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Búsqueda de Salmonella enterica en tortugas semiacuáticas del Centro

de Atención y Valoración de Fauna Silvestre del Área Metropolitana.

Sara Duque, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES

María Adelaida Giraldo, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia- Universidad CES Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT-CES) Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre del Área Metropolitana del Valle de Aburrá (CAV)

Medellín, Noviembre de 2008

Búsqueda de Salmonella enterica en tortugas semiacuáticas del

Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre del Área

Metropolitana.

Sara Duque, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES

María Adelaida Giraldo, Estudiante Veterinaria y Zootecnia CES

Trabajo de investigación para optar al título de Médico veterinario- Zootecnista.

Tutoras: Diber Marcela Ramírez M., MV. CAV

Miryan Margot Sánchez, Bact. MSc. ICMT-CES.

Co- investigadoras: Paula Andrea Rincón, Estudiante Bacteriología.CMA

Gloria Jaramillo, Bact. CAV

Nora María Cardona. MD. MSc. ICMT-CES

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia- Universidad CES Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT-CES) Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre del Área Metropolitana del Valle de Aburrá (CAV)

Medellín, Noviembre de 2008

Ciudad y fecha (día, mes, año):

Nota de aceptación

Jurado

Jurado.

AGRADECIMIENTOS

A la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia- Universidad CES

Al Instituto Colombiano de Medicina Tropical (ICMT-CES)

Al

Centro

de

Atención

y

Valoración

de

Metropolitana del Valle de Aburrá (CAV)

Al Área Metropolitana

Fauna

Silvestre

del

Área

Por la financiación y apoyo en la realización de este proyecto.

INDICE DE CONTENIDO

Pág.

1. Resumen

7

2. Abstract

9

3. Formulación del problema

11

4. Planteamiento del problema

13

4.1.Justificación de la propuesta

13

4.2.

Pregunta(s) de investigación

14

5. Marco teórico

15

6. Objetivos

21

6.1. General

21

6.2. Específicos

21

7. Metodología

22

7.1. Tipo de estudio

22

7.2. Población

22

7.3. Diseño muestral

22

7.4. Descripción de las variables

23

7.5. Técnicas de recolección de la informació n

24

7.6. Técnicas de procesamiento

24

 

7.6.1. Procedimientos

24

7.6.2. Técnica de laboratorio para detección de S. enterica

27

7.6.2.1. Coprocultivo

27

7.6.2.2. Extracción de DNA bacteriano

29

7.6.2.3. Detección de productos de amplificación

31

8. Consideraciones éticas

34

 

Pág.

9. Resultados

36

10. Discusión

42

11. Conclusiones

46

12. Referencias bibliográficas

48

13. Anexos

53

1. RESUMEN

Estudios previos realizados en otros países, indican que las tortugas que conviven

como mascotas con los humanos, pueden ser reservorios de Salmonella, bacteria

que produce cuadros clínicos severos en los humanos y en las

inmunosuprimidas.

tortugas

El objetivo de esta investigación, fue buscar Salmonella enterica en tortugas

semiacuáticas recibidas en el Centro de Atención

y Valoración de

Fauna

Silvestre del Área Metropolitana del Valle de Aburra (CAV) producto de entregas

voluntarias

e

incautaciones

durante

el

periodo

comprendido

entre

abril

y

noviembre de 2007, debido a que existe una alta probabilidad de que estos

animales, se conviertan en fuente de infección para otras especies animales o

inclusive el hombre. La búsqueda de Salmonella spp. se realizó en muestras de

materia fecal utilizando cultivos bacteriológicos y detección de ADN específico con

PCR para detectar género y serotipo.

En este trabajo se detectó por PCR en 38 de las 110 tortugas muestreadas

(34.5%), la presencia de Salmonella enterica y por cultivo se obtuvo aislamiento

de Salmonella en 30 de las 110 muestras (27,2%).

La tipificación de las 38 muestras positivas utilizando PCR múltiple, identificó S.

Enteritidis en 26 (68.4%) muestras, S. Typhimurium en 1 (2.6%), ambos serotipos

en 4 (10.5%) muestras y otros serotipos en 7 (18,4%) muestras.

Estos resultados demuestran la necesidad de diseñar planes estratégicos para

evitar el tráfico y la comercialización de animales silvestres,

que contribuyan a

prevenir así la extinción de una gran variedad de especies y el desarrollo de una

posible zoonosis en los humanos.

Palabras claves: tortugas, semiacuáticas, PCR múltiple, zoonosis, Salmonella.

2. ABSTRACT.

Recent studies in other countries show that turtles used as pets in human

environments can transmit Salmonella. This type of bacteria can cause serious

health problems in humans and to the turtles as well.

The objective of the present research was to find Salmonella enterica among

turtles

that are received in the Centro de Atención

y Valoración del

Area

Metropolitana del Valle del Aburrá (CAV), these animals came after being in

contact with humans, and being natural reservoirs for Salmonella could become

the source of infection. Detection of Salmonella spp was carried out in feces

samples using bacteriological cultures and PCR for specific DNA tests for genus

and serotype.

The results found in this research showed that 38/110 (34.5%) were positives for

PCR for Salmonella enterica.

30 of 110 samples (27,2%).

For culture, was obtained isolates of Salmonella in

The typing of the 38 positives samples using multiplex PCR, identified S. Enteritidis

in 26 (68.4%) samples, S. Typhimurium in 1 (2.6%), both serotypes in 4 (10.5%)

samples and other serotypes in 7 (18,4%) samples.

These results, show the urgency to develop strategic plans to halt the trafficking of

wild animals and its commercialization to avoid their extinction and a possible

zoonosis

Key Words: turtles, PCR multiple, zoonosis, Salmonella.

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

Los réptiles, incluidas las tortugas, hacen parte de la fauna silvestre. En Colombia,

diferentes especies se mantienen en cautiverio en un intento por adaptarlas a

condiciones domésticas, trayendo como consecuencia un aumento en el riesgo de

extinción

y

además

problemas

de

salubridad,

ya

que

estos

animales

son

reservorios importantes de microorganismos zoonóticos como Salmonella, que

puede impactar negativamente sobre la salud humana y de otros animales (1). En

estudios realizados en otros países, se ha reportado que la prevalencia de

Salmonella en tortugas es de un 94% y en los últimos años se han incrementado

los casos de infección por esta bacteria debido a la popularidad de tener reptiles

como mascotas. Cada año 93,000 personas son infectadas con Salmonella como

resultado

del

contacto

con

reptiles,

lo

que

implica

miles

de

personas

hospitalizadas anualmente debido a este tipo de infección (2).

De lo anterior se deduce, que reptiles como las tortugas semiacuáticas son

reservorios

de Salmonella enterica

y

el

número de informes de casos

de

Salmonella asociados a estos reptiles ha aumentado (3, 4).

Por lo mencionado anteriormente, se realizó la búsqueda de Salmonella en

tortugas semiacuáticas (Trachemys scripta, Rinoclemys sp., Kinosternum sp,

Podomnemys unifilis, Podomnemys lewyana) recibidas en el Centro de Atención y

Valoración de

Fauna Silvestre del Valle de Aburra (CAV) durante el periodo

comprendido entre los meses de Abril y Noviembre del año 2007, ya que estos

animales son reservorios naturales, y además se ha reportado que algunos

serotipos de Salmonella específicos de tortugas como S. Java, S. Urbana y S.

Hartford y otros serotipos como S. Arizonae, S. Enteritidis y S. Typhimurium son

potencialmente patógenos para animales y humanos (5).

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

4.1. Justificación de la propuesta.

Los informes sobre la frecuencia de aislamientos de Salmonella sp. en tortugas

que son mantenidas

como mascotas, varían

entre un

30

y

un

70%

en

los

diferentes países en los cuales se ha estudiado esta asociación (6). La presente

investigación pretendió determinar la presencia de Salmonella en las tortugas

semiacuáticas que ingresaron al CAV, producto de incautaciones o entregas

voluntarias

después

de ser

mantenidas

como mascotas.

Se buscó evaluar

también, la asociación entre la presencia de la bacteria con el estado de salud del

animal.

Adicionalmente, esta investigación buscó responder la pregunta de si las tortugas

incautadas por el Área Metropolitana eran reservorios de Salmonella y

se

constituyen en una posible fuente de contaminación para el humano.

Los resultados obtenidos podrían servir como base para implementar campañas

de información a la comunidad sobre el riesgo de extraer a estos animales de su

hábitat natural y de tenerlas como mascotas, no solo por el efecto sobre el animal

sino también sobre la salud humana, especialmente en niños que son los más

susceptibles a desarrollar infecciones por Salmonella spp.

4.2. Pregunta (s) de Investigación

Por lo anterior y ante la falta de datos en nuestro país al respecto, con este trabajo

se pretendió responder las siguientes preguntas:

1. ¿Cuál es la frecuencia de infección por Salmonella enterica de las tortugas

semiacuáticas recibidas en el CAV?

2. ¿Si hay tortugas infectadas, los aislamientos pertenecen a los serotipos S.

Enteritidis y/o S. Typhimurium causantes de enfermedad en el humano y

otros animales?

5. MARCO TEÓRICO

La salmonelosis es una enfermedad mundial que afecta a la población en general,

el agente etiológico pertenece al género Salmonella que es un bacilo corto, Gram

negativo, flagelado, anaerobio facultativo y que está estrechamente relacionado

con los otros géneros de la familia Enterobacteriaceae a la cual pertenecen. Estos

microorganismos crecen en un amplio rango de temperatura (7°-48° C) a un pH

entre 4 y 8 (7). Son bacterias móviles que producen sulfuro de hidrógeno (H 2 S) y

fermentan glucosa pero no lactosa y que no desarrollan cápsula ni espora. Son

causantes de un amplio número de manifestaciones clínicas en seres humanos y

algunos animales (7, 8).

Su nomenclatura es compleja y ha variado continuamente, desde el concepto

inicial

serotipo-especie

propuesto

por

Kaufmann

en

1966

basado

en

la

identificación

serológica

de

los

antígenos

somáticos

(O)

y

flagelares

(H),

incluyendo

otras

propuestas

taxonómicas

fundamentadas

en

características

clínicas o bioquímicas y más recientemente en el establecimiento de relaciones

genómicas. Un estudio sobre la taxonomía de Salmonella realizado en 1973

demostró mediante estudios de hibridización ADN-ADN que todos los serotipos de

Salmonella se relacionaban altamente y se debían considerar como una especie

única. Después en 1989 con nuevos análisis de hibridización describieron una

segunda

especie,

Frecuentemente

se

Salmonella

utiliza

la

bongori,

antes

nomenclatura

conocida

como

recomendada

por

subespecie

el

Centro

1.

de

Referencia e Investigación de Salmonella de la Organización Mundial de la Salud

en el Instituto Pasteur (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on

Salmonella) que acorde con los hallazgos genéticos describe dos especies

distintas:

Salmonella

bongori

y

Salmonella

enterica

(antes

Salmonella

choleraesuis) dividida esta última en 6 subespecies que se diferencian por sus

características

bioquímicas

y

genéticas

(9).

En

la

tabla

1

se

observa

la

nomenclatura actualmente utilizada para Salmonella sp.

Tabla 1. Especies y subespecies del genero Salmonella

ESPECIE

SUBESPECIE

Salmonella enterica

enterica (I)

salamae (II)

arizonae (IIIa)

Salmonella bongori

diarizonae (IIIb)

houtenae (IV)

indica (VI)

Cada subespecie contiene a su vez varios serotipos definidos por su fórmula

antigénica. En la especie S. enterica subespecie enterica están la mayoría de los

serotipos que producen enfermedad en el humano como Salmonella Enteritidis y

S. Typhimurium.

Salmonella puede causar diferentes síndromes clínicos, que se presentan en

forma exclusiva o superpuesta y que corresponden a portador crónico, fiebre

entérica,

gastroenteritis,

osteomielitis o abscesos).

bacteremia

e

infecciones

focales

(meningitis,

En el caso de las fiebres entéricas, afectan específicamente a los humanos y se

pueden clasificar como fiebre tifoidea si es producida por S. Typhi o paratifoidea si

es producida por S. Paratyphi A, Paratyphi B o Paratyphi C,

De otro lado, la gastroenteritis es descrita en la literatura como el conjunto de

enfermedades o síndromes gastrointestinales causados por

serotipos zoonóticos

como S. Enteritidis y S. Typhimurium los cuales son los de mayor distribución

mundial y se adquieren mediante el consumo de aguas o alimentos contaminados

o por manipulación de animales que sean reservorios, pues estos serotipos tienen

un amplio rango de hospederos y los animales la excretan por materia fecal (10).

También se puede transmitir persona a persona mediante la ingestión de materia

fecal de alguien infectado.

El cuadro clínico de la gastroenteritis producida por Salmonella puede incluir

diarrea, cefalalgia, dolor abdominal, náusea, vómito, fiebre y deshidratación.

Los síntomas duran aproximadamente de 4 a 7 días y la mayoría se recuperan sin

tratamiento; aunque en individuos inmunosuprimidos o en edades extremas como

los bebes, adultos mayores y pacientes con enfermedades inmunodepresoras

podría llegar a ser fatal si no se trata a tiempo.

Los

animales

que

se

han

reportado como

reservorios

de

Salmonella,

son

principalmente aves de corral y silvestres, vacas, cerdos y reptiles como las

tortugas, las cuales se creían inofensivas, pero el número de informes de casos de

Salmonella asociados a estos reptiles ha aumentado. Además, la incidencia de

Salmonella en tortugas ha sido el foco de investigaciones extensas en otros

países debido al uso común de estos animales como supuestos animales

domésticos (11).

En el caso especifico de las tortugas semiacuáticas, estos son animales silvestres

que pertenecen al orden de los quelonios y al igual que la mayoría de los reptiles,

dependen de la temperatura del medio ambiente para regular su temperatura

corporal, poseen un caparazón, formado a partir de las costillas, columna vertebral

y tejido escamoso y que consta de 2 partes, el caparazón dorsal, y el caparazón

ventral, llamado también plastrón; presentan escamas en la piel, y tienen una

cavidad llamada cloaca donde desembocan el sistema digestivo, el sistema

urinario

y

el

sistema

reproductor.

Se

distinguen

fácilmente

por

su

forma

hidrodinámica,

su

caparazón

poco

prominente

y

presencia

de

membranas

interdigitales en manos y patas (12).

Las tortugas semiacuáticas son animales silvestres que llegan a las personas por

desconocimiento acerca del animal como tal y de los problemas que puede

presentar

un

animal

salvaje

que

se

presta

comportamiento dócil y letárgico.

para

la

domesticación

por

su

Se ha reportado que las tortugas albergan Salmonella en su tracto digestivo sin

que esta cause ninguna patología, la bacteria sale por materia fecal siendo éste el

principal foco de transmisión (13). El contacto de seres humanos con las heces sin

tomar

precauciones, como no lavado de manos, ingesta de alimentos o agua

contaminados,

facilita

que

la

bacteria

puede

ingresar

vía

oral

y

producir

enfermedad,

siendo

la

más

frecuente

la

gastroenteritis,

en

la

que

el

microorganismo llega a ileon e invade mucosas.

El diagnóstico de la enfermedad se hace mediante el aislamiento de Salmonella

en materia fecal. Para su cultivo se utilizan medios como el caldo de selenito

(siembra inicial), agares como el S.S, Hektoen y MacConkey y son positivos en el

90% de los casos en la primera semana de infección (14).

Otros métodos diagnósticos utilizados en la actualidad son la prueba de ELISA y

PCR, que es altamente específica y puede demostrar la presencia del gen hilA

específico de Salmonella enterica. Las pruebas realizadas en materia fecal de

personas infectadas pueden dar positivas hasta 6 meses después de la infección

puesto que algunos pacientes quedan con estado de portador crónico (15).

6.1. General

6. OBJETIVOS

Determinar la presencia de Salmonella enterica en tortugas semiacuáticas del

Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre del Valle de Aburra (CAV).

6.2. Específicos

1. Aplicar la prueba de PCR para la detección del gen hilA de Salmonella

enterica en muestras de materia fecal de tortugas semiacuáticas del CAV.

2. Detectar

por

métodos

bacteriológicos

convencionales

(coprocultivo),

Salmonella enterica a partir de muestras de materia fecal de tortugas

semiacuáticas del CAV.

3. Correlacionar las características morfológicas y el estado de salud de las

tortugas semiacuáticas del CAV

diferentes pruebas de laboratorio

con los resultados obtenidos en las

4. Identificar

si

los

aislamientos

obtenidos

de

tortugas

corresponden

a

Salmonella serotipos Enteritidis y Typhimurium.

7.1. Tipo de estudio:

7. METODOLOGÍA

Fase 1. Estudio de corte, durante dos meses.

Fase 2: Descriptivo experimental, durante 6 meses.

7.2. Población: Tortugas semiacuáticas que ingresaron al CAV entre los meses

de marzo y noviembre de 2007.

7.3. Diseño muestral:

Fase 1: Las tortugas que ingresaron en un periodo de dos meses al CAV.

Fase 2: Se realizó la escogencia de una muestra representativa de 110 tortugas,

calculada utilizando el software Epi Info-6, tomando como universo el número

reportado de tortugas recibidas en el CAV durante un periodo de 6 meses del año

2007 con una prevalencia del 10%, un intervalo de confianza del 95% y un error

del 5%.

7.4. Descripción de las variables

Tabla de variables

Nombre

Definición

Dimensión

Tipo

Escala de

medición

Talla

Medida en centímetros desde la cabeza hasta la cola

Centímetros

Cuantitativa

Razón

Sexo

-

1 macho

Cualitativa

Nominal

2 hembra

dicotómica

Peso

Medida en gramos

Gramos

Cuantitativa

Razón

Especie

Clasificación

Nombre

Cualitativa

Nominal

taxonómica

científico

Condición corporal

Estado definido en marco teórico

Buena

Cualitativa

Nominal

Regular

politómica

 

Mala

Edad

De acuerdo a la talla corresponda a las característica de especie

Juveniles

Cualitativa

Nominal

Adultas

Cultivo

Crecimiento de

Positivo

Cualitativa

Nominal

bacteriológico

Salmonella

Negativo

Dicotómica

enterica.

PCR de género

Detección de

Positiva

Cualitativa

Nominal

Salmonella.

Negativa

Dicotómica

PCR múltiple S. Enteritidis

Detección de S. Enteritidis

Positiva

Cualitativa

Nominal

Negativa

Dicotómica

PCR múltiple S. Typhimurium

Detección de S. Typhimurium

Positiva

Cualitativa

Nominal

Negativa

Dicotómica

7.5.

Técnicas de recolección de la información

Instrumento

de recolección

de la información:

consignando las variables mencionadas.

base

de datos

en

excel

7.6. Técnicas de procesamiento y análisis de los datos

7.6.1. Procedimientos.

Manejo de tortugas y toma de muestra

A los animales que ingresaron al CAV en el periodo de tiempo antes mencionado,

se les registraron variables como tamaño, sexo, condición corporal y estado en el

que ingresaron y se les identificó de acuerdo a la clase taxonómica.

El manejo de las tortugas y la toma de muestras lo realizaron las estudiantes de

veterinaria y la estudiante de bacteriología bajo la supervisión de la Medica

Veterinaria, siguiendo todas las normas de bioseguridad para evitar la adquisición

de una zoonosis. Se realizó desinfección de la mesa donde se iban a colocar las

tortugas con glutaldehido. Las tortugas se sostuvieron del plastrón y escudos

marginales del caparazón y a través de la desinfección

de la zona cloacal y

pericloacal con una solución yodada

al 5%, se disminuyó la contaminación de la

muestra con agentes externos. A continuación,

se tomó una muestra de materia

fecal por medio de un hisopado impregnado con solución salina al 0.9%, el cual se

introdujo

en la zona cloacal, se realizaron varios movimientos rotatorios para

luego retirar el hisopo y depositar la muestra en un tubo eppendorf de 1.5 ml tapa

presión con solución salina; dicho tubo fue refrigerado. La muestra recolectada se

utilizó para realizar PCR y coprocultivo en los medios bacteriológicos: caldo

selenito, Agar MacConkey y Agar Hektoen. En las fotos 1, 2 y 3 se observa el

procedimiento de toma de muestra.

1, 2 y 3 se observa el procedimiento de toma de muestra. Foto 1: Limpieza del

Foto 1: Limpieza del sitio de toma de muestra.

el procedimiento de toma de muestra. Foto 1: Limpieza del sitio de toma de muestra. Foto

Foto 2: Limpieza de la tortuga.

Foto 3: Hisopado cloacal En la gráfica 1 se puede observar un esquema del método

Foto 3: Hisopado cloacal

En la gráfica 1 se puede observar un esquema del método de toma de muestras.

puede observar un esquema del método de toma de muestras. Grafica 1: Método de toma de

Grafica 1: Método de toma de muestra de materia fecal de tortugas.

7.6.2. Técnicas de laboratorio para detección de Salmonella enterica

7.6.2.1. Coprocultivo.

Este procedimiento comprende los siguientes pasos:

Siembra en Caldo Selenito

Entre 100 y 500 µl de materia fecal fueron sembrados en caldo selenito por 18-24

horas a una temperatura de 35 a 37ºC en aerobiosis para permitir el crecimiento

de Salmonella.

En las fotos 4 y 5 se puede observar este procedimiento.

en aerobiosis para permitir el crecimiento de Salmonella . En las fotos 4 y 5 se
Fotos 4 y 5: Siembra en caldo selenito. Repique a medios sólidos El selenito fue

Fotos 4 y 5: Siembra en caldo selenito.

Repique a medios sólidos

El selenito fue repicado en los agares MacConkey y Hektoen y se incubó por 18-

24 horas a 35-37ºC.

Identificación de los aislamientos

A partir de los medios sólidos se realizó la identificación bioquímica con la prueba

API20E® (Biomerieux) de los aislamientos compatibles con Salmonella enterica,

estos son no fermentadores en agar MacConkey y no fermentadores punto negro

en agar Hektoen.

Prueba de PCR

Se realizó PCR para la detección del gen hilA de Salmonella enterica de la

muestra

de

materia

fecal

sembrada

en

el

selenito

y

a

las

colonias

no

fermentadoras punto negro del Hektoen, de acuerdo al siguiente protocolo.

7.6.2.2. Extracción del ADN bacteriano:

 

Se utilizó

el

protocolo de buffer

de lisis modificado

descrito por

Haque

y

colaboradores (16). Brevemente, se realizó extracción de ADN a 500 µl de selenito

sembrados en materia fecal. Cada muestra fue centrifugada a 12,000 rpm por

cinco minutos a temperatura ambiente para separar la muestra. Un ml de buffer de

lisis (0.2% Triton X100 en Tris HCL mas EDTA pH 8.0) se adicionó al sedimento.

La mezcla se aspiro varias veces y se centrifugó a 12,000 rpm a temperatura

ambiente por seis minutos, el sobrenadante fue descartado y el procedimiento se

repitió nuevamente. El sedimento fue lavado una vez con agua destilada y

centrifugado a 12,000 rpm a temperatura ambiente 1 minuto. El sobrenadante se

descarto y el sedimento fue resuspendido en 100 µl de agua destilada ultra pura

estéril. Los tubos fueron sellados y se pusieron en agua en ebullición por 20

minutos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente antes de realizar la PCR.

Iniciadores:

En la Tabla 2 se pueden observar las secuencias de los iniciadores que se

utilizaron en el presente estudio y el peso de los productos de amplificación.

Tabla 2. Secuencias de los iniciadores para el gen hilA y tamaño de los productos

de amplificación.

Iniciador

Secuencia

Producto de

Amplificación

hilA US

hilA DS

5’-GCATGGATCCCCGCCGGCGAGATTGTG-3’

5’-CGGAAGCTTATTTGCGCCATGCTGAGGTAG-3’

854 pb

Condiciones de amplificación:

En las Tablas 3 y 4 se observan las condiciones de la PCR.

Tabla 3. Reactivos y condiciones de la prueba de PCR.

Reactivo y concentración

Volumen

Super mix Invitrogen

15 ul

Iniciador forward 10 µM

0,5 µl

Iniciador reverse 10 µM

0,5 µl

ADN

4

Volumen final de la reacción

20 µl

Tabla 4. Programa de PCR.

Paso

Temperatura ( o C)

Tiempo (min)

No. de Ciclos

Desnaturalización

94

5

1

Desnaturalización

94

1

Alineamiento

65

1

30

Extensión

72

1

Extensión final

72

7

1

 

4

Indefinido

1

Cada muestra se amplificó por duplicado. Se procesaron un control positivo

(Salmonella enterica ATCC 14028) y dos controles negativos (uno sin DNA

bacteriano, reemplazado con 4 µl de agua destilada estéril y el otro con 4 µl de

DNA de Escherichia coli)

7.6.2.3. Detección de productos de amplificación

En un gel de agarosa al 1% teñido con SYBRSAFE, 10 µl del producto de

amplificación fueron fraccionados electroforéticamente a 100 voltios por una hora.

En cada gel se corrieron adicionalmente el control positivo y los dos controles

negativos.

Como resultado a las muestras

positivas para la presencia del gen hilA se

procedió a realizar la PCR para identificar si el aislamiento correspondía a los

serotipos S. Enteritidis o S. Typhimurium, siguiendo el mismo protocolo de

amplificación y electroforesis pero realizando una PCR múltiple utilizando los

cebadores descritos en la tabla 5.

Tabla 5. Secuencias de los iniciadores de la PCR múltiple y tamaño de los

productos de amplificación.

Iniciador

Secuencia

Producto de

 

Amplificación

Sef 167 Fw

5’-AGGTTCAGGCAGCGGTTACT-3’

312

Sef 478 Rv

5’-GGGACATTTAGCGTTTCTTG-3’

Fli15

5’-CGGGTGTGCCCAGGTTGGTAAT-3’

559

Tym

5’-ACTCTTGCTGGCGGTGCGACTT-3’

En la figura 2 se observa la metodología empleada para la realización del

coprocultivo y de PCR.

Figura 2: Metodología empleada para la realización del coprocultivo PCR. y de 33

Figura 2: Metodología empleada para la realización del coprocultivo

PCR.

y de

8. CONSIDERACIONES ÉTICAS

Se siguieron las consideraciones éticas expuestas en la ley 84 de 1989, que

reglamenta la protección de los animales.

Teniendo en cuenta los decretos de dicha ley se aclara lo siguiente:

- Como se mencionó en la justificación, Salmonella enterica es una bacteria de

alto riesgo zoonótico y hasta la fecha no se cuenta con proyectos de investigación

a nivel nacional, que descarte la posibilidad de esta fuente de transmisión hacia

los humanos u otras especies animales

- La manipulación fue de acuerdo a los protocolos establecidos para la especie, de

manera que se evitó cualquier tipo de lesión o daño corporal de los animales

muestreados.

- Adicionalmente a esto, la revisión bibliográfica realizada reportó que el método a

utilizar en el presente proyecto es el único que garantizaba la determinación de

Salmonella, en vista de las características de la bacteria.

- El procedimiento utilizado para la toma de la muestra no requirió ningún tipo de

anestesia, ya que los hisopos utilizados están directamente relacionados con el

tamaño promedio del bolo fecal y no se extrajo ninguna otra muestra diferente a la

materia fecal.

- Dentro de la selección de animales a muestrear únicamente se tuvo en cuenta

aquellos que por tamaño y estado sanitario, así lo

permitieron, evitando siempre

el sufrimiento,

dolor y

estrés

provocado por los procedimientos descritos

anteriormente.

9. RESULTADOS

Se realizó una prueba piloto con 236 muestras en la cual se observó inhibición del

crecimiento bacteriano cuando se almacenaron en solución salina y se sometieron

a congelación, por lo cual se decidió cambiar el almacenaje por caldo selenito y

dejar las muestras a temperatura ambiente hasta ser procesadas para cultivo y

PCR.

En total se analizaron 110 tortugas, la especie más representativa fue la especie

Kinosternum dunni ( tortuga caja) con 39 (35,45%), le sigue la especie Trachemys

scripta ( icotea ) con 36 (32,7%), la especie Rinochlemys melanosterna (tortuga

palmera) con 23 (20,9%), la especie Podocnemis unifilis ( tortuga brasilera) con 8

(7,3%) , la especie Podocnemis lewyana, nombre común (charapa o de río) con 2

(1.8%), 1 tortuga Chelus fimbriata (mata mata) que le corresponde un (0.9%) y 1

Chelidra serpentina ( tortuga mordedora) que le corresponde el otro (0.9%).

Por género se muestrearon 50 (45.5%) machos y 60 (54.5%) hembras.

Por condición corporal, 91 (82.7%) presentaron buena condición, 12 (10.9%)

regular condición y 7 (6.4%) mostraron una condición corporal relativamente mala.

Por coprocultivo 30 (27.3%) de las 110 muestras estudiadas fueron positivas para

Salmonella sp.

Se identificaron 8 especies de enterobacterias pertenecientes a la flora intestinal

normal

de las tortugas,

las cuales

están listadas

en

la tabla

6.

De estas

Enterobacter sakazaki es patógeno para humanos.

 
 

Enterobacterias

No. de

 

%

 

aislamientos

 

Serratia odorifera.

 

13

 

40.6

Serratia liquefaciens

1

3.1

Providencia rettgeri.

2

6.3

Raoutella ornithinolytica.

4

12.5

Enterobacter sakazaki

7

21.8

Citrobacter braakii

1

3.1

Kluyvera sp.

2

6.3

Enterobacter cloacae

 

2

6.3

Total

32

 

100

Tabla 6. Otras enterobacterias encontradas por API.

Por PCR, 38 (34.5%) de las 110 muestras analizadas fueron positivas para

Salmonella enterica, de estas 30 lo fueron también por cultivo. Las otras 8

muestras presentaron cultivos positivos para otras enterobacterias y no para

Salmonella.

En la figura 3 se observa la PCR para Salmonella enterica con muestras positivas

y negativas.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

y negativas. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1000 pb

500 pb

854 pb

Figura 3.

Gel para el gen hilA con muestras positivas y negativas. Línea 1:

Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas); línea 2: Control negativo;

líneas

3,

5,

6,10,12,16

muestras

positivas

para

el

gen

hilA;

líneas

4,

7,

8,9,11,13,14,15, 17 y 18 muestras negativas para el gen hilA;

línea 19: control

positivo Salmonella Typhimurium ATCC 14028.

Al realizar la PCR múltiple para identificar los serotipos S. Enteritidis y S.

Typhimurium, productores de diarreas en humanos, se detectó la presencia de S.

Enteritidis en 26 (68.4%) muestras, S. Typhimurium en 1 (2.6%), ambos serotipos

en 4 (10.5%) muestras y se identificó solo género en 7 (18,4%) muestras.

En la tabla 7 se pueden observar los porcentajes de los serotipos obtenidos por

PCR múltiple.

Serotipo

No

Porcentaje (%)

S. Enteritidis

26

68.4

S. Typhimurium

1

2.6

Ambos serotipos

4

10.5

Solo género

7

18.4

Total PCR Positivas

38/110

34.5

Tabla 7. PCR múltiple de las muestras positivas para el gen hilA.

En la Figura 4 se puede observar la PCR múltiple para la serotipificación de las

muestras positivas para el gen hilA.

1000 pb

500 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

Figura 4.

PCR múltiple para la serotipificación de las muestras positivas para el

559 pb

312 pb

gen hilA. Línea 1: Marcador de peso molecular de 100 pb (Fermentas); líneas 2, 4,

9, 11 y 17 muestras positivas para S. Enteritidis y S. Typhimurium; líneas 3, 5, 6,

7, 8, 13, 14, 15, 16 y 18 muestras positivas para S. Enteritidis; líneas 10 y 12

negativas para estos dos serotipos; línea 19: control positivo para S. Enteritidis;

línea 20: control positivo para S. Typhimurium.

La distribución por especie de tortugas en las 38 muestras positivas se puede

observar en la tabla 8. ,

Especie de tortuga

Número (%) de muestras

positivas

Kinosternon dunni

20 (52.6%)

Trachemys scripta

13 (34.2%)

Rinochlemmys melanosterna

2 (5,3%)

Podocnemis unifilis

2 (5,3%)

Chelydra serpentina

1 (2,6%)

Total

38 (100%)

Tabla 8. Distribución por especie de las muestras positivas.

En cuanto a la positividad de la PCR de género frente a la condición corporal de la

tortuga: 32 (84,2%) presentaron una condición buena, 5 (13,15%) una condición

regular y 1 (2,63%) presentó una condición mala.

10. DISCUSION.

En este estudio se detectó la presencia de Salmonella enterica por PCR en 38

tortugas del CAV, correspondientes al 34.5% del total de la población estudiada.

Por coprocultivo se detectó en 30 (27.3%) de las muestras estudiadas.

La diferencia de 8 (21.05%) muestras positivas que se obtuvieron solamente por

PCR

y no por coprocultivo,

probablemente se deba a que el inóculo de

Salmonella era muy bajo para ser detectado por cultivo y/o las otras bacterias de

la flora intestinal de estas tortugas inhibieron el crecimiento de Salmonella a partir

de esta muestra, pero no afectó el resultado de la PCR pues esta es más sensible

que el cultivo al no requerir bacterias enteras sino ADN.

Lo anterior coincide con lo reportado por Gaertner (17) en Estados Unidos quien

detectó

por

PCR

la

presencia

de

Salmonella

en

tortugas

de

diferentes

ecosistemas, por medio de una PCR para la detección del gen invA que al igual

que el hilA, gen blanco del presente trabajo, es especifico de Salmonella y está

ubicado en la isla de patogenicidad 1, y ambos genes son necesarios para el

proceso de invasión de la bacteria en las células intestinales.

Otros estudios como el realizado por Ebani

y colaboradores

(18)

reportan

Salmonella enterica en 73 de 305 (23.93%) muestras fecales. De igual manera

Jang y colaboradores (19) utilizando métodos bacteriológicos convencionales

detectaron Salmonella sp. en 14 de 46 reptiles (30.4%) incluyendo tortugas, en un

zoológico de Seul (Corea).

Hidalgo y colaboradores (20) utilizaron métodos bioquímicos y serológicos para

detectar la infección, pero en un porcentaje que solo fue de 5.1% pues solo

utilizaron métodos bioquímicos y no moleculares.

En el presente estudio se detectó la presencia de Salmonella en el 34.8% de las

tortugas

estudiadas

a

diferencia

del

estudio

realizado

por

Saelinger

y

colaboradores (21) quienes no detectaron la presencia de esta bacteria en 94

tortugas analizadas en Estados Unidos, posiblemente porque utilizaron métodos

microbiológicos convencionales y no la reacción en cadena de polimerasa.

Los resultados del presente trabajo son los primeros en nuestro medio aunque el

número de muestras analizadas fue de 110, es un indicador de la frecuencia de

infección por Salmonella en estos reptiles.

Este resultado indica que un número significativo de tortugas que ingresaron al

centro

de

atención

y

valoración

de

fauna

silvestre

del

área

metropolitana

presentaron

Salmonella

enterica,

pero

adicionalmente

el

total

de

tortugas

muestreadas presentaron algún tipo de microorganismo que puede provocar

enfermedades en humanos.

Además es un indicador del riesgo zoonótico en nuestro país y se asemeja con lo

reportado por Pasmans y colaboradores (22) en Estados Unidos ya que el uso de

estos animales es preferido mundialmente por los humanos como mascotas.

Mitchell y colaboradores (23) reporta la infección por Salmonella como causal de

muerte en animales en cautiverio, lo cual no se observó en el presente trabajo

pues de las tortugas positivas solo una presentaba mala condición corporal y se

debió principalmente al mal manejo por parte de los traficantes que la tenían en su

poder y no a la infección por Salmonella.

La detección de Salmonella en las tortugas confirma que esta especie es un

reservorio y potencial diseminador de la bacteria.

Llama la atención el alto porcentaje de S. Enteritidis encontrado en las Tortugas

de este estudio, lo cual evidencia su potencial zoonotico, pues este serotipo es

uno de los principales productores de diarrea en humanos en Colombia.

De igual manera Geue y colaboradores (24), concluyen sobre el peligro que

genera este tipo de tortugas acuáticas y recomienda un buen cuidado de la salud

del

animal

para

reducir

el

stress,

organismos patógenos.

lo

cual

puede

generar

la

excreción

de

Con los resultados obtenidos se concluye que las tortugas son reservorios de S.

Enteritidis y/o S. Typhimurium ya sea por el contacto con estas bacterias en su

ambiente silvestre o por el contacto con los humanos, pues estos serotipos

presentan amplio rango de hospederos y son los principales causantes de diarrea

humana en nuestro país.

Se deben llevar a cabo estudios adicionales que analicen un mayor número de

muestras y tratar de establecer el origen geográfico de las tortugas. En el presente

estudio no fue posible realizarlo debido a que las tortugas venían de diferentes

lugares y no se tenía conocimiento exacto de su procedencia para tomar este dato

como una variable más del trabajo.

En un futuro se pretende desarrollar a partir de estos resultados estrategias de

educación a la comunidad para dar a conocer que las tortugas son animales

silvestres y por esta razón no deben ser sacados de su hábitat para ser utilizados

como mascotas o para consumo, pues se altera su ciclo de vida, se ponen en

riesgo

de

extinción

y

presentan

un

riesgo

zoonótico

para

el

ser

humano.

11. CONCLUSIONES

1. Un 34.5% de las tortugas semiacuáticas del CAV estudiadas, presentan

Salmonella

enterica

y/o

enterobacterias

causantes

de

enfermedades

en

humanos.

2. Las

tortugas

semiacuaticas

del

CAV

son

portadoras

y

no

padecen

la

enfermedad

causada

por

Salmonella

y

las

diferentes

bacterias

antes

mencionadas

3. La mala condición corporal de algunas tortugas se debió a las condiciones

inadecuadas de manejo a las que eran sometidas por los traficantes, en donde

pasaban horas y días sin tomar ni comer ningún tipo de alimento.

4. No todas las muestras positivas a Salmonella por PCR lo fueron también en el

coprocultivo, esto quiere decir que no todos los cultivos bacterianos son

precisos y que para tener un mejor diagnóstico se deben realizar otro tipo de

procedimientos con mayor exactitud como fue el caso de la PCR convencional

y PCR múltiple.

5. Según los primeros resultados de las muestras que fueron refrigeradas,

Salmonella y otras bacterias presentes en la flora normal, no sobrevivieron a

las bajas temperaturas.

6. De acuerdo a los resultados obtenidos se concluyó que la tenencia de tortugas

semiacuaticas como mascotas y su consumo presenta un riesgo alto para la

salud

humana

animales.

debido

al

potencial

zoonotico

con

el

que

cuentan

estos

7. Debido a los resultados obtenidos para las tortugas semiacuáticas, es probable

que otras especies de reptiles que también son utilizadas como mascotas y

para consumo humano sean reservorios de Salmonella enterica, lo que daría

pie para la realización en el futuro de nuevos trabajos de investigación sobre el

tema.

12. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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13. ANEXOS

1. Resumen congreso colombiano de investigadores en enfermedades

infecciosas. Revista Infectio 2008.

2. Poster Simposio Zoonosis 2008. Universidad CES

3. Presentación en Jornadas de Investigación CES

4. Presentación En congreso Latinoamericano de Herpetología. Noviembre

de 2008. La Habana- Cuba.