ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO “ESPE” DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIOLOGÍA I

NOMBRE: Héctor Pulla NIVEL: Cuarto PARALELO: “A” 1. Tema: Recuento bacteriano 2. Objetivos:  Entender el concepto de Unidad Formadora de Colonia (UFC).  Calcular el número de UFC/ml de una muestra problema a partir del recuento de colonias. 3. INTRODUCCIÓN: Recuento en placa o colonia se define como la determinación numérica de la capacidad de una célula viable de formar colonias en un medio sólido conveniente. (Madigan, 2006) Existen muchas formas de determinar la cantidad numérica de células microbianas, entre ellas tenemos: recuento directo, recuento por siembra en extensión, recuento por siembra de vertido y por medio de un filtro de membrana. (Prescott, 2004) El recuento directo (Cámara de recuento de Petroff-Hauser) consiste en el uso de un portaobjetos concreto con una graduación en superficie, con una previa fijación de la muestra, se usa el microscopio de contraste de fases u fluorescencia, en donde, el número de microorganismos se puede calcular a partir de una muestra con la disolución efectuada a la muestra y con el volumen de la cámara. (Prescott, 2004). Este método presenta varias dificultades, por ejemplo, sirve observar en el microscopio solo para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml), además en bacterias con movimiento hay que realizar una solución de alcohol y agua para causar su inmovilización. (Universidad de Granada, 2005) El método de recuento por extensión se basa en un específico volumen (0.1ml) de un cultivo se extiende sobre la superficie de un agar sólidos por medio del uso de una asa estéril, luego se incuba y finalmente se numera a las colonias formadas. El volumen no debe sobrepasa r de 0.1ml porque el agar absorbe líquido sin exceso, ya que su abundancia puede facilitar la extensión y mezcla de las colonias, dificultando así el conteo por este método. Como se puede notar el recuento consiste en contar las células que pueden crecer y multiplicar, en donde, el numero de bacterias viables en la muestra se calcula mediante la formación de de colonias y la disolución de la muestra. En el método del vertido en placa se pipetea un volumen entre 0.1-01.0ml conocidos en una palca estéril vacía y luego se le

Se Homogenizó totalmente la primera dilución y se prosiguió de la misma forma hasta la dilución a la 10-4. 5. para prevenir la incertidumbre el valor de UFC debe estar comprendido entre 30-300. Materiales:  4 tubos con 9ml de solución salina estéril. Se transfirió con una pipeta estéril 0. (Madigan. 4. Se extendió al inoculo de forma homogénea por toda la . HIPÓTESIS:  El numero de bacterias se obtiene en base al la cantidad de solución que se tome de una muestra de jugo.1ml de cada dilución de la muestra a las cajas Petri con agar nutritivo..introduce agar fundido y se mezcla con delicadamente toda la solución formada. (disolución de concentración 10-1). Es importante recalcar que por este método se puede introducir volúmenes de inoculo mayores que del método de recuento por extensión. (Prescott. et al.  Pipetas estériles. 2006) Se puede asegurar que cada colonia provenga de una sola célula individual por lo que se expresa los resultados en unidades formadoras de colonias (UFC). MATERIALES Y MÉTODOS: (Extraída del Manual de laboratorio de microbiología de Vieira y Koch). 2004) En los métodos realizados en el laboratorio de la Espe de recuento por extensión y profundidad presentan la mayoría de sus cultivos suficientes colonias formadas entre 30300ml. Se tomo 1ml de la muestra problema y se transfirió al primero de los tubos con 9ml de solución salina estéril. 2.  Jugo de fruta. (muestra problema)  Asas de vidrio  Caldo nutritivo estériles. Procedimiento inicial: 1. por lo que el UFC calculado es semejante o igual las disoluciones de cada método de recuento realizado. además el microorganismos debe ser capaz de resistir la temperatura fundido de 45ºC.  Varillas de vidrio acodadas  Alcohol  Cajas Petri con agar nutritivo preparado  Cajas Petri MKL preparado. Ejercicio1 (Método de recuento por extensión): 1. esperando que se solidifique.

previamente esterilizada. 4.1ml de cada disolución de la muestra a las cajas Petri estériles y vacías. Se vertió aproximadamente 20ml del agar. Se transfirió con una pipeta estéril 0. Las colonias aparecieron sobre la superficie del agar. 7. 5. Cada colonia se los representó como los representantes de una UFC. 3. se tapó la caja Petri y se rotó gentilmente para mezclar el agar con el inoculo. Se calculó con estos datos el número inicial de UFC/ml de muestras: UFC/ml=número de colonias*factor de dilución/ml sembrados en la placa. 6. se contó independientemente de cada tamaño y se calculo con esos el número inicial de UFC/ml de las muestras. Se marcó 3 cajas Petri estériles con los datos de la bacteria y la disolución correspondiente. Se incubó las placas en posición vertida a 37°C durante 24 horas. 3. Se verificó las cajas Petri entre 30-300 colonias. RESULTADOS: A continuación se muestran los resultados realizados en los métodos de recuento por extensión y en los métodos de recuento por profundidad: Cuadro 1: Resultados de unidades formadoras de colonias en cada método de recuento. se mantuvo esterilizado y se lo mantuvo a 40-50°C para su uso. se lo incubó por 24horas a 37°C. Después de un periodo de incubación se examinó las placas. 4. para lo cual utilizamos la vailla de vidrio acodada. las colonias aparecen sobre y a debajo de la superficie del agar. 2. Luego se examinó las Placas. Se calculó UFC por medio de la siguiente fórmula: . Después de que el medio se ha enfriando totalmente. en donde. 2. 6.superficie de la placa. Se preparó el agar nutritivo. Ejercicio2 (Método de recuento por profundidad): 1.

Método de recuento por extensión en chromocut. 5000 4000 UFC/ml 3000 2000 1000 0 Series2 Series3 Series1 Extensión-Concentración de agar Imagen2. Método de recuento por profundidad en Agar nutritivo.UFC/ml= grupo 1 2 3 4 5 AN 8x105 3x104 13x103 7x103 5x103 CC 7x103 1x104 9x102 1x104 7x103 MKL NA NA NA NA NA muestra Jugo de piña Agua de charco Jugo de piña Jugo de piña Jugo de piña Las gráficas de cada recuento son: 40000 35000 30000 25000 UFC/ml 20000 15000 10000 5000 0 -5000 0 1 2 3 Concentración de agar 4 Series2 Series3 Series1 Imagen1. .

siendo mayoritario en el agar nutritivo por el método de recuento en profundidad. las cajas Petri no estuvieron completamente estériles a igual que la vailla de vidrio acodada y/o pipetas. DISCUSIÓN: En bastantes investigaciones de microbiología se requiere conocer la cantidad precisa de microorganismos que existe en una muestra. se puede notar claramente que la disolución más concentrada presenta mayor UFC. 2008). cuyo objetivo es conocer el número de microorganismos viables de la muestra. et al. en donde. se realiza el recuento por siembra en placas y con medio adecuado. pero su factor inverso de disolución es cada vez menor.6000 5000 4000 UFC/ml 3000 2000 1000 0 Caja sin agar Series1 Series3 Series2 Imagen2. (Vieira y Koch.. puede ser causado por: medición de volumen no presisa en cada disolución. por lo tanto no se puede asegurar los resultados obtenidos. Normalmente las muestras de interés poseen gran cantidad de microorganismos por lo que es necesario diluirlas para dar lugar a la aplicación de métodos de recuento. siendo mayoritario en la disoluciones (10-2 y 10-3) la cantidad de UFC en el método de recuento por extensión. Y lo más probable (por las causas anteriores) es que no todos los cultivos poseían un número de colonias entre 30-300. comprobándose no así en los resultados. 6. por lo tanto hay gran nivel de incertidumbre en el cálculo de UFC. además puede ser causado también por sobrepasar el volumen de 0. Dicha desigualdad numérica de UFC. 2005). Método de recuento por profundidad en Agar nutritivo. ese método llamado también por extensión se basa en la determinación de células viables por medio del conteo del numero de colonias (UFC). más adelante se aclara el motivo del mismo. Se supone que cada disolución presenta debe presentar el mismo valor de UFC ya que se en cada disolución la concentración microbiana es menor.1 ml de la muestra. por las causas indicadas . Es importante aclarar que la viabilidad microbiana es la capacidad de un microorganismos de formar su descendencia por medio su capacidad de división (generalmente por fusión binaria o gemación) (Gamazo. pero en sus posteriores diluciones la cantidad de UFC baja notablemente. en donde.

en la que las se vieron más favorecidas en el agar nutritivo que en el agar Mc Conkey. ya que su abundancia puede favorecer a la sobre extensión y a la mezcla de las colonias. Ciclo celular y crecimiento. ya que sin un uso debido de los instrumentos ni un trabajo adecuado. y todos los requerimientos de la práctica. J.1ml en el medio de cultivo estéril (método por extensión).España (en línea: http://www. en donde. López-Goñi. Se pudo aprender a aislar y calcular el número de células viables. Masson. dificultando así el conteo por este método. Prentice Hall.mx/pdfs/AGAR%20NUTRITIVO. como en este caso. .. CONCLUSIONES: No se puedo asegurar los valores obtenidos de UFC. C. 2006). ya un volumen mayor a 0. (MCD laboratorios. Martinku.ugr. J. LAB. S/A. ya que el nivel de incertidumbre es alto. Granada. 8. que el agar Mc Conkey Lactosa. Pearson. Por lo tanto en la muestra del juego. México. R.1ml porque el agar absorbe líquido sin exceso. I. Díaz. es necesario e importante calcular bien los volúmenes de cada disolución.  Madigan. no hay como asegurar resultados... 3a edición. impreciso medición de volumen en cada disolución. cuyo uso es favorecido para el cultivo y aislamiento de microorganismos Gram negativos como fermentadores y no fermentadores de glucosa. Barcelona (España). Como se dijo introductoriamente. Biología de los Microorganismos. 10mª edición.pdf . utilizar materiales completamente estériles. Travessera de Grácia.anteriormente. Manual práctico de Microbiología. los métodos de recuento por extensión.mcd. en cambio el método por profundidad requiere un de inoculo comprendido entre 0. uno de las causas puede ser debido a que el agar Mc Conkey Lactosa es diferencial y selectivo. Madrid. 2006.htm. Medios de cultivos preparados en placa. Otra de las causas puede ser que el agar nutritivo es un agar para una gran cantidad de microorganismos. 2004). BIBLIOGRAFÍA:  Universidad de Granada. et al. consultado el 14 de junio de 2010)  MCD. M. Para realizar los respectivos 7. Es importante recalcar que el agar nutritivo presenta mayor cantidad de UFC. e inhibe a las Gram positivas. España. (Prescott. puedo haberse encontrado bacterias Gram positivas y Gram negativos. 2010). 2005. consultado el 13 de junio del 2010)  Gamazo. es decir no es diferencial no selectivo..es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento. 2005. Brock.1-1 ml y adicionalmente los microorganismos deben ser capaz de resistir la temperatura fundida de 45°C del agar. (Madigan.com. Parker. solo se debe introducir un volumen de 0. (En línea: http://www.. una de las causas más probables es que los medios de cultivo no presentaron un número de colonias entre el rango de 30-300 y esto puede ser causado a su vez por el impreciso pipeteo.

. 35. A. Prescott. Madrid España.  Koch. Vieira. Manual de laboratorio de Microbiología I. J. 5ª edición. y Klein. D.. 36. Microbiología. L. Pág. A. Sangolqui-Ecuador. Harley. N. 2004. McGraw-Hill Interamericana.. M.. 34. P. 2008.

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