ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO “ESPE” DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIOLOGÍA I

NOMBRE: Héctor Pulla NIVEL: Cuarto PARALELO: “A” 1. Tema: Recuento bacteriano 2. Objetivos:  Entender el concepto de Unidad Formadora de Colonia (UFC).  Calcular el número de UFC/ml de una muestra problema a partir del recuento de colonias. 3. INTRODUCCIÓN: Recuento en placa o colonia se define como la determinación numérica de la capacidad de una célula viable de formar colonias en un medio sólido conveniente. (Madigan, 2006) Existen muchas formas de determinar la cantidad numérica de células microbianas, entre ellas tenemos: recuento directo, recuento por siembra en extensión, recuento por siembra de vertido y por medio de un filtro de membrana. (Prescott, 2004) El recuento directo (Cámara de recuento de Petroff-Hauser) consiste en el uso de un portaobjetos concreto con una graduación en superficie, con una previa fijación de la muestra, se usa el microscopio de contraste de fases u fluorescencia, en donde, el número de microorganismos se puede calcular a partir de una muestra con la disolución efectuada a la muestra y con el volumen de la cámara. (Prescott, 2004). Este método presenta varias dificultades, por ejemplo, sirve observar en el microscopio solo para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml), además en bacterias con movimiento hay que realizar una solución de alcohol y agua para causar su inmovilización. (Universidad de Granada, 2005) El método de recuento por extensión se basa en un específico volumen (0.1ml) de un cultivo se extiende sobre la superficie de un agar sólidos por medio del uso de una asa estéril, luego se incuba y finalmente se numera a las colonias formadas. El volumen no debe sobrepasa r de 0.1ml porque el agar absorbe líquido sin exceso, ya que su abundancia puede facilitar la extensión y mezcla de las colonias, dificultando así el conteo por este método. Como se puede notar el recuento consiste en contar las células que pueden crecer y multiplicar, en donde, el numero de bacterias viables en la muestra se calcula mediante la formación de de colonias y la disolución de la muestra. En el método del vertido en placa se pipetea un volumen entre 0.1-01.0ml conocidos en una palca estéril vacía y luego se le

et al.  Varillas de vidrio acodadas  Alcohol  Cajas Petri con agar nutritivo preparado  Cajas Petri MKL preparado. Se transfirió con una pipeta estéril 0.introduce agar fundido y se mezcla con delicadamente toda la solución formada.1ml de cada dilución de la muestra a las cajas Petri con agar nutritivo. Ejercicio1 (Método de recuento por extensión): 1. 5. Procedimiento inicial: 1. (Prescott. 2004) En los métodos realizados en el laboratorio de la Espe de recuento por extensión y profundidad presentan la mayoría de sus cultivos suficientes colonias formadas entre 30300ml. 2006) Se puede asegurar que cada colonia provenga de una sola célula individual por lo que se expresa los resultados en unidades formadoras de colonias (UFC). HIPÓTESIS:  El numero de bacterias se obtiene en base al la cantidad de solución que se tome de una muestra de jugo. Se extendió al inoculo de forma homogénea por toda la . (Madigan. MATERIALES Y MÉTODOS: (Extraída del Manual de laboratorio de microbiología de Vieira y Koch). Es importante recalcar que por este método se puede introducir volúmenes de inoculo mayores que del método de recuento por extensión. (disolución de concentración 10-1). 4. para prevenir la incertidumbre el valor de UFC debe estar comprendido entre 30-300. además el microorganismos debe ser capaz de resistir la temperatura fundido de 45ºC. Materiales:  4 tubos con 9ml de solución salina estéril. esperando que se solidifique.  Jugo de fruta. (muestra problema)  Asas de vidrio  Caldo nutritivo estériles. Se Homogenizó totalmente la primera dilución y se prosiguió de la misma forma hasta la dilución a la 10-4. por lo que el UFC calculado es semejante o igual las disoluciones de cada método de recuento realizado.  Pipetas estériles. 2.. Se tomo 1ml de la muestra problema y se transfirió al primero de los tubos con 9ml de solución salina estéril.

6. 2. se mantuvo esterilizado y se lo mantuvo a 40-50°C para su uso. se tapó la caja Petri y se rotó gentilmente para mezclar el agar con el inoculo. Se incubó las placas en posición vertida a 37°C durante 24 horas. Luego se examinó las Placas. Después de un periodo de incubación se examinó las placas. las colonias aparecen sobre y a debajo de la superficie del agar. Se calculó UFC por medio de la siguiente fórmula: . 7. 5. Se calculó con estos datos el número inicial de UFC/ml de muestras: UFC/ml=número de colonias*factor de dilución/ml sembrados en la placa.1ml de cada disolución de la muestra a las cajas Petri estériles y vacías. Después de que el medio se ha enfriando totalmente. 3. se lo incubó por 24horas a 37°C. Cada colonia se los representó como los representantes de una UFC. 2. Se marcó 3 cajas Petri estériles con los datos de la bacteria y la disolución correspondiente. previamente esterilizada. RESULTADOS: A continuación se muestran los resultados realizados en los métodos de recuento por extensión y en los métodos de recuento por profundidad: Cuadro 1: Resultados de unidades formadoras de colonias en cada método de recuento. 6. 4. se contó independientemente de cada tamaño y se calculo con esos el número inicial de UFC/ml de las muestras. Se verificó las cajas Petri entre 30-300 colonias. en donde. Ejercicio2 (Método de recuento por profundidad): 1. 4. Se transfirió con una pipeta estéril 0. 3. Se preparó el agar nutritivo. Se vertió aproximadamente 20ml del agar.superficie de la placa. para lo cual utilizamos la vailla de vidrio acodada. Las colonias aparecieron sobre la superficie del agar.

. 5000 4000 UFC/ml 3000 2000 1000 0 Series2 Series3 Series1 Extensión-Concentración de agar Imagen2.UFC/ml= grupo 1 2 3 4 5 AN 8x105 3x104 13x103 7x103 5x103 CC 7x103 1x104 9x102 1x104 7x103 MKL NA NA NA NA NA muestra Jugo de piña Agua de charco Jugo de piña Jugo de piña Jugo de piña Las gráficas de cada recuento son: 40000 35000 30000 25000 UFC/ml 20000 15000 10000 5000 0 -5000 0 1 2 3 Concentración de agar 4 Series2 Series3 Series1 Imagen1. Método de recuento por profundidad en Agar nutritivo. Método de recuento por extensión en chromocut.

6000 5000 4000 UFC/ml 3000 2000 1000 0 Caja sin agar Series1 Series3 Series2 Imagen2. 6. siendo mayoritario en la disoluciones (10-2 y 10-3) la cantidad de UFC en el método de recuento por extensión. en donde. 2008). et al. Se supone que cada disolución presenta debe presentar el mismo valor de UFC ya que se en cada disolución la concentración microbiana es menor. DISCUSIÓN: En bastantes investigaciones de microbiología se requiere conocer la cantidad precisa de microorganismos que existe en una muestra.1 ml de la muestra. más adelante se aclara el motivo del mismo. pero en sus posteriores diluciones la cantidad de UFC baja notablemente. se realiza el recuento por siembra en placas y con medio adecuado. por lo tanto hay gran nivel de incertidumbre en el cálculo de UFC. Normalmente las muestras de interés poseen gran cantidad de microorganismos por lo que es necesario diluirlas para dar lugar a la aplicación de métodos de recuento. comprobándose no así en los resultados. 2005). además puede ser causado también por sobrepasar el volumen de 0. (Vieira y Koch. se puede notar claramente que la disolución más concentrada presenta mayor UFC. Dicha desigualdad numérica de UFC.. puede ser causado por: medición de volumen no presisa en cada disolución. pero su factor inverso de disolución es cada vez menor. Es importante aclarar que la viabilidad microbiana es la capacidad de un microorganismos de formar su descendencia por medio su capacidad de división (generalmente por fusión binaria o gemación) (Gamazo. por las causas indicadas . siendo mayoritario en el agar nutritivo por el método de recuento en profundidad. en donde. las cajas Petri no estuvieron completamente estériles a igual que la vailla de vidrio acodada y/o pipetas. por lo tanto no se puede asegurar los resultados obtenidos. Y lo más probable (por las causas anteriores) es que no todos los cultivos poseían un número de colonias entre 30-300. Método de recuento por profundidad en Agar nutritivo. cuyo objetivo es conocer el número de microorganismos viables de la muestra. ese método llamado también por extensión se basa en la determinación de células viables por medio del conteo del numero de colonias (UFC).

(Madigan. utilizar materiales completamente estériles. Madrid. uno de las causas puede ser debido a que el agar Mc Conkey Lactosa es diferencial y selectivo. Manual práctico de Microbiología.1ml porque el agar absorbe líquido sin exceso.. Díaz. Medios de cultivos preparados en placa. una de las causas más probables es que los medios de cultivo no presentaron un número de colonias entre el rango de 30-300 y esto puede ser causado a su vez por el impreciso pipeteo. 2006). impreciso medición de volumen en cada disolución. Para realizar los respectivos 7. 2004). I. dificultando así el conteo por este método. López-Goñi. 2006.mx/pdfs/AGAR%20NUTRITIVO. 2010). en donde. C. (Prescott. J.. CONCLUSIONES: No se puedo asegurar los valores obtenidos de UFC. como en este caso.anteriormente. Brock.España (en línea: http://www. México.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.pdf . ya que el nivel de incertidumbre es alto. S/A. Prentice Hall.mcd. (MCD laboratorios. en cambio el método por profundidad requiere un de inoculo comprendido entre 0.. Martinku.  Madigan. et al. España.1-1 ml y adicionalmente los microorganismos deben ser capaz de resistir la temperatura fundida de 45°C del agar.com..ugr. (En línea: http://www. R. M. ya que su abundancia puede favorecer a la sobre extensión y a la mezcla de las colonias. no hay como asegurar resultados. Parker. Travessera de Grácia. Barcelona (España). J. BIBLIOGRAFÍA:  Universidad de Granada. Otra de las causas puede ser que el agar nutritivo es un agar para una gran cantidad de microorganismos. y todos los requerimientos de la práctica. LAB. ya un volumen mayor a 0. 10mª edición. Se pudo aprender a aislar y calcular el número de células viables. en la que las se vieron más favorecidas en el agar nutritivo que en el agar Mc Conkey. que el agar Mc Conkey Lactosa. Masson.htm. consultado el 14 de junio de 2010)  MCD.1ml en el medio de cultivo estéril (método por extensión). Pearson.. cuyo uso es favorecido para el cultivo y aislamiento de microorganismos Gram negativos como fermentadores y no fermentadores de glucosa. 8. Como se dijo introductoriamente. Ciclo celular y crecimiento. . es necesario e importante calcular bien los volúmenes de cada disolución. 3a edición. 2005. los métodos de recuento por extensión. consultado el 13 de junio del 2010)  Gamazo. e inhibe a las Gram positivas. 2005. Es importante recalcar que el agar nutritivo presenta mayor cantidad de UFC. Biología de los Microorganismos. puedo haberse encontrado bacterias Gram positivas y Gram negativos. solo se debe introducir un volumen de 0. ya que sin un uso debido de los instrumentos ni un trabajo adecuado. Por lo tanto en la muestra del juego. Granada. es decir no es diferencial no selectivo.

A. 36. A. L. y Klein. 2008. D. P. Manual de laboratorio de Microbiología I. 5ª edición. 35.. McGraw-Hill Interamericana.  Koch. M. . Sangolqui-Ecuador... Vieira. 2004. Prescott. Madrid España. Microbiología. Pág. N. Harley. J. 34.

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