Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
TP 6
Espectrofotometra de Fluorescencia
Fundamento
La fluorescencia es uno de los fenmenos luminiscentes que tienen lugar con ciertos tomos y molculas capaces de absorber radiacin de cierta longitud de onda para, posteriormente, emitir radiacin a una longitud de onda mayor. Cuando el analito absorbe radiacin experimenta una transicin a un estado electrnico de mayor energa o estado excitado. Desde ese estado las molculas vuelven a su estado fundamental y pueden hacerlo de diversas maneras. Dos de las posibles formas de hacerlo implican emisin de fotones: fluorescencia y fosforescencia. La primera se lleva a cabo desde un estado excitado singlete, mientras que la fosforescencia lo hace desde un estado triplete. El resto de los procesos de desactivacin son no radiativos: relajacin vibracional, conversin interna, conversin externa, cruce entre sistemas. La fluorescencia permite realizar determinaciones analticas con cierto grado de selectividad y lmites de deteccin bastante mas bajos que los mtodos basados en absorcin. Sus lmites de deteccin, dependiendo de la sustancia que se trate y la potencia de la fuente empleada, puede ir desde algunos ppm hasta ppb y en algunos casos hasta ppt. La potencia de la emisin fluorescente es directamente proporcional a la concentracin de analito, lo cual permite que su utilizacin con fines analticos; pero tambin depende del tipo de analito y de factores instrumentales. La naturaleza qumica del analito determina que ste tenga mayor o menor capacidad (eficiencia) para absorber radiacin de determinada longitud de onda y emitirla como radiacin fluorescente. Respecto de los factores instrumentales, para una misma eficiencia de fluorescencia, a mayor potencia de luz incidente mayor ser la potencia de fluorescencia. Por esta razn los avances tecnolgicos que mejoraron los lmites de deteccin se basaron en mejorar las intensidades de las fuentes de luz. Las lamparas de mercurio y tungsteno se reemplazaron por lamparas de xenn de descarga continua y actualmente se utilizan lamparas de xenn de descarga pulsada (flash). Estas lamparas emiten luz policromtica o blanca y se debe utilizar un monocromador (de excitacin) para que permite seleccionar la longitud de onda incidente desperdiciando la potencia que se emite a otras longitudes de onda. En casos especiales se estn empleando fuentes de luz lser las cuales que generan radiacin de alta intensidad y monocromtica (Laser Induced Fluorescence, LIF).
TP 6
Es un antipirtico eficaz y se usa para reducir la fiebre en muchas enfermedades. Fue el nico remedio conocido para la malaria hasta el desarrollo, en los ltimos aos, de frmacos sintticos. Se cree que la eficacia de la quinina fue probada en Per por los misioneros jesuitas, quienes la introdujeron en Europa alrededor de 1640. Desde hace mas de dos siglos se utiliza disuelta en agua carbonatada, originalmente con fines medicinales, pero su consumo persisti como ingrediente amargo de las bebidas de agua tnica. En dichos refrescos la quinina se encuentra presente en concentraciones de entre 25 y 80 ppm. La cantidad de quinina presente en este tipo de muestras puede cuantificarse empleando un mtodo de fluorescencia debido a que presenta un elevado rendimiento cuntico de emisin. Por esta misma razn la quinina se emplea como patrn en espectroscopia de fluorescencia. Presenta dos mximos de excitacin, una en torno a los 250nm y otra alrededor de 350 nm. El mximo de emisin es por los 450nm, independientemente de la longitud de onda a la que se excite. Los espectrofluormetros (o espectrofluormetros) se componen de una fuente de alta intensidad, normalmente de lmpara de xenn; dos monocromadores, uno para seleccionar la longitud de onda de excitacin y otra para seleccionar la de emisin; y un compartimento para la celda. La radiacin fluorescente se emite en todas direcciones, pero se detecta sobre un eje a 90C al haz incidente para evitar la deteccin de luz dispersada proveniente de la fuente . La cubeta utilizada suele ser de slice o cuarzo dado que el vidrio absorbe la luz UV requerida para excitar. Adems, a diferencia de las cubetas de empleadas en espectrofotometra de absorcin, stas cuentan con cuatro caras pticamente transparentes. El procedimiento para realizar una determinacin cuantitativa requiere, primeramente, determinar los mximos de excitacin y emisin.
TP 6
Utilizando matraces y pipetas de doble aforo preparar como mnimo 6 soluciones de calibracin que contengan entre 0 y 1000 PPB de sulfato de quinina a partir de la solucin madre disponible. Antes de llevar a volumen con A.D. a cada una agregarle un 10% v/v de H2SO4 1M.