POLIMORFISMOS El avance en la biologa molecular a dado un gran impulso a nuevas tcnica relacionadas a la gentica y uno de los grandes logros

fue determinar una secuencia de bases de un fragmento de ADN. Saiki et al, aportaron revolucionarias tcnicas en esta disciplina, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Cientficos estadounidenses ayudados de estas y otras tcnicas, iniciaron en 1990 el proyecto del genoma humano, cuyo objetivo fue descifrar su secuencia completa, en el ao 2001 con ayuda de distintos pases entre ellos, Alemania, Japn, Canad, Francia y reino unido se public el primer borrador de la secuencia del genoma humano. En 2003 se public un nuevo borrador que contena el 99% de la secuencia completa. A partir de esto se conoce que el genoma humano contiene entre 30 y 35,000 genes y que solo alrededor del 5% participa en la codificacin de la informacin. Ya en el campo de la gentica, Ford haba definido en el ao 1940 el polimorfismo de una poblacin como la ocurrencia en un mismo ambiente de dos o ms formas discontinuas de una especie, en proporciones tales que la ms rara de ellas no pueda ser mantenida en la poblacin simplemente por mutacin recurrente. Un polimorfismo gentico aunque sea estimado a travs de una pluralidad de formas fenotpicas (morfologa externa, variantes enzimticas etc.) se podra definir como un carcter mendeliano (monognico) que se presenta al menos bajo dos formas alternativas en una poblacin. Su origen est en la ocurrencia de mutaciones, pero su mantenimiento no puede depender de la recurrencia de una mutacin. Se podra por consiguiente hablar de polimorfismos cromosmicos o de otros fundamentados en alteraciones de la secuencia de ADN, y slo faltara el establecimiento de un criterio de valoracin de carcter cuantitativo. La mayor parte de los autores coinciden en aceptar que ninguna de las variantes allicas tenga una frecuencia inferior al 1 %. El primer polimorfismo descrito en la especie humana fue el descubrimiento del grupo sanguneo ABO (Landsteiner en 1900), y durante los 55 aos siguientes todos los polimorfismos descritos se refirieron a diferentes antgenos de superficie de los glbulos rojos. El advenimiento de la tecnologa del ADN recombinante a mediados de los setenta supuso la apertura de una nueva va para la identificacin de marcadores genticos polimrficos mediante el anlisis directo de las propias molculas de ADN. Nace por lo tanto los polimorfismos del ADN.

LOS TIPOS DE POLIMORFISMOS Los polimorfismos de ADN se clasifican segn dos criterios: por su propia naturaleza y por el sistema de deteccin. Tipo I: Fragmentos de restriccin de longitud variable (RFLPs).- La causa del polimorfismo radica normalmente en la prdida de una o ms dianas de restriccin debido a mutaciones puntuales (transiciones o transversiones), y se detectan mediante electroforesis en geles de agarosa. Tipo II: Repeticiones en tndem de secuencias cortas (STRs).- En este caso el polimorfismo consiste en la existencia de un nmero variable de repeticiones en tndem de una secuencia bsica que oscila entre un solo nucletido y una kilobase. Se detectan tambin mediante electroforesis en el mismo tipo de geles, salvo los micro satlites que, suelen necesitar geles de poliacrilamida. Tipo III: Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales que no afectan a la longitud de los fragmentos de restriccin ni alteran la secuencia de ninguna diana conocida.- En estos casos existen mtodos indirectos para comprobar la naturaleza polimrfica de un fragmento de ADN (SSCP, DGGE etc.), y lgicamente est el recurso de poder secuenciar directamente el ADN.

POLIMORFISMO DEL TIPO II (STRs) En todos los genomas, y muy especialmente en el humano, existen secuencias cortas que se repiten en tndem y estn sometidas a una alta tasa de variabilidad. La longitud de estas unidades bsicas de repeticin oscila entre 1 nucletido y 2 kilobases. Este tipo de secuencias ha sido bautizado con diferentes nombres, pero parece bastante aceptada la separacin en dos categoras segn el tamao de la unidad repetida y el sistema de deteccin. Cuando la unidad bsica es de unas pocas bases (entre una y seis) se suelen denominar micro satlites o polimorfismos de longitud de secuencia simple. Si la unidad de repeticin es mayor (normalmente entre 10 y 15 pares de bases), se habla de mini satlites o repeticiones en tndem de nmero variable (VNTR). Este tipo de polimorfismos se ven favorecidos por la ocurrencia de "crossing-over" desiguales y otros mecanismos moleculares (como el "slippage" durante la replicacin) que contribuyen a su extensin.

El resultado son regiones hipervariables y polimorfismos multiallicos, que a la hora de interpretar sus patrones de segregacin pueden sufrir modificaciones con una frecuencia superior a la de las mutaciones puntuales, apareciendo en los hijos variantes allicas que no existan en los padres. De las dos categoras consideradas, los mini satlites son lgicamente menos polimrficos y, curiosamente, tienden a estar agrupados en las regiones proterminales de los cromosomas humanos. Pueden distinguirse fcilmente mediante Southem blot e hibridacin, pero los ms pequeos necesitan ser amplificados mediante PCR. Fue precisamente el desarrollo de esta tcnica (PCR), que permita amplificar segmentos cortos de ADN con gran rapidez y eficacia, lo que hizo posible el descubrimiento de los micro satlites. Se han descrito un buen nmero de micro satlites en todos los ADN eucariticos excepto, curiosamente, en levaduras. El comit de la HGMlO tena ya censados 368 micro satlites con unidades de repeticin en tomo a 4 pares de bases y longitudes totales de unos 20 pares de bases. La mayora de estos datos estn recogidos en la Genome Data Base (GDB) del Howard Hughes Medical Institute y la John Hopkins University (Baltimore, USA). Se sabe que el 76% de las unidades bsicas de repeticin son A, AC, AAAN y AG (siendo N cualquier nucletido). Los micro satlites AC son los ms frecuentes; aparecen cada 30 kilobases y se distribuyen por igual en las regiones 5'y 3'no traducibles de los genes y en las regiones intrnicaso Como dato anecdtico, el 80% de las repeticiones A, AAAN y AAN, Y el 14 50% de los micro satlites AT, se han encontrado en el extremo 3' de elementos Alu. En el cromosoma X se han descrito micro satlites de 3 y 4 pares de bases cada 300500 kilobases, aunque esta misma cadencia parece repetirse por todo el genoma humano. Para ello, rastre en las secuencias de ADN recogidas en bases de datos, y secuenci numerosos clones M 13 que hibridaban con sondas poly (dCdA).poly (dG-dT). El resultado fue el hallazgo de tres tipos de micro satlites:

1) Secuencias de repeticin perfecta.- Consistentes en repeticiones AC en tndem sin interrupciones ni otro tipo de secuencias repetidas adyacentes. 2) Secuencias de repeticin imperfectas.- Consistentes en dos o ms series de repeticiones CA interrumpidas por bases nucleotdicas que no se repiten. 3) Secuencias de repeticin compuestas.- Pueden ser tambin perfectas o imperfectas segn el status de las series CA. La deteccin del micro satlite es algo ms sofisticado que la de mini satlites. Al tratarse de secuencias muy cortas pueden clonarse y secuenciarse con relativa facilidad a partir de ADN genmico total o de regiones cromosmicas especficas. El procedimiento ms utilizado es la elaboracin de genotecas en vectores de secuenciacin, cortando el ADN genmico con endonucleasas de restriccin de corte frecuente (p.e., Sau3AI, o combinaciones de AluI, RsaI y HaeIII). Despus se seleccionan los clones que son capaces de hibridar con oligonucletidos especficos por ejemplo de tipo (AC)n' Los fragmentos de ADN resultantes son finalmente analizados en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (geles de secuenciacin). De esta forma se pueden distinguir, si el tamao del fragmento no es excesivo, diferencias de tan slo uno o dos nucletidos de longitud.

APLICACIONES DE LOS POLIMORFISMOS del tipo II (SRTs). En el campo del anlisis forense se da una gran aplicacin de la gentica como tal, donde los elementos ms utilizados son los polimorfismos. Las muestras ms frecuentes en donde se encuentra DNA son: la sangre fresca, la saliva, el semen, fluidos mixtos (semen-sangreepitelios) tejidos cadavricos (tejidos blandos, huesos o dientes), as como fluidos en soportes slidos como hisopos, papel filtro, etc. El anlisis de los polimorfismos en gentica forense se puede dividir en dos grandes grupos: aquellos procedimientos clsicos o antiguos de anlisis que utilizan sondas multilocus (MLP, multilocus probes) unilocus (SLP, single locus probes) y aquellos procedimientos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR, que actualmente son ms utilizados mundialmente.

Desde principios de la dcada de los noventa se ha extendido con gran xito el uso del micro satlites STRs. El anlisis de estos, ha permitido establecer que son elementos extraordinariamente tiles en la identificacin humana y en el mapeo gentico, debido a su elevado polimorfismo (gran poder de discriminacin), tasa de mutacin relativamente baja, tamao pequeo y ubicacin cromosmica establecida. Adems, varios de estos marcadores pueden amplificarse mediante PCR de forma simultnea (multiplex). La combinacin de estos marcadores es la base de los bancos de datos para almacenar la informacin. El CODIS utiliza un conjunto estndar de 13 regiones STRs especficos.

Aun cuando los marcadores STRs son actualmente los ms informativos para las pruebas forenses, ahora se ha comenzado a trabajar con el mejoramiento de stos para muestras sumamente degradadas. La tcnica se basa en un simple cambio en la posicin de las sondas (primers) para la amplificacin de los loci de STRs, stos se posicionan ms cerca del inicio de la repeticin en tndem, lo que genera un producto mucho ms pequeo. Como ejemplo, ya se han aceptado 3 nuevos miniSTRs (D10S1248, D14S1434, D22S1045) como loci estndar en el Interpol Europeo, el cual comprende de 10 loci STR.

METODO DE IDENTIFICACION EN GENETICA FORENSE 1. Extraccin del ADN.- Se extrae ADN de casi cualquier tejido humano. El ADN extrado de las pruebas policiales se comparar con el ADN extrado de muestras de referencia, de individuos sospechosos. 2. Amplificacin por PCR.- Los cebadores de ADN se han optimizado para permitir la amplificacin de los 13 loci STR en una sola mezcla de reaccin. Ajustando cuidadosamente la distancia desde los cebadores hasta la secuencia tetramrica repetitiva, los productos de diferentes loci no se solaparn durante la electroforesis en gel. Se pueden analizar las longitudes de los 13 distintos ADN amplificados mediante la escala de 100 a 320 pb y compararlos con los patrones de referencia que contienen los alelos conocidos para cada uno de los loci STR. 3. Deteccin de los ADN tras la amplificacin por PCR.- Los cebadores de PCR contienen molculas fluorescentes unidas de forma covalente, a modo de marcadores de diferente

"color". Tras la reaccin de PCR se separan los ADN segn su longitud en un aparato de electroforesis. Los picos de ADN se van detectando segn salen del gel, mediante activacin por lser. Los aparatos de secuenciacin que se usan para separar los alelos y detectarlos son del mismo tipo que los que se usan actualmente en el Proyecto de Secuenciacin del Genoma Humano, con una salida de datos digital que se puede analizar mediante programas de ordenador especficos. ANALISIS DE PATERNIDAD Otro ejemplo ms prctico y que no se visualizara a fondo es el anlisis de prueba de paternidad, como ya se mencion los STR sucede que son una fuente muy rica de marcadores muy polimrficos los cuales pueden ser detectados y amplificados mediante la tcnica conocida como PCR (reaccin en cadena de la polimerasa). Los alelos de estos loci se pueden diferenciar unos de otros segn el nmero de copias de la secuencia repetitiva contenida dentro de la regin previamente amplificada mediante la tcnica de PCR. Para distinguir uno de otro se separan los fragmentos mediante electroforesis sobre geles de poliacrilamida capaz de distinguir los fragmentos en funcin de sus tamaos diferentes. Luego estos fragmentos pueden visualizarse usando deteccin por radiactividad, fluorescencia o coloracin con sales de plata. El anlisis mediante el mtodo STR es ms tolerante que otros mtodos cuando se usa plantillas de ADN degradadas puesto que los productos de la amplificacin por PCR miden menos de 400 pares de bases en longitud, estas resultan ser mucho ms pequeas que las obtenidas mediante anlisis va AMP-FLP o VNTR. Adems de estas ventajas, los loci STR escogidos contienen alelos de longitudes discretas y separables. Esto permite la construccin de escaleras allicas que contienen fragmentos de las mismas longitudes que muchos de todos los alelos conocidos para cada locus. El mtodo STR tiene un poder de discriminacin de un hombre entre cada 5,180'000,000 individuos.

CONCLUSIONES Y BIBLIOGRAFIA La presente investigacin hace referencia a los polimorfismos, estas secuencias son tan importantes en el genoma humano como su investigacin para las diversas aplicaciones que pueden tener, su importancia radica en que estos dan caractersticas propias a cada

individuo, como por ejemplo resistencia a algn patgeno, que a nivel general pues genera la gran diversidad de la raza humana y por lo tanto da un punto de vista acerca de lo maravilloso de la gentica humana. El estudio de estos polimorfismos est generando actualmente nuevas aplicaciones para deteccin y comprensin del genoma.

Archivo: Polimorfismos en el ADN humano. Jos Fernndez Piqueras. Catedrtico de Gentica, Universidad Autnoma de Madrid. Articulo revista: Gentica forense Cristina Rodrguez Carln, Beatriz Rodarte Murgua, Montserrat Monter Rosales, Ada Cristina Coss Rojas, Amrica Castaeda Sortibrn y Rosario Rodrguez Arnaiz. Revista Fuente Ao 2, No. 4, Septiembre 2010. Polimorfismos genticos: Importancia y aplicaciones. MARCO ANTONIO CHECA CARATACHEA Estudiante de Doctorado en Ciencias Biomdicas, Laboratorio de Biologa Molecular. Unidad de Investigacin, INER Ismael Coso Villegas.

Ingeniera en biotecnologa Gentica Molecular Dra. Mayra Judith Garca Robles.

Elaboracin de reporte de investigacin sobre los mtodos para dar mantenimiento y variacin al material gentico: polimorfismos.

Cuevas Moreno Juan Angel Grupo: 5.2

Lunes, Abril 15 de 2013.