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Las bacterias Gram-positivas presentarn una coloracin violeta mientras que las Gram-negativas la presentarn roja o rosa.

La identificacin de las bacterias Gram-positivas puede ser problemtica, solamente cuando las bacterias Grampositivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jvenes) la reaccin es clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gram-negativas.

MTODOS PARA AISLAR UN CULTIVO PURO: Tcnica de siembra por estras en placa y tcnica de siembra por difusin en placa: Se pasa una porcin de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estras o por difusin. Esta operacin hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Tcnica de la placa vertida: El principio de la tcnica de la placa vertida es la dilucin (adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en ms de un tubo para obtener colonias bien aisladas. Tcnica del enriquecimiento del cultivo: Para mejorar las posibilidades de aislamiento de algunos tipos fisiolgicos poco frecuentes de bacterias, los procedimientos de siembra en placa debern de estar precedidos del desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. El principio de esto, es procurar un ambiente de cultivo diseado que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitemos pero que no sea adecuado para las dems. Los medios de enriquecimiento se usan generalmente cuando el tipo de bacteria que queremos aislar se encuentra en muy pequeas cantidades. Tcnica de aislamiento de una sola clula: Para poder obtener un solo microorganismo de una preparacin en gota suspendida, se necesita el micromanipulador. Este aparato permite al operador controlar una micropipeta o microcnula (aguja muy fina) dentro de una gota pendiente de tal manera que se pueda tomar una sola clula y pasarla a un medio de cultivo. Un microorganismo se puede sembrar en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.[cita requerida] La principal diferencia entre un medio de cultivo slido y uno lquido es que el medio de cultivo slido contiene un 1,52% de agar-agar, mientras que el medio lquido no contiene agaragar.[cita requerida] Indicaciones[editar]

A la izquierda, placas de Petri con cultivos bacterianos en medio slido. A la derecha, tubos con cultivos en medio lquido inoculados con puntas demicropipeta. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio. En este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la del tipo que se los paleontologos comen ciertas especias diversas, estas utilizadas en el cultivo de dicho objeto desea averiguar si est presente. Otras veces, el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pHque cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolismoscidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser detectados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.[cita requerida] Con otros medios de cultivo se puede identificar si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes. As, algunas bacterias con enzimas hemolticas (capaces de romper los glbulos rojos) producen hidrlisis y cambios apreciables prosaicamente en las placas de agar-sangre.[cita requerida] Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en un laboratorio de microbiologa de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y losantibiticos a los que son sensibles esas bacterias. Los cultivos suelen usarse en medicina para determinar la presencia de agentes patgenos en fluidos corporales (como por ejemplo la sangre o laorina).[cita requerida]

Una UFC tambin puede corresponder a ms de una clula cuando stas forman parte de grupos unidos fuertemente (estreptococos o diplococos, por ejemplo) ya que cada grupo formar una sola colonia. Cuando algunos tipos de bacterias o de levaduras patgenas crecen sobre superficies forman biopelcuas (biofilms) en los que las clulas se asocian entre s mediante capas de polisacridos que forman una pelcula que recubre la superficie sobre la que se encuentran las clulas. Los biofilms son muy importantes porque los microorganismos que los forman resultan ms resistentes a antibiticos y al ataque de clulas del sistemainmune y, por consiguiente, las infecciones que producen son ms difciles de tratar. La presencia de biopelculas es un problema serio en los implantes ortopdicos, catteres, etc. El sarro de los dientes es un ejemplo de biofilm.

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) deErysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas: 1. Mtodo del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Mtodo del tubo de ensayo:

Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.

recuentos celulares. Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tienen por objeto determinar el nmero de cada uno de los tipos celulares que estn comprendidos en una unidad de volumen de sangre (generalmente, en 1 mm3). Todos los recuentos celulares constan de 3 fases descritas a continuacin.

Dilucin de la sangre. Cmputo del nmero de clulas. Clculo matemtico del nmero de clulas presentes en 1 mm3 de sangre. Los recuentos celulares pueden realizarse mediante mtodos manuales (recuentos en cmara) o automticos (recuentos en contadores electrnicos), siendo stos los dos bloques diferenciados en el presente tema. La primera opcin, tal y como podremos descubrir a lo largo del tema, se encuentra actualmente en desuso debido al amplio margen de error de la tcnica. Otro de los motivos a destacar es la falta de operatividad en los laboratorios actuales debido a la necesidad de tiempo invertido y elevado volumen de trabajo. 1. recuento manual o recuento en cmara.

el recuento de los distintos elementos formes presentes en sangre, es una de las prcticas ms antiguas en hematologa. Siendo adems muy tiles los resultados obtenidos en estos puesto que permiten la deteccin e alteraciones cuantitativas ( en la cantidad o nmero) de las distintas clulas sanguneas.

Recuento de plaquetas. En determinadas situaciones patolgicas ( alteraciones en el tamao de las plaquetas) el recuento automtico no resulta efectivo, puesto que el aumento de tamao de dichas clulas no permite al aparato diferenciarlas de otras clulas sanguneas de un tamao mayor. Estudio celular en otras muestras biolgicas. Existen otras muestras biolgicas ( lquido cefalorraqudeo, peritoneal y otros muchos), en los que a menudo es necesario llevar a cabo el recuento de hemates o leucocitos que por situacin patolgica se encuentra en ellos. No se realiza automticamente, sino que se opta por la prctica de un recuento en cmara. Por ello, adems de por la inclusin de este apartado dentro de la Legislacin Vigente para el presente Ciclo Formativo, procederemos al estudio de dicha tcnica.

material necesario.
cmara de neubauer. Tambin se llama cmara cuentaglbulos o hemocitmetro. Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de porta, cuya porcin central est dividida en 3 ejes perpendiculares al eje longitudinal de la cmara. De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 0.1 mm con respecto a la central, y en esta ltima hay grabado un retculo cuadrangular ( cmara simple). La banda central puede estar, a su vez, subdividida en 2 semi bandas idnticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la cmara ( cmaras dobles). En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retculo idntico que facilitar el recuento celular.

No todas las cmaras de recuento son iguales, la ms utilizada en hematologa es la cmara de neubauer. Se trata de una cmara doble, cuyos retculos ( 2 al tratarse de una cmara doble) se denominan retculos de neubauer. La siguiente figura muestra las dimensiones de dicho retculo:

Tal y como puede apreciarse en la figura, cada retculo se divide en nueve cuadrados grandes de 1mm de lado. Siendo los cuadrados de las esquinas los destinados al recuento de leucocitos ( al existir stos en menor nmero que hemates, se precisa menor nmero de lneas de referencia), a su vez dichos cuadrados se subdividen en 16 cuadrados denominados medianos de 0.25 mm de lado. El cuadrado central es el destinado al recuento de hemates y plaquetas. Dicho cuadrado se subdivide en 25 cuadrados medianos ( 0.2mm de lado), y a su vez stos se subdivide en 16 cuadros denominados pequeos. Por tanto el nmero total de cuadraditos constituyentes del cuadro central es de 400 cuadrados. cubreobjetos. Preferiblemente, debe ser algo ms grueso que los normalmente utilizados. Se coloca de forma que apoye sobre las dos bandas laterales de la porcin central de la cmara. De esta manera, queda delimitado un espacio entre la banda central y el cubre en el que se deposita la muestra y cuyo espesor es de 0,1 mm. Algunas cmaras tambin constan de dos pinzas especiales que parten, cada una, de una de las porciones laterales de la cmara y que tienen por misin la de asegurar la fijacin del cubre a la misma.

PIPETAS DILUIDORAS DE THOMA. Son unas pipetas especiales de cristal que constan de un largo tubo capilar graduado y de una dilatacin ampular o bulbo. El tubo capilar termina en punta, a nivel de uno de sus extremos, y se contina con el bulbo, a nivel del otro de sus extremos. Adems, est dividido en 10 partes iguales, y en su superficie estn especialmente bien marcadas la 5a divisin (con un 0,5) y la 10 (con un 1). El bulbo contiene una perla de vidrio para facilitar la mezcla de la sangre con el lquido de dilucin, y acaba en un tubo capilar corto. La perla de vidrio es roja en las pipetas empleadas para el recuento de hemates, y blanca en las usadas para el recuento de leucocitos. Adems, en las pipetas para hemates la capacidad del bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 101, Y en las pipetas para leucocitos la capacidad del bulbo es 10 veces mayor que la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 11.

GOMA DE ASPIRACIN Y BOQUILLA. Es un tubo de goma que permite la aspiracin de la muestra y del lquido de dilucin. En uno de sus extremos tiene encajada una boquilla, y por el otro se ensambla al tubo capilar corto de cualquiera de las pipetas de Thoma. Al tubo se le aplica una boquilla por la cual el tcnico proceder a la aspiracin. Todo ello queda reflejado en la siguiente figura.

reactivos.
como reactivo se utiliza lquido de dilucin. Existen varios tipos. Su composicin vara segn el tipo de clulas que se pretende contar. Los que se utilizan para el recuento de hemates contienen cloruro sdico para hacerlos isotnicos con respecto al plasma y evitar, de esta forma, la hemlisis. Pero algunos

incorporan tambin anticoagulantes como el citrato de sodio, e incluso antispticos como la formalina. Los que se emplean para el recuento de leucocitos contienen una sustancia, como el cido actico glacial que rompe los hemates y un colorante, como el violeta de genciana, que tie el ncleo de los leucocitos. Los que se usan para el recuento de plaquetas pueden incorporar una sustancia hemoltica y un antiagregante plaquetario. Los lquidos diluyentes ms utilizados son el de Hayem, para el recuento de hemates, y el de Turck, para el recuento de leucocitos.

muestra problema.
Sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA. Esta sangre se utilizar convenientemente diluida.

limpieza del material.


Con respecto a la limpieza de la cmara de neubauer, tras su uso, ha de ser aclarada con agua tibia y posteriormente debe secarse con un pao suave y limpio dejndola al aire. Tras el empleo de las pipetas de Thoma, stas deben lavarse interiormente del siguiente modo:

Primero, haciendo pasar a travs de ellas agua corriente, una vez. Luego, haciendo pasar a travs de ellas agua destilada, 3 veces. Finalmente, haciendo pasar a travs de ellas acetona o alcohol de 95, otra vez. Tras ello, ha de secarse su interior, preferentemente mediante un secador de aire.

GENERALIDADES ACERCA DEL RECUENTO MANUAL.


Atendiendo al elemento forma del cual queramos llevar a cabo el recuento, adems de utilizar un lquido de dilucin diferente, la dilucin a realizar tambin ser distinta, lo cual se encuentra directamente relacionado con el nmero de cada tipo celular presente en la muestra sangunea en condiciones normales. Las diluciones a realizar en cada caso, as como las indicaciones para la correcta prctica de la dilucin y llenado de la cmara se expondrn en las prcticas correspondientes en cada caso. Como generalidad importante, debemos citar que en todos los casos, una vez llevemos a cabo el recuento de las clulas correspondientes en las regiones apropiadas de la cmara ( dependiendo del tipo celular objeto de estudio), los resultados deben ser referidos a un volumen ( lo conseguimos al conocer las dimensiones del retculo y cmo no la altura de la cmara) y al tiempo ser corregidos por el factor de dilucin utilizado. Slo de este modo expresaremos los resultados tal y como es debido: nmero de clulas ( leucocitos, hemates o plaquetas) / mm3.

Por otro lado, es necesario remarcar el amplio margen de error presentado por el mtodo que nos ocupa en estos momentos. La tcnica de recuento manual se caracteriza presentar un alto margen de error motivado por:

Errores en la prctica de la dilucin. Contaminacin del lquido de dilucin. Error en el montaje y / o llenado de la cmara. Error en los clculos a realizar. Error en el recuento propiamente dicha. El margen de error puede disminuirse con una buen prctica y destreza del operador, pero existe una sistemtica a seguir para evitar o disminuir el error en el recuento propiamente dicho, puesto que de no ser as, sera sencillo que una clula fuese contada por partida doble o a la inversa. La sistemtica a seguir es la siguiente: El recuento presupone un conocimiento exacto de las lneas lmite de las cmaras de conteo utilizadas. stas se pueden ver en la ilustracin. Para que las clulas, que estn en o cerca de las lneas de limitacin, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo, hay que atenerse a determinadas reglas. Se cuentan todas las clulas dentro de una zona de medicin definida. Tambin se cuentan las clulas (marcadas en negro), que se apoyan o tocan en las 2 caras: la lnea de medida izquierda y superior. Esto tambin es vlido para el tipo de la operacin de conteo propiamente dicha, que debe efectuarse en forma de meandro.

El recuento se efecta en el ngulo superior izquierdo en direccin de la flecha.

2. RECUENTO AUTOMTICO: CONTADORES ELECTRNICOS. Los autoanalizadores hematolgicos o contadores electrnicos, son actualmente la opcin en los laboratorios modernos. El margen de error obtenido mediante los mtodos manuales, el cual oscila en torno al 20%, se ve disminuido enormemente con el desarrollo de estos aparatos, siendo el margen de error en torno o incluso inferior al 1%. Tal y como se podr observar a lo largo de este apartado, como norma general los contadores electrnicos no se limitan a llevar a cabo el recuento celular de los distintos elementos formes. Por lo general proporcionan los resultados de todos y cada uno de los parmetros constituyentes del hemograma. 2.1. COMPONENTES QUE CONSTITUYEN EL CONTADOR ELECTRNICO. DILUIDOR. Disminuye la concentracin de la sangre hasta el nivel adecuado para el funcionamiento del contador. Generalmente diluye poco para el recuento de leucocitos (por ejemplo, a 1/300 en el contador ABX MICROSOT) y mucho para el recuento de hemates (por ejemplo, a 1/20.000 en el contador ABX MICROSOT). La dilucin realizada por dicho elemento variar dependiendo del contador electrnico en cuestin, aunque todo ello no es necesario que sea tenido en cuenta en el trabajo del tcnico. Como lquido diluyente utiliza una solucin isotnica con capacidad conductora. COMPRESOR- ASPIRADOR. Aporta la presin y el vaco necesarios para transportar la sangre, convenientemente diluida, al dispositivo de medida.

DISPOSITIVO DE MEDIDA. Es la cmara donde se cuentan realmente las clulas sanguneas (cmara de medida o de lectura). Su diseo depende del mtodo de recuento utilizado por cada modelo de contador. Puede basarse en un sistema de deteccin celular por medida de la impedancia o en sistemas pticos de deteccin celular. En los contadores electrnicos ms avanzados, una vlvula de cermica reparte la muestra hacia distintas cmaras de medida. Cada cmara de medida est especialmente diseada para el recuento de un tipo celular (glbulos rojos, leucocito s o plaquetas) o para ]a determinacin de hemoglobina. TRANSDUCTOR. Transforma las seales, procedentes del dispositivo de medida, en impulsos elctricos. Suele ser un fotomultiplicador. DISCRIMINADOR. Diferencia los impulsos elctricos generados por cada uno de los tipos de clulas sanguneas. PROCESADOR. Recoge los datos obtenidos, los procesa y los proyecta en una pantalla. REGISTRADOR. Imprime en papel los resultados conseguidos. 2.2. MTOTODOS ELECTRNICOS DE RECUENTO CELULAR. Cada contador electrnico, se basa en su propio fundamento para obtener los resultados. En este apartado trataremos de adentrar al alumno en el interior del autoanalizador, para que trate de entender cmo se hace posible el recuento. Lgicamente, no se recogen todos y cada uno de los fundamentos existentes, pero si los ms habituales e importantes. 2.2.1. MTODO DE LA RESISTENCIA ELCTRICA O DE LA IMPEDANCIA. Es el utilizado por los primeros contadores, ya que fue descubierto por Coulter en 1956. Se basa en lo siguiente:

Mientras que las clulas sanguneas conducen mal la electricidad, el lquido diluyente es un buen conductor de la electricidad (posee una gran conductividad elctrica). El dispositivo de medida consiste en un pequeo orificio, a travs del cual se hace pasar la sangre diluida. Tiene colocados un electrodo a su entrada y otro a su salida. Tambin se hace pasar una corriente elctrica constante a travs de ese mismo orificio. Si el orificio es atravesado solamente por lquido diluyente, la resistencia elctrica medida por los electrodos es mnima y constante, pero cuando el orificio es atravesado por una clula sangunea, se produce un aumento de la resistencia elctrica y un cambio de potencial entre los electrodos.

El nmero de seales elctricas generadas indica el nmero de clulas presentes en la sangre y la amplitud de estas seales es directamente proporcional al volumen celular. De este modo es posible la identificacin de las clulas y por tanto el recuento. 2.2.2. MTODO DE LA DISPERSIN DE LA LUZ O DE LA DIFRACCIN. MTODO DEL CAMPO OSCURO. El dispositivo de medida consiste en un capilar por el que circula la sangre diluida y que es atravesado por un haz de luz halgena. Cuando no pasan clulas a lo largo del capilar, el haz de luz incide sobre una zona no sensible (disco campo oscuro); pero si una clula pasa a travs del capilar, dispersa los rayos del haz luminoso hacia afuera del disco, donde son captados por un fotodetector. El nmero de seales luminosas detectado indica el nmero de clulas presentes en la sangre, y la intensidad de la dispersin luminosa producida por cada una de ellas es directamente proporcional al tamao y contenido de las clulas, siendo de este modo posible la identificacin y por tanto el recuento. MTODO DEL RAYO LSER. El dispositivo de medida consta de un detector situado detrs de un capilar por el que circula un flujo continuo de sangre diluida; es pues un citmetro de flujo. Un rayo lser atraviesa el capilar y se dirige hacia el detector. Cuando no pasan clulas a lo largo del capilar, el rayo lser incide sobre el detector, pero si una clula pasa a travs del capilar, el rayo lser es interceptado por ella y deja de incidir sobre el detector. El nmero de interferencias indica el nmero de clulas presentes en la sangre, y el grado de interferencia que produce cada clula a su paso es directamente proporcional a su tamao. En estos contadores, la luz lser puede ser, por ejemplo, un lser de helio-nen polarizado verticalmente a una longitud de onda de 632,8 nm (el empleado en los contadores CELL-DYN 3000 y 3500 de los Laboratorios Abbott). 2.3. PARMETROS QUE DETERMINA UN CONTADOR ELECTRNICO. Los modernos contadores electrnicos pueden llegar a determinar hasta ms de 50 parmetros. Entre stos cabe destacar los siguientes:

Nmero de hemates por mm3 de sangre. Porcentaje de reticulocitos. Nmero de leucocitos por mm3 de sangre. Frmula leucocitaria. Nmero de plaquetas por mm3 de sangre. ndices hematimtricos (eritrocitarios, reticulocitarios, leucocitarios y plaquetarios). Valor hematocrito. Concentracin de hemoblobina en la sangre.

Velocidad de sedimentacin globular. Todos estos parmetros constituyen las determinaciones analticas incluidas en el hemograma o tambin denominado perfil hematolgico bsico, del cual trataremos en temas sucesivos. LDC- Hematologia U.D. 5 -7-

Medida del crecimiento microbiano Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parmetros algunos de los cuales presentar a continuacin. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida ms fcil) podemos medir el resto. En este apartado revisaremos los principales mtodos de recuento de microorganismos. Una informacin ms completa puede encontrarse en la conexin Mtodos de recuento. Los mtodos para el seguimiento de la evolucipon de un cultivo microbiano pueden clasificarse en directos e indirectos. Los mtodos directos se basan en la medida de la evolucin del nmero de clulas vivas (tcnicas de plaqueo) o del nmero de partculas (tcnicas microscpicas y de contadores de partcuas). Ls mtodos indirectos se basan en la medida de algn parmetro del cultivo que nos permite deducir informacin sobre la evolucin del nmero de microorganismos.

La eleccin de un mtodo de seguimiento del cultivo en concreto depende de las caractersticas del cultivo y del proceso. Entre los mtodos principales de recuento de microrganismos podemos destacar: 1.- Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando microscopa de contraste de fae. Para ello se cuenta el nmero de partculas en un volumen determinado usando una clula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en e que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rpido y sencillo; pero no permite distinguir clulas vivas inmviles de clulas muertas. 2.- Contaje de partculas utilizando sistemas automticos del tipo Coulter Counter. La operacin de estos sistemas es sencilla (mtodo de empleo) y permite rpidamente determinar el nmero de patculas presentes en una suspesin y la distribucin de sus tamaos. El problema es que no distingue entree clulas vivas y muertas ni entre clulas y agregados de material insoluble presente en la suspensin del cultivo. 3.- Tcnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultuivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las clulas aisladas dar lugar, despus de la incubacin correspondiente, a una colonia de forma que el nmero de estas nos permitir estimar el nmero de clulas presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo slido) o en profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta ltima opcin permite realizar el recuendto de microorganismos microaerfilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. 4. Tcnicas turbidomtricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partculas en suspensin (clulas) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colormetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad ptica. La limitacin de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no

distingue clulas vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 clulas por mililitro. 5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtracin del cultivo a travs de una membrana que retenga las clulas y su posterior desecacin hasta peso constant. El sistema, obviamente, no disferencia clulas vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. 6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisiin de luz por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentracin de ATP decae rpidamente en las clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamenta las clulas vivas. Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado tcnicamente para poder ser utilizados como sistemas online. En una opracin on line no es necesario extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso de fermetaciones en gran volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y disminuye los riesgos de contaminacin. Antes de cerrar este apartado hay que sealar que en la naturaleza hay muchsimos ms microorganismos de los que podemos detectar por la mayora de los sistemas de recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar nicamete proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias causas entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofa y la oligotrofa (inhibicin por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos microorganismos.

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