Efecto de los reguladores de crecimiento en la callognesis de Capsicum annuum L variedad aviculare a partir de embriones cigtigos

A.D. Cardenas-Martn, J.C. Correa-Llano & P.M. Osorio-Montalvo

Laboratorio de Biotecnologa Vegetal, Instituto Tecnolgico de Mrida, Av. Tecnolgico km. 4.5 S/N C.P. 97118, Mrida, Yucatn, Mxico.

Palabras clave: Capsicum annuum L var. aviculare, chile max, callognesis.

Resumen Se probaron varios tratamientos con diversas combinaciones de reguladores de crecimiento para inducir la callognesis en chile max. El explante utilizado en el experimento consisti en semillas cortadas transversalmente de chile max para poner en contacto el embrin cigtico con el medio de cultivo. El medio bsico utilizado fue el Murashige & Skoog (1962) adicionado con el 3% de sacarosa. Se evalu la eficiencia del protocolo de descontaminacin, el % de necrosamiento y la eficiencia en la produccin de callo. El efecto del 2,4-D en la callognesis en embriones somticos cortados de Capsicum annuum L var. aviculare result ser ms efectivo que el efecto del AIA. El uso de concentraciones bajas de BAP combinado con 2,4-D present buenos resultados comparado con el uso de altas concentraciones de BAP. Las peores respuestas se obtuvieron en tratamientos que contenan combinaciones de AIA con BAP tanto en altas como bajas concentraciones. Abreviaciones: 2,4-D Acido 2,4 diclorofenoxiactico; AIA Acido 3 indol-actico; BAP 6Bencilaminopurina; MS Murashige & Skoog (1962).

Introduccin El chile max clasificado como Capsicum annuum L., variedad aviculare (DArcy y Eshbaugh), ha sido causa de mltiples controversias entre los taxnomos, quienes han dado a esta variedad distintos nombres, como los enlista Long (1998): minus (Figherhut); baccatum (Terp); minimun (Heiser y Pickersgill); y variedad glabriusculum (Heiser y Pickersgill). Una situacin semejante se presenta en los diversos nombres vulgares o comunes que recibe este pequeo chile en las distintas regiones del pas: chile max, chiltepn, chile piqun, chiltepec, chiltepillo, chilpaya,

chile de monte, chile parado, pjaro pequeo, amomo, pico de paloma, pico de pjaro, chile de Chiapas, ululte, totocuitlatl, chile mosquito, tlilchilli, milchili y diente de tlacuache (Long, 1998). El chile max es un arbusto silvestre perenne, cuyo fruto es una baya redonda u oblonga de 3 a 6 mm de dimetro que crece en posicin erctil. En estado inmaduro el fruto es de color verde oscuro, debido a la alta concentracin de clorofila; sin embargo, al madurar se torna de color rojo, causado por una alta cantidad de pigmentos rojos conocidos como licopersinas. Las plantas de chile max alcanzan su madurez reproductiva entre los seis y diez meses de edad. La floracin comienza durante los meses de mayo y dura hasta agosto, y la fructificacin es de junio a octubre. El color rojo de los frutos atrae a diversas aves, que al comerlos se encargan de dispersar las semillas. El chile max fuera de la Pennsula de Yucatn crece bajo la proteccin de los rboles en sitios montaosos cercanos a mrgenes de arroyos y caones (Nabhan 1985; Nabhan et al., 1990; Gentry, 1942 ). Aunque se han llevado a cabo algunos esfuerzos para propagar plantas de chile max, este es el nico chile que no ha podido ser domesticado. El chile max requiere de cierto tipo de suelo, humedad y sombra, condiciones que solo se las brinda el medio ambiente natural. Un chile max que se siembra en maceta no tiene la forma, el color, el tamao ni el sabor de los que se dan en la condiciones silvestres (Bauelos, 2008). La planta, adems, es difcil de obtener en el campo, debido a que los pobladores de la regin se tienen que introducir al monte y recorrer grandes distancias para hallarla. No obstante, la semilla puede germinar en un ambiente natural despus de haber sido previamente ingerida por las aves, pasando por su tracto digestivo y defecarlas, contribuyendo de esta manera a su distribucin y germinacin (Bauelos et al., 2008; Arcia, 1985). La planta vive en lugares frescos, pues depende de una temperatura entre 15 y 30 C, luz (fotoperiodo de 14 horas oscuridad y 10 horas luz), humedad relativa entre 75-100% (Villaln et al., 2003), y, sobre todo, que se encuentra distribuida bajo la sombra de rboles y arbustos; infortunadamente se conoce muy poco sobre la germinacin de la semilla. Por otra parte, Medina (2003) afirma que el chile max es un recurso que actualmente se encuentra bajo fuerte presin antropognica debido a su extraccin, pues al parecer las formas de corte no han sido las ms adecuadas. Adems, existe presin en cuanto a la eliminacin cuando se desmontan grandes extensiones de matorral para dar paso a otras actividades como la agrcola y pecuaria. En condiciones experimentales, la germinacin vara segn los diferentes parmetros fsicoqumicos (temperatura, humedad, luz y fitohormonas). Existe una fitohormona conocida como cido giberlico (AG) que puede romper la latencia de las semillas y que frecuentemente reemplaza la necesidad de estmulos ambientales, tales como luz y temperatura (Hernndez, 2004).

Debido a que existe poca informacin sobra la germinacin del chile max y su posible domesticacin, siendo este un recurso alimenticio y econmico para los pobladores de la regin, es necesario implementar alternativas que garanticen el recurso para las futuras generaciones. Por tal motivo, en el presente proyecto se pretende valorar si los embriones de las semillas de chile max, de la regin Yucateca, tratadas con diversos reguladores de crecimiento vegetal, estimulan la respuesta callognica del explante, para posteriormente desarrollar un protocolo de organognesis o embriognesis somtica indirectas para obtener plntulas de acuerdo con las condiciones ambientales de Yucatn.

Materiales y mtodos

Recoleccin del material vegetal Las semillas de chile max fueron colectadas en el municipio de Mrida, Yuc., ubicado a 40 km de la lnea costera del Golfo de Mxico. La poblacin tiena una altitud promedio de 8 metros sobre el nivel del mar. En general, la localidad posee una orografa plana, clasificada como llanura de barrera; sus suelos son generalmente rocosos o cementados. El tipo de suelo en la ciudad es leptosol. Se colectaron 10 gramos de chile de forma manual, se realiz la seleccin de frutos que tuvieran un color rojo intenso y tamao prominente (Figura 1a). Posteriormente se sec a la sombra por un periodo de 2 semanas. Una vez transcurridas las dos semanas del secado, se abri el fruto y se extrajeron las semillas, seleccionando aquellas que estuvieran en buen estado (color, tamao y ausencia de necrosis).

Figura 1. a) Frutos frescos de chile max. b) Semillas axnicas. c) Corte de semillas.

Tratamiento de la semilla La desinfeccin de las semillas se realiz aspticamente dentro de un gabinete de flujo laminar, con inmersin en etanol al 70% durante 5 minutos, posteriormente se realiz otra inmersin en Hipoclorito de Sodio comercial (Cloralex ) al 30% por 15 minutos, seguido por varios lavados en agua destilada estril despus de cada inmersin para la eliminacin de los residuos de los desinfectantes (Figura 1b).

Induccin de la callognesis Para inducir la callognesis, antes de ser establecidas en frascos gerber, las semillas fueron seccionadas transversalmente para exponer el embrin a los diferentes tratamientos que se probaron (Figura 1c). Todos los tratamientos contenan las sales de Murashige & Skoog (1962) y siempre estuvieron suplementados con el 3% de sacarosa. El medio fue solidificado con 2.2 gr de gelrite y el pH fue ajustado a 5.7 antes de que fuera esterilizado en autoclave (121C durante 15 min). Los cultivos fueron incubados a 25 2C bajo condiciones de fotoperiodo (16 h luz). Se evalu 1 semilla cortada en 2 partes por cada frasco, con 5 repeticiones por tratamiento y fueron evaluados por un periodo de 50 das.

Resultados y discusin

Protocolo de descontaminacin Dado que solo tuvimos 4 frascos contaminados de los 50 donde establecimos las semillas cortadas podemos determinar que tuvimos un 8% de contaminacin, lo que nos indica que el empleo de etanol al 70% y cloro al 30% seguido de enjuagues de agua destilada estril comprueba ser una estrategia muy efectiva empleada en el protocolos de descontaminacin como el de Santana-Buzzy (2005).

Respuesta general de los explantes a los tratamientos Transcurridos 50 das despus de su establecimiento in vitro los explantes mostraron la siguiente respuesta: de los 11 tratamientos evaluados en 5 se obtuvo una respuesta callognica (45.45%), en 3 se present fenolizacin (27.27%), 3 se necrosaron (27.27%) y 2 no presentaron ninguna respuesta (18.18%) como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Efecto de la combinacin de reguladores de crecimiento en la callognesis del chile max.

Tratamiento (T) T0: MS Control T1: MS + 2,4-D (4.52 M) T2: MS + 2,4-D (4.52 M) + BAP (13.32 M) T3: MS + 2,4-D (4.52 M) + BAP (26.64 M) T4: MS + 2,4-D (9.05 M) + BAP (13.32 M) T5: MS + AIA (11.42 M) T6: MS + AIA (11.42 M) + BAP (13.32 M) T7: MS + AIA (11.42 M) + BAP (26.64 M) T8: MS + AIA (22.83 M) + BAP (13.32 M) T9: MS + BAP (13.32 M) T10: MS + BAP (26.64 M)

Respuesta Necrosado Callo semicompacto de 7 mm Callo friable de 5 mm Necrosado de 3 mm Callo friable de 4 mm Necrosado de 2.5 mm Necrosado Sin respuesta Sin respuesta Callo compacto de 4 mm Callo compacto de 3 mm

Respuesta no favorable Los tratamientos T7 (MS + 11.42 M AIA + 26.64 M BAP) y T8 (MS + 22.83 M AIA + BAP 13.32 M) no tuvieron respuesta alguna y el explante se conserv igual despus de 50 das de cultivo (Figura 2a).
En T0 (MS Control) y T6 (MS + 11.42 M AIA + 13.32 M BAP) los explantes se necrosaron completamente (Figura 2b) y no crecieron en absoluto a comparacin de T3 (MS + 4.52 M 2,4-D + 26.64 M BAP) y T5 (MS + 11.42 M AIA) que al principio si crecieron algunos milmetros pero finalmente terminaron necrosndose (Figura 2c).

Figura 2. a) Explantes sin respuesta. b) Explantes necrosados. c) Explantes necrosados que tuvieron un leve crecimiento.

Respuesta favorable Entre los tratamientos que generaron callo friable estuvieron T2 (MS + 4.52 M 2,4-D + 13.32 M BAP) y T4 (MS + 9.05 M 2,4-D + 13.32 M BAP), los cuales tuvieron una apariencia blancuzca-cristalina y se pudieron observar que estaban formados por pequeos agregados celulares. El callo en T2 (Figura 3b) tuvo un crecimiento de 5mm y en T4 4mm de dimetro (Figura 3c). Los tratamientos que generaron callo compacto fueron T9 (MS + 13.32 M BAP) y T10 (MS + 26.64 M BAP), tuvieron una coloracin amarillenta-marrn y no se distinguan los agregados celulares como en T2 y T4. Los callos en T9 (Figura 3d) y T6 (Figura 3e) tuvieron un crecimiento de 4mm y 3mm respectivamente. En el caso de T1 (MS + 4.52 M 2,4-D) se presento un crecimiento desproporcionado comparado con los dems tratamientos (Figura 3a) pues el callo alcanz un tamao de 7mm de dimetro y tuvo caractersticas en apariencia tanto de callo friable como de callo compacto, entonces podemos decir que en T1 prolifer callo de tipo semicompacto.

Figura 3. (a) T1: MS + 2,4-D (4.52 M). (b) T2: MS + 2,4-D (4.52 M) + BAP (13.32 M). (c) T4: T4: MS + 2,4-D (9.05 M) + BAP (13.32 M). (d) T9: MS + BAP (13.32 M). (e) T10: MS + BAP (26.64 M).

Analizando los 3 tipos de respuesta callognica que tuvieron estos 5 tratamientos entre los 11 que se probaron, podemos decir que 18.18% present callo friable, 18.18% callo compacto y 9.9% callo semicompacto. De estos 5 tratamientos determinamos que sin lugar a dudas el mejor tratamiento fue T1 por el grado de crecimiento que tuvieron los callos y por tener ambas caractersticas de callo (compacto y semicompacto). Con este experimento podemos sacar las siguientes conclusiones: El efecto del 2,4-D en la callognesis en embriones somticos cortados de Capsicum annuum L var. aviculare es ms efectivo que el AIA, ya que el mejor tratamiento nicamente contuvo 4.52 M de 2,4-D. El uso de concentraciones bajas de BAP combinado con 2,4-D presentaron buenos resultados comparado con el uso de altas concentraciones de BAP. Las peores respuestas se obtuvieron en tratamientos que contenan combinaciones de AIA con BAP tanto en altas como bajas concentraciones.

Bibliografa

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