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MARCO TEORICO

Electroforesis La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asignó a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este término se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular.

Fundamento

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo). El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las

moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La

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Electroforesis en Papel: El manejo del aparato ideado por TISELIUS era complicado y lento. hasta las de 2 . en un sentido amplio. El empleo del mismo en las técnicas electroforéticas. los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Asi pues comenzó la búsqueda por nuevos materiales a utilizar entre los cuales es el papel la sustancia que ha adquirido mayor importancia. se emplea en la separación de sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos. hizo que el uso de este método electroforético se reservara para clínicas centrales e institutos científicos exclusivamente. lo que. tanto en escala analítica como en escala preparativa (lo que se puede hacer corresponder. Es muy útil en los laboratorios clínicos por su fácil manipulación y su rápido desarrollo. embebidas en una disolución electrolítica Electroforesis en papel. siendo conocido y estimado cada vez más el valor científico de la fórmula proteica y el servicio que a ella podían prestar los métodos electroforéticos. Hoy día. que estuvieran al alcance. de tal manera que. surgió una sana fiebre (valga el contrasentido) de encontrar técnicas electroforéticas más sencillas. al menos sí de la mayoría. si no de la totalidad de los clínicos. respectivamente) han alcanzado una importancia tal. con las modalidades de electroforesis discontinua y continua. unido al considerable coste del mismo. que han llegado a hacerse insustituibles para una amplísima gama de cuestiones. La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea. por ello a mayor temperatura mayor difusión. como soporte del medio: la electroforesis sobre tiras de papel. No obstante. si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución.energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura. desde las que tienen un interés puramente científico. las técnicas electroforéticas en papel.

especialmente. con resultados que se expondrán más adelante. es de suponer que pueda ejercer acciones sobre las partículas móviles. también han sido objeto de nuestra atención. como antes se ha apuntado. en definitiva. el uso combinado de aquélla con la electroforesis. parte de nuestros experimentos han servido para confirmarlo plenamente. más que como esenciales. En principio. la importancia se manifiesta más claramente en el tratamiento de sustancias de carácter macromolecular. secundarias con respecto al fin fundamental. para estas últimas. No hay duda de que este efecto es previsible. como mejorantes de otras técnicas con las que quizás se logra ya el efecto deseado. por ejemplo. Cuando se utiliza el papel de filtro como soporte sólido del medio en que se produce la migración electroforética. etc. puesto que lo que ocurre realmente es que. activación termodinámica. Por ello. y a la vista de su especial poder adsorbente. o incluso una adecuada aplicación de esta última.. por ejemplo. Lo mismo podemos decir de otros factores. pero. ese poder de adsorción ineludible del soporte. su tratamiento constituyó un problema difícil hasta el advenimiento de la cromatografía. realmente. Este es. o b) eminentemente químicos. que. un retardo en la electromigración.importancia eminentemente práctica ya sea desde un punto de vista clínico. cuando no una mejora de resultados. modificando. suponen un ahorro de tiempo extraordinario para lograr los mismos efectos. y que producirán. en el fraccionamiento industrial de materiales biológicos. los métodos electroforéticos se presentan. afectan igualmente al proceso. A su vez. como aquellos que dependen del número y clase de grupos modificados de la celulosa (grupos 3 . pero ello no excluye a las de pequeño tamaño. estos factores pueden ser de dos clases: a) de tipo puramente físico. ya por un fin técnico. como los que se refieren al grado de porosidad. el caso de los aminoácidos.

constituyentes de la celulosa. Sus poros. presentan 4 . e hidrofílico. como se deduce de las consideraciones hechas anteriormente sobre la migración de partículas en el papel. Entre las fibras existe una afinidad química que comunica al papel una fuerza considerable cuando seco. reductores. La clase de papel soporte del medio. etc. durante el tratamiento seguido en sil preparación. físicas o químicamente. Su influencia radica en su estructura misma. sin embargo. Estos y otros factores han de tenerse en cuenta para el estudio teórico de la electromigración en la celulosa. Desde el punto de vista químico. a cuyos numerosos grupos oxhidrilos debe sus propiedades hidrofílicas y su mojabilidad por disolventes polares en general.metoxilos. No puede considerarse. por macromoléculas no degradadas de celulosa). espacios intersticiales (poros) de dimensiones ampliamente variables. pero insoluble en agua. el papel de filtro está constituido por celulosa bastante pura (en el caso ideal. de acción capilar. si bien es preciso despreciar aquellos otros que influyen en menor cuantía. entre sí. tendrá una gran importancia con vistas a conseguir una buena separación. que han sido retenidos. por el carácter propio de las fibras de celulosa. y en las propiedades que de ella se derivan. el papel de filtro como una sustancia lipófoba. extraños a la misma. De aquí que el papel de filtro sea un medio poroso. resultan bastante grandes. puesto que las cadenas de glucosa. aun para las moléculas mayores. en ocasiones pueden determinar el que ésta vaya acompañada de grupos de iones activos. a pesar de que dicha fibras son sólo moderadamente largas. considerada como sistema capilar C-52 María del Carmen Bonmati Limarte (electroforesis en papel o capilar). al objeto de simplificar la discusión matemática. La estructura física del papel de filtro puede representarse como un entrecruzado tridimensional de fibras de celulosa que dejan. tanto física como química. si bien no son inherentes a la celulosa per se. urónicos.) o incluso los que.

se deduce de las consideraciones hechas por algunos autores sobre el papel cromatográfico que dichos resultados serán tanto mejores cuantas menos condiciones cumpla el papel de las requeridas para la cromatografía capilar (también llamada por adsorción o retención).5 cm del cátodo. Conviene ser rápido en todo esto para evitar que se evapore el líquido del acetato y se reseque 3) En la cuba se coloca en ambos compartimentos una buena cantidad de buffer. los menos porosos. se deja durante unos 10 minutos.también afinidad para otras cadenas y anillos carbonados. el papel de filtro puede poseer grupos iónicos en alguna proporción. Así. aunque siempre es inevitable que se produzca una pequeña adsorción física de las macromoléculas. 2) La siembra se hace a 1. es corriente encontrar. Por esto. no es posible considerar a ningún papel de filtro como celulosa absolutamente pura. se saca y se absorbe el exceso con papel tissue. transcurridos. trazas de otras sustancias. como hemicelulosas y ligninas. algunos grupos carboxilo. que provienen del proceso de elaboración. Hay que tener en cuenta que es frecuente encontrar. Proceso para llevar a cabo la electroforesis en papel: 1) Se toma una tira de acetato de celulosa y se seca entre dos papeles tipo tissue. mojable igualmente por disolventes no polares y por lípidos y lipoides. luego se coloca en un recipiente que contenga buffer. se monta sobre el puente de la cuba con la cara opaca hacia arriba. en la práctica. Suele darse como norma el utilizar aquellos tipos de papel de propiedades adsorbentes menores. sobre el mismo esqueleto de la celulosa. es decir. Y se pone el puente con la tira. en el mismo. Sin embargo. aunque la celulosa pura se considera como no ionizable. 5 . siendo. por lo tanto. En cuanto a los resultados prácticos obtenidos en la electroforesis con este soporte.

una vez hecho esto. Si se quiere visualizar por dónde anda la corrida. Electroforesis en Gel: La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño. 8) Luego se trasvasa el líquido a su frasco y la tira puede lavarse con agua.4) Se enciende la fuente. si se manipula. Una vez que se le aplica calor la tira se pone transparente se la deja secar y ya tenemos nuestra corrida electroforética. si es regulable se le da unos 150v y la corriente andará mas o menos a 1 mA por cada cm de ancho de la tira. en mi caso uso tiras de 2 cm. agitándola y haciendo sucesivos lavados hasta que quede el fondo completamente blanco. se le agrega al suero una tintura (azúl de bromofenol en alcohol al 1%) 6) Transcurrido el tiempo se desconecta la fuente de la red y se saca la tira. luego se pasa al líquido trasparentizador por 2 minutos. puede ser el calor de una lámpara eléctrica. 6 . la forma o el punto isoeléctrico. se pasa luego a un recipiente con liquido decolorante. Antes de pasar al líquido trasparentizador conviene por 1 minuto colocar en metanol puro. 7) Se traslada la tira cortándole los extremos (dejamos solo la parte donde se encuentra el suero ya fraccionado) a un recipiente con el líquido colorante por unos 4 minutos. pero falta transparentizar. las manos deben estar bien limpias y desengrasadas. 5) Se deja 50 minutos. se pone sobre alguna superficie caliente. en este momento ya se visualizan perfectamente las fracciones. se saca con precaución la tira y se la coloca sobre un vidrio cuidando que no queden burbujas de aire.

N´-metileno bisacrilamida inducida por radicales libres en un buffer. el movimiento electroforético de las mas grandes se ve impedido en comparación con el de las mas pequeñas. insolubles en agua. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE). al revés de lo que ocurre en la cromatografía de filtración por geles. Forma. dado que en el caso de la electroforesis en gel no hay espacio de solvente como en el que se ubica entre las microesferas de la cromatografía de filtración por geles (los geles mas usados en electroforesis se generan en forma directa en el aparato electroforético.Permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. las separaciones moleculares se basan en la filtración de geles y en las movilidades electroforéticas de las moléculas que se intentan separar. poliacrilamida y agarosa tienen poros de dimensiones moleculares cuyos tamaños pueden especificarse. Es químicamente inerte. capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Los geles utilizados retardan las moléculas grandes en comparación con las de menor tamaño. Por lo general el gel se arma como una plancha rectangular delgada en la que pueden analizarse varias muestras en calles paralelas en forma 7 . Dado que las moléculas de una muestra no pueden abandonar el gel. Por ello. además. Los geles de poliacrilamida (PAGE) se forman por polimerización de la acrilamida y la N. relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. de propiedades uniformes. Además esta se halla entre los métodos mas poderosos y convenientes para la separación de macromoléculas. geles transparentes con estabilidad mecánica. Los geles mas usados. suplanto en gran medida a la electroforesis en papel.

pero de composición homogénea). tiene un pH tal (en general alrededor de 9 para las proteínas) que las macromoléculas tienen carga negativa. La muestra se coloca en fosas preformadas en la parte superior del gel. como el agar-agar. cuyas disoluciones (típicamente de 0. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido. que retarda el paso de las moléculas. Cada muestra puede contener no mas de 10microgramos de material macromolecular. Como alternativa. Lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas.000 nucleótidos. El gel se retira de su compartimiento y se aplica un método adecuado para visualizar las bandas de macromoléculas. lo que permite comparar muestras similares.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel. cuyos poros son demasiados grandes como para impedir la migración de las moléculas. El buffer. A continuación se aplica al gel una corriente directa de alrededor 300 V por un tiempo suficiente (30-90 min) para separar a los componentes macromoleculares en una serie de bandas discretas. Electroforesis en Geles de Agarosa.2 mg puede resolverse en hasta 20 bandas discretas.simultanea. que es el mismo en amnbos reservorios y en el gel. puede estar contenida en un tramo corto de “gel para muestra”. Mediante esta técnica.1 a 0. semisólido al enfriarse. 8 . se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20. se disuelve en una cantidad minima de una solución relativamente densa de glicerol o sacarosa que previene la mezcla con el buffer del reservorio superior. por lo que migran hacia el anodo ubicado en el reservorio inferior. una mezcla proteica de 0.

un equilibrio y se consigue la separación de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoeléctrico. En un solo electroforetograma bidimensional pueden observarse hasta 5. al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente. Se alcanza. es decir. pues se conoce el gradiente de pH del gel. Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. en consecuencia. que además se puede medir. Esto se consigue incluyendo en su preparación moléculas ionizables con valores de pK diferentes. y eventualmente alcanzan una región en la cual el pH es igual al punto isoeléctrico de la molécula muestra y.000 proteínas. de isoelectrofocusing).Enfoque Isoeléctrico: (También se llama enfoque isoeléctrico o IEF. en que las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos. Electroforesis Bidimensional: La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es realizar las separaciones del mismo espécimen de proteínas altamente complejas en dos direcciones distintas. Tras esta separación por carga las proteínas son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras la tinción del gel las proteínas aparecen formando manchas circulares. ésta detiene su avance. Como consecuencia. En primer lugar las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico por medio de isoelectroenfoque. por lo tanto la electroforesis bidimensional es una herramienta valiosa y la mas empleada para el análisis global en 9 . pues. La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad.

célula o compartimento subcelular. cuyos componentes varían en un organismo. La principal aplicación de esta técnica es determinar la composición de especímenes biológicos complejos. señales Bioquímicas o su estado fisiológico o patológico. completan la desnaturalización proteica por ruptura de puentes disulfuro. mostrando un patrón característico. 4) Separación en la 2ª Dimensión (SDS-PAGE): Una vez que las proteínas han sido separadas en función de sus propiedades eléctricas. (1996) para describir el conjunto de proteínas que se expresan por una célula o un organismo. Los Agentes caotrópicos como la urea y tiourea. tejido. surfactantes y agentes reductores. Equipo de Isoelectroenfoque: Protean IEF cell (BioRad). El protocolo de electroforesis bidimensional consiste en: 1) Se toma la muestra de proteínas: especímenes biológicos complejos. Los agentes reductores como el DTT (aunque también se emplean otros reductores alternativos no cargados). modificaciones interacciones y actividades y por ultimo en su identificación. El Proteoma es un elemento altamente dinámico. 2) Preparación de la muestra: el paso más crítico y clave en el éxito del experimento. pero con acento en su cuantificación. localización. A partir de un genoma en un momento dado. dejando expuestos los residuos hidrofóbicos que son solubilizados por los agentes surfactantes. 3) Separación en la 1ª Dimensión (Isoelectroenfoque): En primer lugar las proteínas se separan en base a su punto Isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados. En él se Emplean agentes caotrópicos.proteómica que se refiere al estudio del Proteoma el cual fue usado por primera vez por Wilkins et al. situaciones de estrés. 10 . como consecuencia de cambios en su entorno. administración de drogas. Dicha técnica permite la separación de cientos o miles de proteínas en un único gel. provocan la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno.

El software de análisis usado en el Servicio es el PDQuest de Bio-Rad. La elección del método de tinción viene determinado por diferentes factores. Estas dos separaciones sucesivas permiten aislar prácticamente todas las proteínas de un proteoma en una matriz bidimensional (“electroforesis bidimensional”). Los instrumentos de adquisición de imágenes más comúnmente usados son los densitómetros (GS800) y los escáneres de fluorescencia (FX ProPlus). precio y tipo de equipo de adquisición de imagen disponible. rango lineal. facilidad de uso. Equipo de Electroforesis Bidimensional: Protean Plus Dodeca Cell (BioRad) 5) Tinción: Para visualizar las proteínas en el gel. éstos deben ser digitalizados. Antes de que los geles donde hemos separado las proteínas puedan ser analizados con un sistema de evaluación de imágenes. éstas deben ser teñidas de alguna manera. Los métodos más usados son la tinción con Coomassie Blue. la tinción fluorescente con Sypro Ruby y la tinción con Plata. Se ofrece la opción de usar el software Decyder de GE para análisis de imágenes DIGE. Equipo de Electroforesis Bidimensional: Mini Protean System (BioRad). Todos ellos funcionan con softwares de análisis diseñados para detectar y cuantificar “spots” en las imágenes digitales así como para comparar y analizar estadísticamente los geles de interés. como la sensibilidad deseada.pasamos a separarlas en función de su tamaño o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS). 11 . Gel Bidimensional: Tinción Coomassie Blue 6) Adquisición y Análisis de Imagen: La habilidad para adquirir datos en formato digital es uno de los principales factores que hace a los geles bidimensionales ser un práctico medio para recoger información sobre un proteoma. aunque esta última no es del todo compatible con el análisis posterior de las proteínas por espectrometría de masas.

masas molares y correlacionar distintos patrones electroforéticos para análisis de fenotipos. ha sido una técnica ampliamente utilizada en la confección de mapas de referencia. La electroforesis bidimensional. calcular puntos isoeléctricos. debido a su elevada resolución. Cuando estos mapas se utilizan para comparar distintas situaciones experimentales. líneas celulares normales y tumorales. es decir. tratamientos con fármacos o compuestos tóxicos. en la disección de la composición proteica de un determinado orgánulo o tipo celular.La interpretación de los resultados se realiza mediante numerosos programas especiales de análisis de la imagen que permiten cuantificar proteínas. como pueden ser distintas condiciones de cultivo. es cuando la electroforesis bidimensional adquiere toda su funcionalidad 12 . taxonomías (identificación de géneros y especies). tejidos sanos o enfermos.