterior almacenamiento.

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41

La
120 controlar 100 deshidratado 80 60 40 20 0
3 4 5 6 7 8 9 10 11

N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)

1.E 08

1.E 07

Supervivencia (%)

1.E 06 1.E 05 6,5 h 1.E 04 11h 22h 1.E 03 1.E 02 0 2 4 6 8 10 12

pH

B
1.E 08

Tiempo (semanas)
La figura. 6. Efecto de la velocidad de deshidratacin en LTP. Clulas de Salmonella eran completamente deshidratado para diferentes momentos y la supervivencia se registr durante el almacenamiento en fro

N de clulas supervivientes

1.E 07
posterior.

1.E 06

(CFU / pocillo)

o caldo LB, demostr una signi fiDT significativamente mayor (85,2 21,5%, 1.E 05 1.E 04 1.E 03 1.E 02 1.E 01 1.E 00 0 2 4 6 8 10 12 7 9 8 10 respuesta al estrs osmtico (Koo et al, 1991;.. Wood et al, 2001), hizo no afectan DT (32,7 14,3%). LTP durante el almacenamiento en fro posterior fue mayor en las clulas suplementado con trehalosa y sacarosa como en comparacin con agua SDDW, LB o glicina-betana (Fig. 5). Similar fi ndTambin se inform de reuniones en Escherichia coli (Leslie et al, 1995;. Louis et al, 1993;. Welsh y Herbert, 1999), y son probablemente relacionado con la capacidad de los dos azcares no reductores para preservar la integridad de las membranas y protenas (Billi y Potts, 2002; Potts, 1994). Mientras tanto la trehalosa y la glicina betana se muestra que se requiere para la tolerancia de Salmonella a estrs hiperosmtico (Balaji et al, 2005;. Huang et al, 2007;.. Koo et al, 1991), el efecto diferente de las dos molculas en estrs desecacin sugiere la presencia de mecanismos diferentes en la tolerancia Salmonella a las dos tensiones. El medio LB rico, tal vez habilitada la adaptacin fisiolgica del patgeno para el medio ambiente estresante a travs de la sntesis de novo de los metabolitos necesarios. En efecto, DT fue similar cuando la deshidratacin se produjo en presencia de LB o trehalosa. Sin embargo, a diferencia de trehalosa, LB no mejor la LTP, lo que sugiere que tal vez la DT aumento en la presencia de LB no fue resultado de la sntesis de novo de trehalosa. Estos fi hallazgos indican que los diferentes mecanismos de supervivencia podra estar involucrados en la expresin de DT y LTP. N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)
1.E 09 1.E 08 1.E 07 1.E 06 1.E 05 1.E 04 1.E 03 1.E 02 1.E 01 1.E 00 0 2 4 6 8 10 12 Controle Cm

4 5 6 94,1 28,1% y 92,3 21,1%, respectivamente) en comparacin con las clulas deshidratado en agua SDDW solo (48,8 14,2%). En contraste, la glicinabetana, un soluto compatible conocida expresada por Salmonella en

Tiempo (semanas)
La figura. 4. Efecto del pH sobre la supervivencia de Salmonella y LTP. Las bacterias fueron suspendidas en agua SDDW ajust a pH bsico o cido. Las muestras eran o deshidratado, o se mantuvieron en agua (control) durante 22 h. La supervivencia bacteriana (A) se expresa como el po rcentaje de viabilidad bacterias al pH indicado en comparacin con el tiempo cero (100%). LTP (B) se presenta como el recuento de viables (CFU) de bacterias secas durante el almacenamiento en fro. Caso diferente inferior o letras maysculas en el panel A indicar signifi diferencias significativas en el porcentaje de supervivencia en diferentes condiciones de pH en el control y clulas deshidratadas, respectivamente.

Salmonella fue deshidratado en agua SDDW suplementado con tres solutos compatibles, as como en caldo LB (medio rico), lo que podra facilitar la actividad metablica durante la deshidratacin. De hecho, las clulas de Salmonella se sec en cualquiera de sacarosa 100 mM, 100 mM de trehalosa

N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)

1.E 09

1.E 08

1.E 07

1.E 06

Controle LB La trehalosa

1.E 05 Sacarosa La glicina betana 1.E 04 0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (semanas)
La figura. 7. Efecto de cloranfenicol en Salmonella LTP. Las clulas se deshidrataron en estril agua doblemente destilada (agua SDDW) sola (control) o en agua SDDW que contiene 30 m g / ml cloranfenicol durante 22 horas y la supervivencia se registr durante el almacenamiento en fro posterior.

Tiempo (semanas)
La figura. 5. Efecto de medio rico y exgenos solutos compatibles sobre LTP. Las bacterias fueron deshidratado en cualquiera estril doblemente destilada (agua SDDW; control), caldo de cultivo LB, o en agua SDDW suplementado con 100 mM de cada uno de los solutos compatibles, trehalosa, sacarosa y glicina betana y la supervivencia se registr durante fro subsiguiente almacenamiento.

420

N. Gruzdev et al. / Food Microbiology 32 (2012) 415e422

1.E 08 1.E 07

Mara et al., 1985). Tambin se encontr que el aumento de la deshidratacin tasa de Salmonella, acortando el tiempo de deshidratacin de 22 a 6,5 h, signifiDT baj significativamente (49,7 22,2% versus 11,3 4,1%) y LTP durante el almacenamiento en fro (Fig. 6). La deshidratacin de Salmonella en agua SDDW suplementado con 30 m g / ml de cloranfenicol significativamente reducido tanto DT (24,5 11,6% versus 49,1 24,6%) y LTP (Fig. 7), lo que sugiere que de novo protenas sintetizadas son necesarios para la supervivencia mxima durante deshidratacin y durante el almacenamiento en fro posterior. Curiosamente, cloranfenicol tiene un efecto mucho ms pronunciado en Salmonella LTP que en DT (Fig. 7). Para negar la posibilidad de que el menor Cm supervivencia de las clulas tratadas fue debido a la exposicin a Cm crecientes concentraciones durante la deshidratacin, las clulas de Salmonella en Agua SDDW tambin fueron expuestos a Cm en concentraciones que van desde 100
0 20 40 60 80 100

N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)

1.E 06 1.E 05 1.E 04 1.E 03 1.E 02

1.E 01 1.E 00

Tiempo (semanas)
La figura. 8. Destino de Salmonella durante 100 semanas de almacenamiento en fro. Salmonella deshidratada Las clulas se almacenaron a 4 1C y CFU se registr a las horas designadas. La expementos se repitieron dos veces.

a 3000 mg / ml. Ningn efecto adverso sobre la viabilidad bacteriana se observ (Datos no mostrados). Estos fihallazgos apoyan la nocin de que la adaptacin de las bacterias al estrs desecacin requiere de novo de protenas sntesis. 3,6. Efecto del almacenamiento a baja temperatura sobre la viabilidad a largo plazo de Salmonella seco Tal vez la cuestin ms problemtica de la supervivencia determinante es la metodologa utilizada para de fi ne bacteriana viabilidad. Salmonella deshidratadas almacenadas a 4 1 C sobrevivi durante 2 aos con un w5log CFU reduccin (Fig. 8). Se ha informado de que las bacterias estresadas a menudo introducido un viable pero no cultivable (VBNC) estado (Oliver, 2005, 2010). Para probar si la reduccin en CFU resultado de la prdida de la viabilidad o la transicin al estado VBNC, las clulas se tieron con

3,5. Efecto del tiempo de deshidratacin y el cloranfenicol en DT y LTP Debido a la adaptacin de los microorganismos al estrs requiere metaactividad metablica dirigido a la sntesis de enzimas y solutos compatibles para proteger a la clula del dao, es probable que acortar el tiempo de deshidratacin limitar la capacidad de las bacterias para adaptarse a la prdida de agua. En efecto, la tasa de deshidratacin influy en la supervivencia bacteriana durante la desecacin (Antheunisse y Arkesteijn Dijksman, 1979;

La figura. 9. La visualizacin de bacterias viables y muertas por lser confocal de barrido microscopio. Vivos (verde) y DEAD (rojo) las clulas se visualizaron ant es de la deshidratacin (A), despus de la deshidratacin durante 22 h (B), y despus del almacenamiento para 48 (C) y 100 (D) semanas. Representante fiELDs se presentan. (Para la interpretacin de las referencias al color en este figure la leyenda, el lector es se refiri a la versin web de este artculo.)

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421

N de clulas supervivientes (CFU / pocillo)

1.E 04

ARS, WRRC), para las cepas de Salmonella y E. Belausov para asistencia cia con la microscopa de fluorescencia. Este estudio fue parcialmente El apoyo de Estados Unidos -Israel Agrcola Binacional Investigacin y Desarrollo (BARD) Fund, beca # ES-4267-09.
37 C 25 C Abee, T., Wouters, J. A., 1999. Respuesta al estrs microbiano en un procesamiento mnimo. International Journal of Food Microbiology 50, 65 e 91. Alford, J. A., Palumbo, S.A., 1969. Interacci n de sal, pH, y temperatura en la el crecimiento y la supervivencia de Salmonella en carne de cerdo molida. Applied and Environmental Microbiologa 17, 528 e 532. Annimo, 2007. Brote de Salmonella serotipo Infecciones Tennessee Agua SDDW LB TSA BHI Asociado con mantequilla de man e Estados Unidos, 2006 e 2007, vol. 56. Morbosidad and Mortality Weekly Report, pp 521 e 524. Annimo, 2008. Recuerda producto Copos de maz. http://www.fda.gov/Safety/Recalls/ MajorProductRecalls / Mazescamas / default.htm. Annimo, 2009. Recuerda producto pistacho. http://www.fda.gov/Safety/Recalls/ MajorProductRecalls / Pistacho / default.htm. Annimo, 2010a. Granola Bars Recuerda producto. http://www.fda.gov/Safet y/ Recuerda / MajorProductRecalls / Granola / default.htm. Annimo, 2010b. Salmonella Montevideo Infecciones Asociadas con Salami Los productos que estn contaminados con pimienta importada Negro y Rojo e Estados Unidos, julio de 2009 e Abril de 2010, vol. 59. Morbilidad and Mortality Weekly Report, pp 1647e1650. Antheunisse, J., Arkesteijn-Dijksman, L., 1979. Velocidad de secado y la supervivencia de los microorganismos. Antonie van Leeuwenhoek 45, 177 e184. Balaji, B., O ' Connor, K., Lucas, JR, Anderson, JM, Csonka, LN, 2005. Momento de la induccin de genes osmt icament e controlados en Salmonella ent erica serovar Typhimur ium, det erminado con cuant it at iva en t iempo real de transcripcin inversa PCR. Applied and Environmental Microbiology 71, 8273 e 8283. Bernstein, N., Sela, S., Neder-Lavon, S., 2007. Efecto de los regmenes de riego en persiscia de Salmonella ent erica serovar Newport en pequeas macet as experiment ales diseado para el cultivo de plantas. Riego Ciencias 26, 1 e8. Beuchat, L.R., Heaton, E.K., 1975. Salmonella supervivencia en pacanas, determinadas por condiciones de transformacin y de almacenamiento. Applied and Environmental Microbiology 29, 795e801. Billi, D., Potts, M., 2002. La vida y la muerte de los procariotas secas. La investigacin en microbicidas ology 153, 7 e12. Boor, K. J., 2006. Respuestas bacterianas estrs: qu doesn 't matarlos puede hacer ms fuerte. PLoS Biology 4, 18 e20. Brandl, M. T., 2006. Gimnasio de patgenos entricos humanos en las plantas y las implicaciones para la seguridad alimentaria. Revisin Anual de Fitopatologa 44, 367 e392. Breeuwer, P., Lardeau, A., Peterz, M., Joosten, SM, 2003. La desecacin y el calor tolerancia de Enterobacter sakazakii. Journal of Applied Microb iology 95, 967 e 973. Burnett, SL, Gehm, ER, Weissinger, WR, Beuchat, LR, 2000. Supervivencia de Salmonella en la mantequilla de man y mantequilla de man propagacin. Journal of Applied Microbicidasologa 89, 472 e477. Csonka, LN, Ikeda, TP, Fletcher, SA, Kustu, S., 1994. La acumulacin de glutamato es necesario para un ptimo crecimiento de Salmonella typhimurium en los medios de comunicacin de alta osmolaridad, pero no la induccin del opern prou. Journal of Bacteriology 176, 6324e6333. Cuny, C., Lesbats, M., Dukan, S., 2007. La induccin de una respuesta de estrs global durante la fi primera etapa de crecimiento de Escher ichia coli placa. Applied and Environmental Microbiologa 73, 885 e 889. de Cesare, A., Sheldon, BW, Smith, KS, Jaykus, LA, 2003. Supervivencia y la persistencia de Campylobacter y Salmonella sp en virtud de diversas cargas orgnicas de los alimentos pngase en contacto con las superficies. Journal of Food Protection 66, 1587e 1594. Fennema, quirofano, 1985. Qumica de los Alimentos. Marcell Dekker, Nueva York. 46e50. Garca-Estepa, R., Argandoa, M., Reina-Bueno, M., Capote, N., Iglesias-Guerra, F., Nieto, J. J., Vargas, C., 2006. El gen eCTD, que est implicado en la sntesis de la hidroxiectona soluto compatible, es esencial para la proteccin trmica de los halfilos bacteria salexigens Chromohalobacter. Diario de Bacteriology.188, 3774e3784. Gibson, A.M., Brat chell, N., Roberts, T. A., 1988. Predecir el crecimiento microbiano respuestas de salmonelas en un medio de laboratorio como afectados por cloruro sdico, pH, y temperatura de almacenamiento. International Journal of Food Microbiology 6, 155e178. Gill, ON, Sockett, PN, Bartlett, CLR, Vaile, MSB, Rowe, B., Gilbert, RJ, Dulake, C., Murrell, H.C., Salmaso, S., 1983. Brote de Salmonella infeccin causada Napoli por las barras de chocolate importadas. The Lancet 345, 574 e577. Gruzdev, N., Pinto, R., Sela, S., 2011. Efecto de la desecacin en la tolerancia de Salmonella enterica a tensiones mlt iples. Applied and Environmental Microbiology 77, 1667e1673. Heldman, D.R., Hartel, R. W., 1997. Principios de Procesamiento de Alimentos. Chapman and Hall, Nueva York. 83 e112. Hengge-Aronis, R., 1996. Regulacin de la expresin gnica durante la entrada en estacionario fase. Biologa Celular y Molecular 5, 1497 e1512. Hiramatsu, R., Matsumoto, M., Sakae, K., Miyazaki, Y., 2005. Capacidad de la toxina Shiga Escherichia coli productora y Salmonella spp. para sobrevivir en un sist ema modelo de desecacin y en los alimentos secos. Applied and Environment al Microbiology 71, 6657e 6663.

1.E 03

Referencias

1.E 02

1.E 01

1.E 00

Los soportes recuperacin

de

La figura. 10. Efecto de los soportes de recuperacin en la viabilidad de Salmonella. Despus de 100 semanas de fro almacenamiento, clulas de Salmonella se volvieron a suspender en cualquiera estril doblemente destilada (Agua SDDW) o en uno de varios medios ricos en nutrientes en 25 o 37 1C. Los experimentos se repitieron dos veces. Diferentes letras minsculas indican signifi diferencias significativas entre diferentes temperaturas, para cada medio de recuperacin. Letras diferentes indican capitales signifi diferencias significat ivas ent re los medios de recuperacin a la misma t emperat ura (P < 0,05).

LIVE / DEAD tincin kit y se visualizaron por fluorescente microscopiar. Era evidente que la reduccin de la viabilidad celular fue mucho menor ( w 50%) que la reduccin en culturability (Fig. 9). Quanti fi - Catin del nmero de clulas vivas y muertas no revel signi fidiferencia significativa en el porcentaje de viabilidad despus de la desecacin 22 h perodo, o despus de 48 y 100 semanas de almacenamiento a 4 1C (50,9 4,7%; 50,2 4,9% y el 46,4 4,65%, respectivamente), lo que sugiere que las clulas han entrado en un estado VBNC. La recuperacin de las bacterias estresadas que comnmente mejorado en medios ricos (Oliver, 2005, 2010). Reanimacin de Salmonella en LB, TSB o BHI, tanto en 25 y 37 1 C, recuperacin mejorada por hasta 1 log ( BHI) en comparacin con agua SDDW, sin embargo, una gran parte de las bacterias todava se mantuvo unculturable (Fig. 10). Recuperacin a 37 1 C era mejor que 25 1 C para todos los medios de comunicacin (P < 0,05). VBNC patgenos transmitidos por los alimentos se considera que son un pblico serio problema de salud (Oliver y Bockian, 1995; Oliver, 2010). Es ampliamente establecido que al menos 106 clulas de Salmonella viables son necesarios para causar infeccin en seres humanos (Kothary y Babu, 2001). Sin embargo, varios brotes de salmonelosis asociados con el consumo de baja actividad de agua de los alimentos, se han atribuido a un nmero muy inferior (tan bajo como 3 clulas por g) de las bacterias (Gill et al, 1983;.. Scheil et al, 1998). Uno podra especular que las clulas VBNC eran en realidad parte de estos brotes, sin embargo, el potencial patognico de deshidratado-VBNC Salmonella en los alimentos an no se ha demostrado. 4. Conclusiones DT y LTP de S. typhimurium estn influenciados por diversos crecimiento condiciones, incluyendo la fase de crecimiento, el tipo de medio de crecimiento, temperatura y concentracin de NaCl. Condiciones de deshidratacin, en combinacin con un pH bsico y la presencia de trehalosa y sacarosa exgena (pero no la glicina-betana), mejorar tanto la DT y LTP. Durante el almacenamiento en fro de una gran proporcin de clulas deshidratadas se encontr que en el estado VBNC, lo que podra dificultar la deteccin del patgeno en productos alimenticios secos. Finalmente, una tasa lenta deshidratacin aumenta la supervivencia bacteriana, aparentemente a travs de la sntesis de novo de metabolitos crticos necesarios para la adaptacin a la desecacin estrs. Agradecimientos Damos las gracias a A. Reisfeld (israel Salmonella Centro de Referencia), A. Lublin (Instituto Veterinario, Bet Dagan, Israel) y M. Brandl (USDA,

422

N. Gruzdev et al. / Food Microbiology 32 (2012) 415e422 Oliver, J. D., 2010. Reciente fi hallazgos sobre el estado viable pero no cultivable en patobacterias gnicas. FEMS Microbiology comentarios 34, 415 e 425. Potts, M., 1994. La desecacin de la tolerancia procariota. Investigacin en Microbiologa 58, 755e805. R mling, U., 2005. Caract er izaci n del morfot ipo rdar, un mult icelular comportamiento en Enterobacteriaceae. Celular y Molecular Ciencias de la Vida 62, 1 e13. Rowe, B., Begg, N.T., Hutchinson, D.N. de 1987. Las infecciones por Salmonella Ealing asociados con el consumo de leche en polvo para lactantes. The Lancet 2, 900 e 903. Rychlik, I., Barrow, P. A., 2005. Salmonella manejo del estrs y su importancia para comportamiento durante la colonizacin intest inal y la infeccin. FEMS Microbiology Comentarios 29, 1021 e1040. Scheil, W., Cameron, S., Dalton, C., Murray, C., Vilson, D., 1998. A Australia del Sur Investigacin del brote de Salmonella Mbandaka utilizando la base de datos para seleccionar los controles. Australian Journal of Public Health 22, 536 e 539. Scher, K., Romling, U., Yaron, S., 2005. Efecto del calor, acidifi catinico, y cloracin en clulas de Salmonella enterica serovar Typhimurium en una bio fi lm formado en el aire interfase lquido. Applied and Environmental Microbiology 71, 163 e1168. Schimel, J. Balser, T.C., Wallenstein, M., 2007. Microbial respuesta de estrs fisiologa y sus implicaciones para el funcionamiento del ecosistema. Ecologa 88, 1386e 1394. Shohat, T., Green, M. S., Marom, D., 1996. Internacional epidemiolgica y micro estudio biolgico del brote de la infeccin con Salmonella agona de un producto listo para el consumo sabroso snack-II: Israel. British Medical Journal 313, 1105 e1109. St anc ik, LM, St ancik, DM, S chmidt , B. Bar nhart , DM, Yo ncheva, YN, Slonczewski, J. L., 2002. pH-dependiente de la expresin de las protenas periplsmicas y catabolismo de aminocidos en Escherichia coli. Journal of Bacteriology 184, 4246 e 4258. Tauxe, R.V., 1991. Salmonella: un patgeno posmoderno. Journal of Food Protection 54, 563e568. Uesugi, A.R., Danyluk, M. D., Harris, L. J., 2006. La supervivencia de Salmonella Enteritidis fago de tipo 30 en las almendras inoculados se almacenaron a 20, 4, 23, y 35 1C. Journal of Proteccin de los alimentos 69, 1851e1857. Vorob'eva, L.I. de 2003. Los factores de estrs, las reacciones de estrs, y la supervivencia de las bacterias: una revisin. Aplicada Bioqumica y Microbiologa 40, 217 e 224. Welsh, D.T., Herbert, R. A., 1999. Trehalosa intracelular inducida osmticamente, pero no glicina betana promueve la acumulacin de tolerancia a la desecacin en Escherichia coli. FEMS Microbiology Letters 174, 57 e63. Werber, D., Dreesman, J., Feil, F., van Treeck, U., Fell, G., Ethelberg, S., Hauri, AM, Roggentin, P., Prager, R., Fisher, I., Behnke, SC, Bartelt, E., Weise, E., Ellis, A., Siitonen, A., Andersson, Y., Tschpe, H., Kramer , MH, Amn, A., 2005. Inter-nacional brote de Salmonella debido al chocolate alemn Oranienburg. BMC Enfermedades Infecciosas 5, 7. White, AP, Gibson, DL, Kim, W., Kay, WW, Surette, MG, 2006. Agregado fino

Huang, X., Xu, H., Sun, X., Ohkusu, K. Kawamura, Y., Ezaki, T., 2007. Genoma toda la escanear de la cintica de expresin de genes de Salmonella enterica serovar Typhi durante hyperosmotic estrs. International Journal of Molecular Ciencias 8, 116 e 135. Isaacs, S., Aramini, J., Ciebin, B., Farrar, JA, Ahmed, R., Middleton, D., Chandran, AU, Harris, LJ, Howes, M. Chan, E., Pichette, AS, Campbell, K. Gupta, A., Lior, LY, Pearce, M., Clark, C., Rodgers, F., Jamieson, F ., Brophy, I., Ellis, A., por Enter-PT 30 iditis grupo de investigacin brote de trabajo, 2005. Un brote de salmonelosis asociado internacional con almendras crudas contaminadas con un tipo raro de fago Salmonella Enteritidis. Journal of Food Protection 68, 191e 198. Jorgensen, F., Leach, S., Wilde, SJ, Davies, A., Stewart, GSAB, Humphrey, TJ, 2000. Invasividad de los pollos, la resist encia a la t ensin y el est ado de RpoS de t ipo salvaje Salmonella ent erica subsp ent erica serovar Typhimur ium de fi tipo cognitivo 104 y serovar Enteritidis fago tipo 4 cepas. Microbiologa 146, 3227 e 3235. Kempf, B., Bremer, E., 1998. La captacin y la sntesis de solutos compatibles como microbiana hincapi en las respuestas a entornos de alta osmolaridad. Archivos de Microbiologa 170, 319e330. Komitopoulou, E., Pealoza, W., 2009. El destino de Salmonella en carne viva confitera seco materiales. Journal of Applied Microbiology 106, 1892 e 1900. Koo, S.P., Higgins, C. F., Booth, I.R. de 1991. Reglamento de soluto compatible acucin en Salmonella typhimurium. Journal of General Microbiology 137, 2617 e 2625. Kothary, M.H., Babu, EE.UU., 2001. Dosis infecciosa de los patgenos transmitidos por los alimentos en voluntarios: una revisin. Journal of Food Safety 21, 49 e68. Kultz, D., 2005. Bases moleculares y evolutivos de la respuesta al estrs celular. Revisin Anual de Fisiologa 67, 225 e 257. Leslie, SB, israel, E., Lighthart, B., Crowe, JH, Crowe, LM, 1995. Y trehalosa sacarosa proteger tanto las membranas y protenas en bacterias intactas durante el secado. Applied and Environmental Microbiology 61, 3592 e 3597. Leyer, G.J., Jhonson, E. A., 1993. Adaptacin cido induce proteccin cruzada contra estrs ambiental en Salmonella typhimurium. Applied and Environmental Microbiologa 59, 1842 e 1847. Louis, P., Truper, H.G., Galinski, A., 1993. Supervivencia de Escherichia coli durante el secado y el almacenamiento en presencia de solutos compatibles. Microbiologa Aplicada y Biotecnologa 41, 684 e688. Mara, P., Ochin, D., Tailliez, R., 1985. Las tasas de secado y la supervivencia de Rhizobium melilot i cepas durante el almacenamiento a diferentes humedades relat ivas. Apli cada y Environmental Microbiology 50, 207 e211. Mara, P., Ochin, D., Tailliez, R., 1986. Crecimiento estado de Rhizobia en relacin con su tolerancia a las act ividades de agua baja y el est rs desecacin. Bio loga del Suelo y Biochemistry 18, 179e184. Mattick, KL, Jrgensen, F., Legan, JD, Cole, MB, Porter, J., Lappin-Scott, HM, Humphrey, T.J., 2000. La supervivencia y el fi lamento de Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 y Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 en baja actividad de agua. Applied and Environmental Microbiology 66, 1274 e 1279. Meng, XC, Stanton, C., Fitzgerald, GF, Daly, C., Ross, PR, 2008. Anhydrobiotics: los desafos para el secado de cultivos probiticos. Food Chemistry 106, 1406 e 1416. Messens, W., Grijspeerdt, K., Herman, L., 2005. Cscara de huevo penetracin de Salmonella. Mundo ' s Poultry Science Diario 61, 71 e86. Navarro Llorens, JM, Tormo, A., Martnez-Garca, E., 2010. Fase estacionaria en bacterias gram-negativas. FEMS Microbiology comentarios 34, 476 e 495. Oliver, J. D., Bockian, R., 1995. En resucitacin vivo, y la virulencia hacia los ratones, de clulas viables pero no cultivable de Vibrio vulni fi CUS. Applied and Environmental Microbiologa 61, 2620 e 2623. Oliver, J. D., 2005. El estado viable pero no cultivable en las bacterias. Diario de MicroBiologa 43, 93 e100.

mbriae celulosa y mejorar a largo plazo la supervivencia y la persistencia de Salmo-

nella. Journal of Bacteriology 188, 3219 e3227. Wilks, JC, Kitko, RD, Cleeton, SH, Lee, GE, Ugwu, CS, Jones, BD, Bondurant, SS, Slonczewski, J. L., 2009. El cido y la base de las respuestas de estrs y transcriptomic en Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology 75, 981 e 990. Wood, JM, Bremer, E., Csonka, LN, Kraemer, R., Poolman, B., van der Heide, T., Smith, L., 2001. Osmosensing y osmoregulatoria soluto compatible acumulacin de bacterias. Comparativa Bioqumica y Fisiologa Parte A: Molecular Fisiologa Integrativa y 130, 437 e460. Xu, H. Lee, H.Y., Ahn, J., 2008. Protectora cruzada efecto del cido -adaptado Salmonella enterica en la resistencia al cido letal y condiciones de fro estrs. Las letras en Applied Microbiology 47, 290 e 297. Zibilske, L. M., Weaver, R. W., 1978. Efecto de los factores ambientales en la supervivencia de Salmonella Typhimurium en el suelo. Revista de Calidad Ambiental 7, 593 e 597.