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INTRODUCCIN

Hay una amplia bsqueda mundial de los mtodos alternativos de produccin de energa a partir de fuentes renovables. Brasil es pionero en el motor de la produccin de etanol combustible a gran escala a travs de la fermentacin de la melaza de caa de azcar por la levadura (Snchez et al, 1996;. Habones et al, 1999.). Sin embargo, 30% de las industrias han sustituido por lotes por procesos de fermentacin continuos (habones et al., 1999) ya que aqu presenta varias ventajas. Para mejorar el rendimiento y la productividad de etanol y para evitar la utilizacin de centrifugadoras que son caros, procesos continuos con clulas inmovilizadas en diferentes soportes como vidrio, polmeros sintticos como poliacrilamida (Lida, 1993) y geles de polipropileno (Inloes et al., 1983), alginato de calcio (Bravo y Gonzlez, 1991; Gilson y Thomas, 1995; Roukas, 1994;. Sanches et al, 1996), kissiris (Argiriou et al, 1996.) se han sugerido, aunque algunos portadores presentan dificultades a escala industrial. Por ejemplo, perlas de alginato que pueden ser destruidos debido a la friccin y la evolucin de CO2 en el interior de las perlas (Gilson y Thomas, 1995). Prakashan et al. (1999) investigaron la funcin catalizadora de varios slidos inertes apoya en la aceleracin de la fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae. Los soportes ensayados se deslignificadas aserrn, salvado de trigo deslignificada, arena de ro, quitina, quitosano y xido de titanio. Los resultados de la fermentacin alcohlica mostraron que todas las compaas estimularon la produccin de etanol, que se atribuy a la unin de las clulas a estos materiales. Bekers et al. (2000) que se utiliza esferas porosas de acero inoxidable tratado por oxidacin con TiCl4 o aminopropyltrietoxilase, como soportes para clulas de levadura. Observaron que la unin de las clulas sobre el acero inoxidable poroso tratado fue debido a la atraccin electrosttica entre las clulas que tenan cargas elctricas negativas y el acero inoxidable poroso tratado que tena cargas positivas. Los ensayos de fermentacin por lotes usando un inculo de clulas inmovilizada mostraron un aumento de las clulas de levadura de la estabilidad y la produccin de etanol. Los autores sugieren que el aumento de la sntesis de etanol por la clula inmovilizada en acero poroso tratado podra ser el resultado de la accin cataltica de algn elemento superficie del soporte sobre el metabolismo. El crisotilo es un mineral de silicato de magnesio presente en la naturaleza en una forma fibrosa. Se tiene una capacidad excepcional para inmovilizar clulas de levadura por adsorcin, con algunas ventajas en comparacin con los portadores citados en la literatura, ya que tiene una excelente estabilidad que permite su uso durante largos perodos y para su reutilizacin, muestra resistencia al tratamiento trmico, soporta condiciones operacionales de la fermentacin alcohlica, y es barato (Moran et al, 1997.), pero la principal ventaja de este mineral es su estimulacin de la produccin de etanol por la levadura, el aumento de la productividad especfica de los procesos (Wendhausen et al, 2001;. Filloy et al, 2001;. Joekes et al, 1998)..

El objetivo de este trabajo fue investigar la produccin de etanol por clulas de Saccharomyces cerevisiae apoyados sobre el crisotilo, en condiciones no aspticas en fermentaciones continuas y por lotes, usando diluidas melaza de caa de azcar como fuente de carbono.

MATERIALES Y MTODOS

Microorganismos y su mantenimiento

La cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada en este trabajo se aisl a partir de una fermentacin etanlica de melaza de caa de azcar de Pap Delia industria del azcar-etanol - SP, Brasil, suministrado por el Laboratorio de Bioingeniera del Departamento de Ingeniera de Alimentos de la Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP. S. cerevisiae se mantuvo a 4 C en tubos inclinados de agar. La composicin del agar fue (g l-1): extracto de levadura 3, extracto de malta 3, 5 peptona, glucosa 10 y agar 20. Los cultivos se mantuvieron por sub-cultivo cada 20 das-y los tubos de ensayo se incubaron entonces a 30 C durante 36 h. La levadura de panadero, que se utiliza en gran medida en el proceso industrial, tambin se utiliz en este trabajo. La levadura de panadero comercial fue comprado a Fleshmann y Royal Ltda. (Brasil). Portador El crisotilo 5 R desde SAMA SA Minerao de Amianto (Brasil) fue utilizado como el portador, que se lav con agua del grifo para eliminar las partculas de arena y polvo de roca antes de su uso.

Medio de fermentacin La fuente de carbono utilizada se diluy la melaza de caa de azcar con una concentracin de azcar de aproximadamente 180 g l-1 sin ninguna suplementacin. En la fermentacin por lotes, el medio no fue esterilizada y el pH se ajust a 4,5. En la fermentacin continua, el pH del medio se ajust a 5,5 y el medio se esteriliz a 120 C durante 25 minutos. Preparacin del inculo El inculo se prepar aspticamente en un proceso de crecimiento de dos etapas. En la primera etapa, el microorganismo se cultiv en 250 ml de matraces Erlenmeyer que contienen 100 ml del

siguiente medio (g l-1): glucosa 50, extracto de levadura 5, KH2PO4 5, NH4Cl 1,5, MgSO4 0,7 y KCl 1,7. Los matraces Erlenmeyer se incubaron a 30 oC durante 12 horas en un agitador rotatorio a 180 rpm. Despus, el medio se transfiri a un matraz Erlenmeyer de 4000 ml que contena 1000 ml del mismo medio, excepto la glucosa se reemplaz por 150 g l-1 de sacarosa, y se incubaron en las condiciones descritas anteriormente. La suspensin de clulas obtenida se filtr a vaco utilizando papel Whatman nmero 1.

La adsorcin de las clulas de levadura en los ensayos de crisotilo y fermentacin En fermentaciones discontinuas, se aadi cuidadosamente la masa de clulas en cada matraz con medio de melaza y el crisotilo, para dar la concentracin de levadura de base hmeda deseada. Estas fermentaciones se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio en un agitador rotatorio a 200 rpm y 30 oC. Se prepararon matraces Erlenmeyer que contiene crisotilo libre en el medio o crisotilo en una bolsita de organza textil de 4 cm x 4 cm, siempre al 1% (w / v) del volumen de cultivo. Control de matraces Erlenmeyer se prepararon sin crisotilo. La fermentacin continua se lleva a cabo en un fermentador de 600 ml de banco que se construy utilizar un vaso de 620 ml con una relacin de 1,1 altura / dimetro, que se cerr con una tapa de goma, y tena un tubo insertado para reciclar el agua a 30 oC a partir de una termosttica baera y otro tubo que lleg al fondo del fermentador para la alimentacin. Mezcla del medio fue promovida por una barra magntica. Salir del medio a travs de un pequeo tubo en el cuerpo fermentador, y las muestras se recogieron en un tubo de ensayo sumergido en un bao de hielo. La masa de crisotilo utilizado en estos fermentacin era o bien 1 o 2% (w / v) del volumen de cultivo y se envolvi en tres bolsitas de organza textil de 7 cm x 8 cm distribuidas regularmente en el medio a granel a evitar la prdida de ese fibras de lecho del reactor a travs de la tubera de salida. Al inicio de la fermentacin, se aadieron aproximadamente 20 g de peso hmedo de clulas de levadura para el medio nutriente contenida en el reactor y se mantuvo durante dos horas bajo agitacin a salir de las celdas en contacto con las fibras de crisotilo para promover la adsorcin de las clulas sobre el crisotilo fibras. Entonces, la pulsacin de la bomba se enciende para alimentar el reactor a la tasa de dilucin deseada. Se asumi un estado de equilibrio cuando no se produjeron variaciones en la masa celular seca y las concentraciones de etanol en tres muestras consecutivas. La velocidad de dilucin se aument durante el curso de la fermentacin hasta que se alcanz una tasa de aproximadamente 0,30 h-1. Se aadi solucin de antibitico Karmoran (1 g l-1) en un intervalo de 0,1 a 0,3 ml, en el reactor a travs de la tubera de suministro de medio de tres veces al da.

Anlisis La cintica de la fermentacin por lotes fue seguido por la determinacin de la evolucin de CO2

en masa sobre la base del peso de los matraces Erlenmeyer como una funcin del tiempo. Las muestras de fermentacin continua se centrifugaron y los sobrenadantes clarificados se dividieron en dos alcuotas. Uno de ellos se trat con un volumen igual de HCl (2 N) en bao de agua hirviendo durante 15 minutos, seguido por la adicin de un volumen igual de NaOH (2N). Los azcares reductores se analizaron por el mtodo de Somogy-Nelson (Somogyi, 1952). La otra alcuota se separ por destilacin y el etanol recuperado se analiz mediante el mtodo descrito por Salik y Povh, (1993).

RESULTADOS Y DISCUSIN

Produccin de CO2 por las fermentaciones de etanol por lotes se muestran en la Figs. 1 y 2. . Figura 1 mostr CO2 producido en los frascos que contienen crisotilo envuelto y libre en relacin a los matraces de control, sin envuelta y el crisotilo libre, que estn representados por la ordenada cero. Al comienzo de la fermentacin, no haba produccin de ms CO2 en los frascos con crisotilo envuelta que en los que contienen crisotilo libre, pero esta diferencia disminuy durante el curso de la fermentacin y despus de 120, minutos no hubo diferencia significativa. Puesto que los frascos con crisotilo envuelto en bolsitas de organza producen ms CO2 que los frascos con crisotilo libre, los experimentos se llevaron a cabo con las bolsitas de organza sin crisotilo en el medio de fermentacin para determinar la influencia de los sobres en el aumento del CO2. No hubo diferencias en la produccin de CO2 en los matraces de control y los frascos con organza bolsita sin crisotilo, lo que permiti a la conclusin de que la aceleracin de la actividad biolgica en el inicio de la fermentacin era debido a la presencia de crisotilo en el medio. Adems evolucin superior del CO2 en los frascos con crisotilo envuelto mostr que la forma en que el crisotilo estaba presente en el medio de fermentacin influy en la actividad de la levadura.

Los cambios en la productividad obtenidos para sistemas con clulas inmovilizadas sobre el crisotilo podran explicarse por la fuerte interaccin entre el crisotilo y las clulas, que afectaron a la estructura de la membrana de las clulas (Joekes et al., 1998). Para confirmar si el efecto cataltico del crisotilo en la aceleracin de la fermentacin alcohlica, no se produjo slo la primera vez que se utiliz, el crisotilo utilizado en los experimentos de la figura. 1 fue utilizado de nuevo despus de ser lavado con agua destilada tiempos suficientes de agua para eliminar todas las clulas y las impurezas medio. Los resultados se muestran en la figura. 2, que mostr el mismo comportamiento observado en la figura. 1, a pesar de las pequeas diferencias en las clulas iniciales y la reduccin de la concentracin de azcar. Tales experimentos mostraron que no haba material de factor o presentes slo en crisotilo en bruto cuando se usa para la primera vez que podra aumentar la velocidad de fermentacin, pero por el contrario no haba alguna evidencia que muestra que el aumento de la evolucin de CO2 se debi la forma de la celular atrapamiento o debido a algn tipo de interaccin de las clulas y el crisotilo. La rpida reduccin del efecto crisotilo en la activacin de la levadura en los primeros 60 minutos de fermentacin sugiri que la levadura immobilizeds fue ms susceptible a la inhibicin por etanol formado en la fermentacin que en el control o en la fermentacin convencional. Se observ una pequea diferencia de velocidad de evolucin del CO2 en los frascos con envuelta o crisotilo

gratuita en las figuras. 1 y 2, pero no haba una diferencia de la concentracin celular inicial y azcares reductores totales entre ambas Figuras que podran justificar la produccin de CO2 ms rpida (Fig. 2). Mientras tanto, otros experimentos con clulas de levadura iniciales a concentraciones en el intervalo de 0,1 a 1% (peso en hmedo) se llevaron a cabo, pero no se observ ninguna diferencia de la tasa de evolucin de CO2 en los frascos con crisotilo y los matraces de control (datos no mostrados). Significativas de las tasas de evolucin de CO2 se observaron slo cuando la concentracin celular inicial fue de hasta 5% (peso hmedo). En la fermentacin por lotes utilizando levadura de Baker, con la concentracin inicial total de la reduccin de azcar de 180 g l-1 y la concentracin celular inicial de 8% en base al peso hmedo, no se observaron diferencias significativas en la evolucin de CO2 en los frascos que contenan 1% de envuelta y crisotilo libre en relacin con los frascos de control, sin envuelta y el crisotilo libre. . Figura La figura 3 muestra los resultados de fermentaciones continuas, que se llevaron a cabo para observar si el efecto de crisotilo envuelto en bolsitas en el aumento de la tasa de fermentacin alcohlica durante 12 das, en relacin con el control de la fermentacin continua, sin crisotilo. Todos los experimentos comenzaron con la tasa de dilucin ms baja que se increment gradualmente hasta alcanzar la tasa ms alta, y la productividad de etanol aument cuando se increment la tasa de dilucin. Este comportamiento se confirm la observacin de la fermentacin lleva a cabo en matraces Erlenmeyer de que el efecto cataltico sobre fermentaciones alcohlicas fue pronunciado cuando la concentracin de etanol en el medio fue baja, que se produjo a las altas tasas de dilucin. En los experimentos llevados a cabo con 1% de reutilizado crisotilo envuelta, la productividad de etanol era ms baja que en los experimentos llevados a cabo con 1% de crisotilo recin envuelto. Este comportamiento fue inesperado ya que en la fermentacin por lotes se observ ninguna disminucin en la tasa de evolucin de CO2, a pesar del hecho de que todas las fermentaciones continuas se llevaron a cabo varios das con tasas de dilucin menor que 0,20 h-1. Por lo tanto, el efecto cataltico reducida del crisotilo reutilizado en la fermentacin alcohlica no poda atribuirse a las impurezas en la melaza que podran dejar reducido o inhibido la adsorcin de clulas de levadura a las fibras de crisotilo. Por otro lado, los valores de productividad de los experimentos con 2% de crisotilo eran ms bajos que los valores de productividad de los experimentos con 1% de nueva crisotilo, que no se esperaba. Estos resultados sugieren que el efecto cataltico del crisotilo debera ser examinada de nuevo.

CONCLUSIONES La cepa de S. cerevisiae empleada en este trabajo era un buen productor de alcohol aislado de la fermentacin alcohlica industrial. Se utiliz otra cepa de S. cerevisiae empleada en la industria de pan, pero el efecto crisotilo no era tan pronunciado con esta cepa. Este hecho sugiere que la interaccin entre cada cepa y el crisotilo era diferente y se debe tener cuidado en la seleccin de la cepa antes de su uso de crisotilo en fermentaciones alcohlicas. A pesar del efecto positivo en la velocidad de reaccin en presencia de crisotilo, se le ocurri slo al comienzo de la fermentacin y cuando se utiliz una concentracin alta de levadura. Su uso industrial puede ser ventajoso en el proceso por lotes o fermentacin continua, que es el caso en Brasil, donde 30% de las industrias que producen alcohol carburante usar un proceso continuo en 3 o 4 fermentadores conectados en serie. En ambos procesos, el medio se centrifug y la levadura obtenida se trata con cido sulfrico (pH 2,0), a continuacin, se recicla al proceso por lotes o a la primera fermentador de etapa para dar una primera etapa de fermentacin con 10% de crema de levadura hmeda, que es unas buenas condiciones para el uso de crisotilo.

En este trabajo las condiciones experimentales eran similares a las de una industria de la fermentacin de caa de azcar, incluyendo el nmero de levadura que se mantuvo a 108 clulas / ml y contaminantes (bacterias) que se mantuvo a 106 clulas / ml mediante la adicin de antibiticos. Por lo tanto, la fermentacin con levaduras inmovilizadas sobre el crisotilo podra ser adecuado para la ampliacin.

El efecto de crisotilo en bacterias u otros hongos es desconocido, pero su aplicacin en otros procesos de fermentacin puede ser ventajoso, si se produce un efecto similar al de la fermentacin alcohlica de levadura, especialmente en aquellos procesos en los que, a diferencia de la fermentacin alcohlica, los productos no hacen causar la inhibicin intensa de las actividades microbianas.