Está en la página 1de 49

Prefacio El curso de Tecnologa Biomolecular tiene como principal objetivo mostrar al estudiante la utilidad de las diferentes tcnicas que

involucran molculas para la evaluacin del estado de salud de un paciente, la realizacin de un diagnstico o el monitoreo del tratamiento de algn paciente en especfico. Es muy frecuente que se asocie el trmino tecnologa biomolecular con su pariente cercano, la biotecnologa, por lo que es frecuente tambin que se piense que el primer trmino se refiere nica y exclusivamente al uso de ADN. Si bien es cierto que en los ltimos tiempos se ha revolucionado el campo de la medicina por medio del uso de tecnologa relacionada con el ADN, existen otros medios que permiten un buen diagnstico o manejo de enfermedades. Es por ello que en este curso se cubren todas las biomolculas, aunque se hace mucho nfasis en las tcnicas ms recientes, que generalmente involucran a los cidos nucleicos. 1. Base bioqumica de la enfermedad a. Las enzimas: un rol en la definicin de las enfermedades El descubrimiento de las vas metablicas bsicas en los organismos vivos ha sido un factor clave en la comprensin de la naturaleza de muchas enfermedades. Los detalles de la manera en la que se oxidan los carbohidratos, las grasas y las protenas como combustibles metablicos y su relacin con la sntesis y uso del AT puede parecer, a primera vista, terico y remoto. Sin embargo, los estudios sobre el metabolismo intermediario ha descubierto nuevas formas de analizar y caracterizar muchas enfermedades, as como brindar una nueva visin de los mecanismos involucrados cuando una clula funciona de forma anormal. En la actualidad es posible explicar una gran variedad de situaciones clnicas y patolgicas en trminos de problemas asociados ya sea a enzimas especficas o con factores que controlan e integran la actividad enzimtica en los tejidos y rganos humanos. Una relacin importante entre el metabolismo y la enfermedad se realiz en 1908 por Archibald Garrod. El apreci de forma correcta que las enfermedades pueden ser causadas por la ausencia o modificacin genticamente determinada de enzimas especficas. Esta condicin se conoci con un error nato del metabolismo. Aunque el mismo Garrod report solamente cuatro casos, actualmente se conocen muchos cientos de condiciones de este tipo. De forma individual, estos defectos natos del metabolismo son muy poco frecuentes; sin embargo, estas condiciones son importantes y pueden tener consecuencias desastrosas para los jvenes que las padecen. Por ejemplo, la fenilcetonuria afecta a uno de cada diez mil seres humanos; la fibrosis qustica, que tiene una incidencia de uno de cada dos mil quinientos nacidos vivos; y la galactosemia, que se da en uno de cada cuarenta mil nacidos vivos. El diagnstico de un desorden metablico hereditario puede involucrar la medicin de la actividad de una enzima dada en una muestra tomada de algn tejido accesible, tal como sangre. Cuando se asocian defectos en enzimas con rganos internos, tal como el hgoado, la presencia de la enfermedad puede inferirse de forma ms sencilla, midiendo niveles de sustratos acumulados de la enzima u otros metabolitos en alguno de los fluidos corporales. En la ruta metablica que se muestra en la Figura 1-1, el producto X se sintetiza a partir del sustrato A por una serie de reacciones catalizadas por enzimas. Adems de eso, el compuesto A
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 1

puede metabolizarse hasta el producto Z por medio de una ruta menor, de manera que normalmente se produce una pequea parte de producto Z. Si el paciente no posee la enzima d, podrn observarse las siguientes consecuencias: Reduccin en la formacin de E y X. Si cualquiera de los dos, o ambos, son productos celulares esenciales, sin ruta alterna de sntesis, puede darse una condicin de deficiencia. Acumulacin de C y, posiblemente, de A. Si las sustancias son txicas, puede darse como resultado dao celular. Aumento en los niveles de Z. La produccin de esta molcula se favorece bajo estas condiciones y puede ser txica.

Las cantidades excesivas de C y de Z pueden acumularse en la sangre y, consecuentemente, excretarse por la orina.
Ruta principal enzima b enzima d enzima f

Z
Ruta menor o alterna

Figura 1-1. Ruta metablica del producto X, y Z. Un ejemplo de un desorden metablico que involucra una situacin como esta es la fenilcetonuria, la cual resulta de la incapacidad de convertir el aminocido fenilalanina en tirosina. Esto se debe a la falta de actividad de la enzima fenilalanina hidroxilasa, la cual normalmente se encuentra en el hgado. El diagnstico puede lograrse por medio de pruebas clnicas simples. Se detectan altos niveles de fenilalanina en la sangre, as como metabolitos de la fenilalanina, tales como cido fenilpirvico, en la orina. La tirosina, que normalmente no es un aminocido esencial para el crecimiento, en este caso se convierte en necesario dentro de la dieta. Se cree que los altos niveles de fenilpiruvato y otros metabolitos inhiben el desarrollo cerebral a travs de la interferencia de la sntesis de mielina. Esto da lugar a un retraso mental, a menos que la condicin sea tratada. La fenilcetonuria se ha tornado un asunto de salud pblica en varios pases, y en el Reino Unido todos los bebs pasan por tamizaje para detectar la enfermedad al nacer. b. Otras protenas involucradas en enfermedades genticas La protena defectuosa que se asocia con una enfermedad hereditaria no siempre es una enzima. El producto de un gen podra, por ejemplo, funcionar como una molcula receptora o un canal de transporte en la membrana celular. Un ejemplo de esto se ve en la fibrosis qustica, una enfermedad gentica comn entre los caucsicos en Amrica del Norte y Europa. Se caracteriza por deficiencias pulmonares crnicas, y los pacientes pueden morir como resultado de la obstruccin progresiva de las vas respiratorias con una mucosidad densa. El moco tambin
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 2

puede formar tapones en los ductos biliares, evitando que las enzimas se secreten en cantidades suficientes para digerir los alimentos y facilitar su absorcin. La fibrosis qustica se diagnostica por la deteccin de sudor excesivamente salado. La evidencia reciente sugiere que el gen defectuoso est asociado con un canal de iones cloruro en las clulas epiteliales, lo cual da como resultado la reabsorcin inadecuada de los electrolitos c. Deteccin de enzimas El conocimiento de las enzimas del metabolismo intermediario ha provisto de tcnicas para el diagnstico clnico de muchas enfermedades. La mayora en enzimas dentro de las clulas forman parte de vas metablicas y se encuentran frecuentemente asociadas con un compartimento subcelular especfico, tal como la mitocondria y los lisosomas. Por lo tanto, la concentracin normal de la mayora de enzimas dentro de la sangre es normalmente muy baja. Sin embargo, cuando las clulas estn daadas o se desintegran, las enzimas pueden salir y su aparicin en el suero puede ser signo de dao celular o muerte celular. Durante un infarto al miocardio (ms conocido como un ataque cardaco), parte del msculo cardaco se daa cuando su provisin de circulacin sangunea se ve obstruida por un cogulo. Las formas especficas de las enzimas tisulares, tales como la creatina cinasa, la aspartato aminotransferasa y la lactato deshidrogenasa, aparecen en la sangre. Una situacin similar se da cuando las clulas hepticas se daan por infeccin o por agentes txicos. La presencia en el plasma de las enzimas aminotransferasa o fosfatasa es indicativa de varios tipos de enfermedades hepticas. La aparicin en el plasma de ciertas enzimas del ciclo de la ornitina (normalmente asociado con la mitocondria) puede indicar que ha ocurrido dao en las mitocondrias. La ciencia clnica ha obtenido otros beneficios importantes de los estudios sobre el metabolismo intermediario. Uno de ellos es la comprensin del mecanismo por medio del cual ciertas drogas y otros agentes quimioteraputicos logran sus efectos, y luego son retirados del organismo. Los procesos de la detoxificacin puede verse como un mecanismo protector. Involucra un nmero de enzimas que transforman los compuestos farmacolgicamente activos a sustancias ms solubles en agua que puedan excretarse ms fcilmente. Un ejemplo de esto es el citocromo P-450. Este es el nombre que se le da a un grupo de enzimas estructuralmente relacionadas, todas con el grupo hem, localizadas principalmente en las membranas de retculo endoplasmtico en el hgado. Estas enzimas pueden introducir el grupo hidroxi a un gran nmero de drogas, hormonas esteroides, carcingenos y qumicos ambientales. Esto significa que hay miles de posibles sustratos para el citocromo P-450. Actualmente se conoce que muchos venenos no actan directamente, sino que primero son metabolizadas para causar dao y muerte a la clula. Este proceso enzimtico se conoce como sntesis letal o bioactivacin. Por lo tanto, el benzopireno, un contaminante de aire, agua y tierra que se da durante la combustin incompleta de material orgnico, se metaboliza por el citocromo P-450, produciendo qumicos reactivos que pueden atacar el ADN y el ARN, e inducen el cncer. d. Enfermedades infecciosas El clera es una enfermedad infecciosa adquirida al beber agua contaminada con la bacteria Vibrio cholerae. El vibrio crece en las vsceras, pero no se dispersan hacia otras partes del cuerpo. En cuestin de horas, los pacientes se enferman con diarrea, con la expulsin de fluido acuoso de hasta 20 litros al da. Este flujo masivo de agua del cuerpo hacia las vsceras hace que los tejidos se deshidraten y que la sangre se vuelva gruesa y viscosa, por lo que el paciente puede morir en cuestin de das.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 3

Esta terrible enfermedad estuvo inicialmente restringido a Asia hasta el siglo 19, cuando se disemin hacia Europa, Estados Unidos y parte de Suramrcia. Aunque actualmente la enfermedad puede tratarse fcilmente y es poco probable que se disemine, el clera se desarrolla rpidamente en los lugares donde la salubridad es mala y el agua potable se encuentre contaminada. Aunque el clera es solamente una de varias enfermedades diarricas, s causa la prdida de fluido ms severa y es responsable de muchas enfermedades y muerte en las reas donde es endmica, tales como India y Pakistn. Se pensaba que la bacteria causaba dao anatmico considerable al tejido epitelial intestinal, pero al parecer, no es el caso. El vibrios coloniza y se adhiere a la pared del intestino delgado, y luego segrega una exotoxina proteica llamada colergeno. sta altera el metabolismo de las clulas mucosas. La accin del colergeno es similar a la de una hormona, y la toxina afectar el metabolismo de otros tejidos si puede tener acceso a ellos. En las clulas grasas estimular liplisis, y en las clulas hepticas, la glucogenlisis. Sin embargo, en la clera clnica, solamente se ve afectado el intestino. La toxina del clera es una molcula formada por dos partes, las subunidades A y B. La subunidad B se une fuertemente a un receptor lipdico complejo y especfico en la membrana celular. La subunidad A, que es la responsable de la toxicidad celular, logra entrar a la clula, donde puede actuar sin la presencia de la subunidad B. La subunidad A activa la enzima llamada adenil ciclasa, la cual se encuentra unida a la parte interna de la membrana celular. La adenil ciclasa influencia la regulacin del metabolismo celular y ciertas hormonas tales como el glucagn y la adrenalina, actan a travs de ella. Al activarse, la enzima cataliza la produccin de AMP cclico (AMPc) a partir de ATP. A su vez, el AMPc es una molcula pequea cuya concentracin afecta la velocidad de los procesos metablicos. En el epitelio intestinal, la estimulacin de la adenil ciclasa resulta en la secrecin activa de iones cloruro desde la mucosa, acompaada por una secrecin pasiva de agua, causando diarrea. El proceso se ilustra en la Figura 1-2.

Figura 1-2. El efecto de la toxina del clera en la mucosa intestinal


Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 4

El tratamiento para la clera es relativamente simple. La prdida de fluido puede sobreponerse por medio de infusin intravenosa de agua y sales, mientras que la infeccin se ataca con antibiticos. Se estn considerando formas alternas de tratamiento para esta enfermedad, incluyendo el desarrollo de una vacuna oral, dirigida a la subunidad B de la toxina. e. Diagnstico Molecular: Pasado, Presente y Futuro1 i. Introduccin Se refiere al diagnstico molecular, o basado en cidos nucleicos, como la deteccin de una de varias mutaciones patognicas en muestras de ADN o ARN para facilitar la deteccin, el diagnstico, la subclasificacin, la prognosis y el monitoreo de la respuesta a la terapia. El diagnstico molecular combina la informacin de laboratorio con el conocimiento y la tecnologa de la gentica molecular, y ha revolucionado enormemente durante las ltimas dcadas, beneficindose de los descubrimientos en el campo de la biologa molecular (Ver Tabla 1). La identificacin y la caracterizacin fina de la base gentica de la enfermedad en cuestin es vital para lograr el diagnstico preciso. El descubrimiento de genes provee visin invaluable hacia los mecanismos de la enfermedad, as como marcadores genticos que permiten a los mdicos no solamente evaluar la predisposicin a la enfermedad, sino tambin a disear e implementar mtodos mejorados para el diagnstico. Esto ltimo es de gran importancia, ya que la pltora y variedad de defectos moleculares demandan el uso de una plataforma de deteccin de mltiples mutaciones, en contraste con una sola. El diagnstico molecular es actualmente una realidad clnica con sus races profundas en el estudio bsico de expresin gnica y funcin. ii. Historia del diagnstico molecular: inventando la rueda En 1949, Pauling y sus colegas introdujeron el trmino enfermedad molecular en el vocabulario mdico, basndose en su descubrimiento del hecho que un nico cambio de aminocido en la cadena -globina conduce a la anemia falciforme, caracterizada principalmente por episodios recurrentes de dolor agudo debido a oclusin de vasos sanguneos. En principio, sus hallazgos colocaron los fundamentos del diagnstico molecular, aunque la gran revolucin se dio muchos aos despus. En ese tiempo, cuando la biologa molecular apenas se expanda, la provisin de los servicios de diagnstico molecular era inconcebible y tcnicamente no factible. Las primeras semillas del diagnstico molecular se dieron en los primeros das de la tecnologa de ADN recombinante, con muchos cientficos de varias disciplinas trabajando en conjunto. La clonacin y secuenciacin del ADN copia eran, en ese momento, herramientas invaluables para proveer el conocimiento bsico en la secuencia primaria de varios genes. Esto ltimo provea un nmero de sondas de ADN, permitiendo el anlisis de regiones genmicas por medio de Southern Blot, llevando al concepto y aplicacin del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restriccin (RFLPs, por sus siglas en ingls) para hallar un alelo mutante de padres heterocigticos en un embarazo de algo riesgo. En 1976, Kan y colaboradores llevaron a cabo, por primera vez, el diagnstico prenatal de -talasemia, usando hibridacin del ADN
1

Tomado de: Patrinos, G. y Ansorge W. Molecular Diagnostics: Past, Present and Future. Molecular Diagnostics. Academic Press, 2005. Pgs 1-11. Pgina 5

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

aislado de fibroblastos fetales. Adems, Kan y Dozy, en 1978, implementaron el anlisis de RFLPs para identificar los alelos de anemia falciforme de procedencia africana. Este importante avance provey un medio para establecer soluciones diagnsticas similares para la caracterizacin de otras enfermedades genticas, tales como fenilcetonuria, fibrosis qustica, etc. Tabla 1-1: Principales descubrimientos en el campo de la biologa molecular
Fecha 1949 1953 1958 1960 1969 1970 1975 1977 1983 1985 1985 1986 1988 1992 1993 1996 2001 2001 Descubrimiento Caracterizacin de la anemia falciforme como una enfermedad molecular Descubrimiento de la estructura doble hlice del ADN Aislamiento de la ADN polimerasa Primeras tcnicas de hibridacin Hibridacin in situ Descubrimiento de las enzimas de restricciones y la transcriptasa inversa Southern Blotting Secuenciacin de ADN Primera sntesis de oligonucletidos Anlisis de polimorfismo de longitudes de fragmentos de restriccin Invencin de la PCR Desarrollo de la hibridacin fluorescente in situ (FISH, por sus siglas en ingls) Descubrimiento de la ADN polimerasa termoestable optimizacin de la PCR Concepcin de la PCR tiempo real Descubrimiento de la endonucleasa especfica para estructura para anlisis de ruptura Primeras aplicaciones de microarray de ADN Primeros borradores de la secuencia del genoma humano Aplicacin de perfiles proteicos en enfermedades humanas

En ese momento, sin embargo, deba sobreponerse a un cuello de botella significativo. La identificacin de una mutacin que causaba enfermedad era posible solamente a travs de la construccin de una biblioteca de ADN genmico del individuo afectado, de forma que se clonara el alelo mutado primero y para luego determinar su secuencia de nucletidos. Nuevamente, muchas mutaciones en el gen de la globina humana fueron las primeras en ser identificadas a travs de estas investigaciones. En 1982, Orkin y sus colegas mostraron que un nmero de variaciones de secuencia estaban ligadas a mutaciones especficas del gen de globina. Este grupo de RFLPs, llamados haplotipos (tanto intergnicos como intragnicos), han provisto el primer enfoque de tamizaje para detectar la mutacin causante de la enfermedad. Aunque este enfoque permiti a los investigadores predecir cul gen de -globina tena la mutacin, facilitando enormemente el proceso de tamizaje, nadie estaba en la posicin de determinar la naturaleza exacta de la mutacin causante de la enfermedad, ya que muchas diferentes mutaciones en el gen -globina estaban asociadas a un haplotipo especfico en diferentes poblaciones (para ms informacin, ver http://globin.cse.psu.edu/hbvar). Al mismo tiempo, para proveer un atajo a la secuenciacin de ADN, se desarrollaron algunos mtodos exploratorios para identificar mutaciones especficas en ADN del paciente. Los primeros mtodos involucraron la deteccin de la no concordancia entre molculas hbridas de ADN/ADN o ARN/ADN, o de la diferenciacin de la no concordancia a travs de electroforesis en gel, segn su temperatura de fusin. Usando este mtodo sumamente largo y complicado,
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 6

se identificaron una serie de mutaciones o variaciones polimrficas de secuencia, que hacen posible el diseo de oligonucletidos sintticos cortos que se usaron como sondas especficas para alelos en Southern blots genmicos. Este diseo experimental se implement rpidamente para la deteccin de mutaciones que producen -talasemia. A pesar de grandes esfuerzos de diferentes laboratorios alrededor del mundo, el diagnstico de las enfermedades hereditarias a nivel de ADN an estaba sin mayor desarrollo y, por lo tanto, lejos de implementarse en los laboratorios clnicos para el anlisis de rutina de pacientes debido a la complejidad, el costo y el requerimiento de tiempo con la tecnologa disponible. Fue solamente despus de unos aos que el diagnstico molecular entr a su era dorada con el descubrimiento de la herramienta ms poderosa de la biologa molecular desde la clonacin y la secuenciacin: la reaccin en cadena de la polimerasa (o PCR, por sus siglas en ingls). iii. La revolucin de la PCR: obteniendo ms de menos El descubrimiento de la PCR y su rpida optimizacin usando una Taq ADN polimerasa termoestable a partir de Thermus aquaticus ha facilitado enormemente y revolucionado el diagnstico molecular. La caracterstica ms poderosa de la PCR es la gran cantidad de copias de la secuencia objetivo generado por su amplificacin exponencial (vea la Figura 1), que permite la identificacin de una mutacin conocida en menos de un da, en lugar de meses. Por otra parte, la PCR ha disminuido e incluso eliminado la necesidad de la radioactividad para el diagnstico molecular de rutina. Esto permite que el diagnstico molecular ingrese al laboratorio clnico para proveer un servicio gentico, tal como la identificacin de portadores de mutaciones conocidas en un tamizaje a la poblacin, diagnstico prenatal de enfermedades hereditarias o, en aos recientes, la identificacin de mutaciones desconocidas, en colaboracin cercana con laboratorios de investigacin. Por lo tanto, al moverse al ambiente apropiado, el laboratorio clnico, el diagnstico molecular puede brindar el servicio para el cual fue diseado originalmente. El descubrimiento de la PCR tambin ha brindado el fundamento para el diseo y desarrollo de esquemas para la deteccin de muchas mutaciones, basndose en ADN amplificado. En general, la PCR se usa ya sea para la generacin de fragmentos de ADN a analizarse, o como parte del proceso de deteccin. El primer intento fue el uso de las enzimas de restriccin o sondas de oligonucletidos inmovilizadas sobre membranas o en solucin, para detectar la variacin gentica existente, en particular, de la mutacin causante de la anemia falciforme. En los aos siguientes, se han desarrollado e implementado un creciente nmero de mtodos de detecciones de mutaciones. La eleccin del mtodo a usar con una mutacin especfica depende de varias variables, incluyendo el espectro de mutaciones de una enfermedad gentica dada (es decir, las variantes de mutaciones que causan la condicin que se quiere tamizar), la infraestructura disponible y el nmero de pruebas realizadas en el laboratorio de diagnstico, as como, ms recientemente, asuntos de propiedad intelectual. La mayora de los laboratorios de diagnstico clnico no ha invertido en infraestructura de alta tecnologa y de alto costo, debido a que los volmenes de pruebas no son suficientemente grandes para justificar la inversin del capital. Por tanto, las pruebas ms simples son an la opcin disponible en muchos laboratorios clnicos, especialmente si brindan la informacin requerida con buena exactitud. Aunque la PCR ha facilitado significativamente la expansin del diagnstico molecular, an cuenta con algunas limitaciones. Por lo tanto, es necesario enfatizar que a pesar de la existencia de tantas metodologas para deteccin de mutaciones, la secuenciacin de ADN
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 7

sigue considerndose el estndar de oro y la metodologa experimental definitiva para la deteccin de mutaciones. Sin embargo, el costo de la inversin inicial y las dificultadas para la estandarizacin e interpretacin de resultados ambiguos ha restringido su uso a los laboratorios de investigacin bsica. iv. Diagnstico molecular en la era post genmica Con el anuncio del primer borrador de la secuencia del genoma humano en febrero del 2001, y con la secuenciacin posterior del genoma de otros organismos, la biologa molecular ha ingresado a una nueva era con oportunidades y retos sin precedentes. Estos desarrollos tremendos ponen presin a una variedad de disciplinas para intensificar su esfuerzos de investigacin para mejorar enormemente los mtodos existentes para la deteccin de mutaciones, para hacer disponibles los grupos de datos de variaciones genticas y analizar estos grupos con software especializado, para estandarizar y comercializar pruebas genticas para diagnstico de rutina, y para mejorar la tecnologa existente para proveer instrumentos automatizados de punta de lanza para anlisis genticos en altos volmenes. El mayor reto de todos, despus de la publicacin del primero borrador del genoma humano, era mejorar las tecnologas existentes para deteccin de mutaciones, para lograr anlisis de variaciones genticas robustas, costo-efectivas, rpidas y en volmenes altos. En los ltimos aos, la tecnologa ha mejorado rpidamente y se han hecho disponibles nuevas tcnicas de deteccin de mutaciones, mientras que las metodologas antiguas han evolucionado para satisfacer la creciente demanda de tamizajes automatizados para altos volmenes. El uso de la PCR en el diagnstico molecular se considera el estndar de oro para deteccin de cidos nuclicos y se ha convertido en una herramienta vital en el laboratorio de investigacin. La PCR tiempo real ha engendrado mayor aceptacin debido a su mayor rapidez, sensibilidad y reproducibilidad. El mtodo permite la deteccin directa del producto de PCR durante la fase exponencial de la reaccin, combinando la amplificacin y la deteccin en un solo paso. La mayor rapidez de la PCR tiempo real se debe mayormente a la reduccin de ciclos necesarios, eliminacin de los pasos de deteccin post PCR, y el uso de fluorocromos y mtodos sensibles de deteccin de sus emisiones. Por tanto, la PCR tiempo real es una metodologa muy exacta y sensible con una variedad de aplicaciones en el diagnstico molecular, permitiendo altos volmenes, y pude automatizarse fcilmente, adems de realizarse en pequeos volmenes, lo cual lo convierte en el mtodo de eleccin para muchos laboratorios de diagnstico modernos. v. Aplicaciones clnicas del diagnstico molecular en la actualidad2 Los mtodos del laboratorio clnico tradicionalmente han provisto la informacin necesaria para el diagnstico preciso y especfico de alguna enfermedad. El anlisis de los cidos nucleicos tiene el potencial de expandir el rol del laboratorio ms all del diagnstico para incluir ensayos clave que guen la terapia y brinden informacin de prognstico. En la mayora de los casos, la aplicacin de las tcnicas moleculares requiere una sospecha clnica bien cimentada de alguna enfermedad o condicin especfica. No se ha acostumbrado usar esta tecnologa en pruebas de tamizaje. Por lo tanto, esta nueva tecnologa, lejos de desplazar a las metodologas estndar de laboratorio, las complementan, suplementan y mejoran. Los siguientes prrafos
2

Tomado de: Unger, E., M. Piper y B. Border. 2001. Nucleic Acid Techniques Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 5a Ed. EUA. WB Saunders Company. Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 8

incluyen ejemplos de algunas aplicaciones actuales en el diagnstico por anlisis de cidos nucleicos en las reas de enfermedades infecciosas, malignidades hematolgicas, tumores slidos, enfermedades genticas y pruebas de identificacin. Enfermedades infecciosas El enfoque tradicional para la deteccin y el diagnstico de un agente infeccioso ha sido el uso de tinciones adecuadas y visualizacin directa, cultivo y aislamiento, o la deteccin de los anticuerpos del husped. Sin embargo, muchos organismos no se identifican fcilmente por tincin, su cultivo es laborioso y requiere largos perodos de incubacin, y algunos organismos requieren medios de cultivos de muy alto costo o sencillamente no pueden cultivarse. El medir la respuesta de anticuerpos del husped puede no brindar suficiente informacin durante la fase aguda de la infeccin o puede no distinguir entre infecciones pasadas y presentes. Las sondas de cidos nucleicos tienen el potencial de detectar la informacin gentica de un patgeno en una muestra. La viabilidad del patgeno y el transporte de la muestra, en cuanto a tiempo y condiciones, pueden no ser asuntos ya tan importantes debido a que los cidos nucleicos son un objetivo relativamente estable. En teora, las sondas tambin pueden disearse para detectar genes de resistencia antibitica. Debido al actual alto costo de reactivos, equipo y del personal capacitado, los ensayos moleculares para agentes infecciosos se han enfocado principalmente a aquellos organismos que de otro modo han sido difciles de identificar dentro del cuadro y el marco de tiempo clnico adecuados. Cnceres La aplicacin de la biologa molecular al estudio del cncer ha llevado al concepto de cncer como una enfermedad gentica de las clulas somticas. La caracterizacin de los genes involucrados en el proceso de varios pasos de la transformacin a la malignidad ha identificado dos categoras amplias de tales genes: aquellos que actan para inducir formacin de tumores (oncogenes) y aquellos que actan para inhibir la formacin de genes (genes supresores de tumores). El descubrimiento de los genes llevados por los retrovirus capaces de conferir propiedades de malignidad a la clula infectada llev al concepto de los oncogenes, esto es, genes capaces de producir cncer. Este descubrimiento prob ser una visin demasiado simplista, ya que una mayor investigacin de la naturaleza de estos genes demostr que ciertos genes de relacin cercana a los oncogenes (proto-oncogenes u oncogenes celulares) son constituyentes normales de la clula involucrados en la fisiologa normal de crecimiento, proliferacin y diferenciacin celular. La conversin de un proto-oncogen a un oncogen se conoce como la activacin del oncogen, y puede resultar de una mutacin puntual, alterando la estabilidad o la actividad del producto, de un aumento de la expresin secundaria a la amplificacin del gen, o de una traslocacin que coloca al gen bajo el control de un promotor anormal. Los oncogenes actan mayormente a travs de la adicin al producto anormal. Los genes supresores de tumores son oncognicos a travs de la prdida de la funcin especfica del gen. Estos genes aparentemente estn involucrados en el control de la divisin y crecimiento celular.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 9

El cncer hereditario y los sndromes de cncer familiar son cnceres asociados con alteraciones en la lnea germinal en uno o ms genes. Las mutaciones asociadas con varios de estos cnceres han sido identificados y clonados, incluyendo retinoblastoma hereditario (RB), cncer medular tiroideo (RET), cncer de seno / ovario (BRCA1 y BRCA2) y cncer colorectal (APC, MSH2 y MLH1). Con la excepcin de las mutaciones en BRCA, los mismos genes frecuentemente se encuentran alterados en cnceres espordicos de los mismos lugres, dando luz a los mltiples pasos involucrados en la carcinognesis. La identificacin de los genes asociados con los sndromes hereditarios de cnceres trae la pregunta el rol adecuado de las pruebas genticas para estos genes. En los sndromes hereditarios de cncer colorectal, la genotipificacin presintomtica de los miembros en riesgo de una familia pueden alterar las recomendaciones clnicas del monitoreo. La situacin de las mutaciones para BRCA es ms difcil debido al gran nmero de alteraciones descritas, el valor predictivo desconocido de cada mutacin sobre el riesgo de desarrollar cncer durante la vida (con variabilidad en la penetracin y el potencial de polimorfismos), y la falta de mtodos efectivos de intervencin. Se requiere de mayores estudios para guiar el uso clnico apropiado de las pruebas moleculares en los sndromes hereditarios de cncer. Las leucemias y linfomas son malignidades en las clulas hematopoyticas. Convencionalmente, se diagnostican basndose en la morfologa celular y en protenas de superficie celular. Las malignidades mieloides y linfoides generalmente exhiben marcadores de superficie que corresponden a una etapa de desarrollo normal. El uso de anticuerpos monoclonales y la citometra de flujo generalmente pueden caracterizar las poblaciones malignas de acuerdo a la combinacin de los marcadores presentes en la superficie celular (inmunofenotipificacin). Esta informacin es muy til para conocer el estado, la prognosis y el tratamiento. Sin embargo, en algunos casos los marcadores de superficie no se expresan o la poblacin anormal es demasiado pequea para detectarse.Los ensayos de hibridacin de cidos nucleicos complementan los ensayos convencionales para proveer de informacin adicional sobre linaje de clulas, clonalidad, caracterizacin molecular de cambios citogenticos y deteccin de enfermedad residual mnima. El rearreglo fsico del ADN es caracterstico del desarrollo normal de los linfocitos T y B. Estos rearreglos se dan en los genes que codifican las inmunoglobulinas y otros receptores de superficie que funcionan a travs de antgenos. Usando sondas especficas para ciertas regiones particulares que codifican cada protena receptora, y usando una batera de enzimas de restriccin, es posible la visualizacin de los tamaos caractersticos de los fragmentos de ADN de la lnea germinal (no linfioide) y de la configuracin del gen del receptor rearreglado (linfoide) a travs del anlisis Southern blot de sangre perifrica. Es posible determinar si una poblacin clonal especfica constituye 1 a 5% de la poblacin. Las traslocaciones son el resultado de ruptura y reparacin anormal de grandes porciones de los cromosomas. Algunas traslocaciones, al igual que otras anormalidades cromosmicas considerables que son detectables por anlisis citogentico, se asocian con malignidades hematolgicas particulares. Estos cambios citogenticos pueden usarse para clasificar una enfermedad y determinar prognosis.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 10

Los mismos mtodos moleculares que ayudan a llegar a un diagnstico de leucemia y linfoma pueden usarse en el monitoreo de la respuesta a terapia y la deteccin de enfermedad persistente o recurrente posterior a la terapia. Debido a la alta sensibilidad de los mtodos de amplificacin, la firma molecular del clon maligno puede detectase en muestras normales por morfologa convencional o por anlisis inmunoqumico o citogentico. Actualmente, se encuentran en realizacin ensayos clnicos que ayudarn a determinar la significancia clnica de la presencia de las clulas anormales en la enfermedad residual mnima, esperando que la deteccin temprana de fallas en terapia pueda proveer una oportunidad para realizar terapia ms efectiva. Los tumores slidos tienen una mirada de alteraciones somticas, y se est realizando una gran cantidad de investigacin hacia la determinacin de cules cambios tienen importancia diagnstica y prognstica. Aunque existe la tecnologa para la determinacin de traslocaciones, mutaciones, deleciones, amplificaciones y otros cambios en estos oncogenes, esta informacin es clnicamente til si puede usarse para modificar el tratamiento (esto es, predecir el desarrollo) o contribuir al diagnstico. Los mtodos morfolgicos sin duda se mantendrn en el rol central en diagnstico de tumores slidos, pero los mtodos moleculares pueden usarse cada vez ms para brindar ms informacin en guiar el tratamiento. Esta tendencia se evidencia en la situacin de cncer de seno, en donde las amplificaciones Her2/neu tienen significado pronstico y definen terapia. Adems, las alteraciones genticas especficamente asociados con los tumores pueden usarse como marcadores moleculares para la deteccin temprana de la enfermedad. Estas aplicaciones an estn en desarrollo, pero sus principios estn ganando aceptacin. Enfermedades genticas Las mutaciones genticas, o cambios en secuencia de ADN que resultan en la sntesis de una protena no funcional o disfuncional, o que altera la regulacin o la expresin de una protena, pueden causar enfermedad. Las mutaciones pueden agruparse en las siguientes categoras principales: Mutaciones puntuales Inserciones o deleciones con o sin cambios en el marco de lectura Expansin inestable de repeticiones de trinucletidos Traslocaciones

Un requerimiento esencial para el anlisis en busca de enfermedades genticas es el conocimiento del cromosoma, gen y mutacin especfica que causa la enfermedad. El anlisis directo incluye aquellos procedimientos que detectan directamente la mutacin que se conoce es responsable de la enfermedad especfica. Pueden mencionarse como ejemplos de estos ensayos el anlisis por medio de la hibridacin de la muestra del paciente usando sondas especficas para determinar la presencia de una secuencia anormal en el ADN del paciente. Es posible que se requiera buscar dentro del gen especfico una de varias posibles mutaciones que se sabe causan la enfermedad especfica. Si no se conoce las mutaciones o las secuencias asociadas a una enfermedad en un gen especfico, podra evaluarse el uso de anlisis indirecto, involucrando la
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 11

secuenciacin del ADN del paciente y comparndola con la secuencia del ADN de sus padres y hermanos no afectados. Las aplicaciones de las pruebas genticas pueden dividirse en cuatro clases bsicas. Las pruebas de portadores sanos involucran la deteccin de mutaciones recesivas en individuos sanos que pueden tener riesgo de transmitir las mutaciones a su progenie, y generalmente se realiza como parte de la consejera gentica. Adems, este tipo de anlisis puede realizarse a nivel de poblacin, no necesariamente con historia familiar de enfermedad, pero que por su etnicidad puede estar en riesgo de alguna enfermedad especfica. Las pruebas genticas diagnsticas se realizan en individuos con sntomas que son suficientes como para sospechar de una enfermedad especfica. Este tipo de prueba tiene la ventaja de permitir el diagnstico temprano o en casos con presentaciones clnicas no clsicas, aunque tambin puede realizarse post mortem, como en el caso de muerte infantil sbita. Las pruebas prenatales, o detecciones in utero se realiza para identificar un feto afectado con la posibilidad de terminacin del embarazo. El tipo ms controversial de prueba gentica se refiere como prueba presintomtica. Estas pruebas se utilizan para ayudar a los hijos de individuos con desrdenes dominantes de aparicin tarda a determinar su probabilidad de heredar la enfermedad asociada a mutaciones. Los resultados obtenidos de estas pruebas se usan para tomar decisiones informadas sobre reproduccin, iniciacin de medidas preventivas o simplemente para prepararse para el futuro. Pruebas de identificacin Las tcnicas de cidos nucleicos pueden ayudar a determinar la relacin entre individuos o entre muestras y un individuo. En el caso de trasplantes, el objetivo es coincidir un donante y un receptor de un rgano especfico en su fenotipo HLA (antgeno leucocitario humano, por sus siglas en ingls) lo ms posible, para disminuir lo ms posible las probabilidades de un rechazo del tejido trasplantado. El complejo de histocompatilibilidad se encuentra en el cromosoma 6p en el humano y contiene la regin HLA, la cual est subdividida en tres clases de genes polimrficos, dos de los cuales son importantes en la tipificacin de los tejidos. Es posible realizar anlisis genticos de estas regiones, que incluye anlisis de restriccin, e incluso secuenciacin, para poder determinar la compatibilidad entre el donante y el receptor del rgano, reduciendo as las probabilidades de rechazo del rgano. Otros tipos de ADN polimrfico tambin se usan actualmente de rutina para pruebas de identificacin humana y determinacin de relacin entre personas. Para ello, se utilizan regiones especficas del ADN, llamadas microsatlites o STRs (repeticiones de secuencias cortas consecutivas, por sus siglas en ingls), tomando en cuenta que se hereda la mitad de la informacin de la madre y la mitad del padre. Para ello, se utilizan las ventajas de la reaccin PCR realizada en mltiples segmentos a la vez, y luego se separan para verificar el tamao (o repeticiones) que se encuentra en estos segmentos. Posteriormente, se analizan los resultados para verificar si existe alguna relacin entre las personas.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 12

2. Dogma Central de la Biologa Molecular: estructura y funcin de cidos nucleicos y de protenas Una de las caractersticas sorprendentes de la vida es la habilidad de reproducirse. La informacin que hace que cada individuo sea nico debe preservarse y luego pasarse a la progenie. Todo tipo de vida en la tierra usa los cidos nucleicos para el almacenamiento de la informacin gentica. Con la excepcin algunos virus, la biomolcula utilizada para el almacenamiento de la informacin gentica es el cido desoxirribonucleico (ADN). Esta molcula es adecuada debido a su gran estabilidad qumica y su habilidad para codificar una gran cantidad de informacin usando un cdigo basado en cuatro letras nicamente. (a)

(b)

Figura 2-1 El dogma central de la biologa molecular en su forma (a) original, y en su forma (b) modificada. A pesar de su importancia, el ADN es solamente una parte de la arquitectura central de la vida. Con roles igualmente importantes, el cido ribonucleico (ARN) y las protenas completan el esquema. La interrelacin entre estas tres biomolculas se conoce como el dogma central de la biologa molecular, el cual establece que la informacin gentica guardada en el ADN se transcribe en unidades transportables de ARN mensajero, y que cada ARN mensajero contiene las instrucciones necesarias para la sntesis de una protena en particular (o un grupo pequeo de protenas particulares). Estas molculas se encuentran presentes en todas las clulas. El mecanismo por el cual la informacin del ADN se lleva hasta la formacin de protenas se conoce bastante bien en la actualidad. El dogma central original se resume en la Figura 2-1a, mientras que el actual se describe en la Figura 2-1b. a. Protenas Las protenas son las biomolculas ms verstiles, llevando a cabo funciones cruciales en virtualmente todos los procesos biolgicos. Catalizan reacciones; almacenan y transportan otras molculas, tales como oxgeno; proveen apoyo mecnico y proteccin inmunolgica; generan movimiento; transmiten impulsos nerviosos y controlan el crecimiento y la diferenciacin. Varias propiedades clave de las protenas las hacen ideales para cumplir con todas estas funciones. Las protenas son polmeros lineales de monmeros llamados protenas. La construccin de una amplia variedad de biomolculas a partir de un nmero limitado de monmeros es un
Pgina 13

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

diseo recurrente en los seres vivos. La funcin de una protena depende directamente de su estructura tridimensional. Sorprendentemente, las protenas se doblan espontneamente a sus estructuras tridimensionales dictadas por la secuencia de los aminocidos en el polmero. Las protenas contienen un amplio rango de grupos funcionales. Estos grupos funcionales incluyen alcoholes, tioles, tioteres, cidos carboxlicos, carboxamidas, y una variedad de grupos bsicos. Cuando se combinan en varias secuencias, esta gama de grupos funcionales causan la gran variacin de funciones de las protenas. Las protenas pueden interactuar unas con otras y con otras macromolculas biolgicas para formar ensamblajes complejos. Las protenas dentro de estos ensamblajes pueden actuar de forma sinrgica para generar capacidades que las protenas individuales no poseen. Este tipo de ensamblajes incluyen la maquinaria macromolecular que lleva a cabo la replicacin de ADN, la transmisin de seales dentro de la clula y muchos otros procesos. Algunas protenas son rgidas, mientras que otras muestran flexibilidad. Las unidades rgidas pueden funcionar como elementos estructurales en el citoesqueleto o en el tejido conectivo. Ciertas partes con flexibilidad limitada en una protena pueden funcionar como bisagras, resortes y palancas para lograr la funcin de la protena que las contiene.

Las protenas estn formadas por la unin secuencial de molculas llamadas aminocidos. Los aminocidos involucrados, llamados especficamente -aminocidos consisten de un carbono central, al cual se une un tomo de hidrgeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R lateral que lo identifica. Los aminocidos en solucin a pH neutro se dan predominantemente como iones dipolares, conocidos como zwitteriones, en los cuales tanto el grupo carboxilo como el amino se encuentran en su forma cargada (negativa y positiva, respectivamente).

Figura 3-2 La estructura de un aminocido. El grupo R se refiere a la cadena lateral, que identifica al aminocido. Es posible encontrar veinte diferentes cadenas laterales R en los aminocidos que forman las protenas. Estas cadenas R tienen diferentes caractersticas en tamao, forma, carga, capacidad de formacin de puentes de hidrgeno, carcter hidrofbico o hidroflico y reactividad qumica. De hecho, se encuentran estos mismos veinte grupos en todos los seres vivos, desde los ms sencillos hasta los ms complejos. El sorprendente amplio rango de funciones que llevan a cabo las protenas se debe principalmente a la diversidad y versatilidad de estos 20 aminocidos. Una mirada ms cercana a los aminocidos revelan el origen de su diversidad (Ver Figura 2-3). Los aminocidos generalmente se designa por una abreviacin de tres letras o un smbolo de una sola letra. stos se muestran en la Figura 2-4.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 14

Figura 2-3. Estructura de los 20 aminocidos de ocurrencia natural. Los veinte aminocidos generalmente se clasifican segn la naturaleza de su grupo lateral R.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 15

Figura 2-4. Abreviaturas para los aminocidos. i. Estructura primaria de las protenas Las protenas son polmeros lineales formados por la union de un grupo -carbonilo de un aminocido al grupo -amino de otro aminocido, formando un enlace peptdico. Varios aminocidos unidos a travs de enlaces peptdicos forman una cadena polipptica, y cada aminocido que la forma se denomina residuo.

Figura 2-5. Formacin de un enlace peptdico. La formacin del enlace peptdico se da por la unin de un extremo carboxi de un aminocido con el extremo amino del siguiente aminocido en la protena.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 16

Las cadenas polippticas tienen un sentido, ya que sus dos extremos son distintos. En un extremo posee un grupo amino sin reaccionar, y en el otro extremo posee el grupo carboxilo sin reaccionar. Por convencin, el inicio de una cadena polipeptdica se toma desde el grupo amino terminal, y termina en el grupo carboxilo terminal.

Figura 2-6. Sentido de una cadena polipeptdica. Las cadenas polipeptdicas poseen un sentido, desde el amino terminal al carboxilo terminal. La mayora de cadenas polipeptdicas contienen entre 50 y 2000 aminocidos, y se refieren comnmente como protenas. Los pptidos formados de un pequeo nmero de aminocidos se conocen como pptidos. En algunas protenas, existen uniones cruzadas entre distintas regiones de la misma cadena. Las ms comunes y ms importantes, aunque no las nicas, son los puentes disulfuro que se dan por oxidacin de una pareja de residuos de cistena.

Figura 2-7. Puente disulfuro Esquema de la formacin de un puente disulfuro a partir de dos cistenas. El puente disulfuro es la nica unin covalente entre aminocidos adicional al peptdico.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 17

La primera protena de la cual se conoci su secuencia de aminocidos fue la insulina, una hormona proteica, dilucidada por Frederick Sanger, en 1953. Esto demostr por primera vez que una protena posee una secuencia definida de aminocidos. Actualmente se conoce la secuencia de aminocidos de ms de 100,000 protenas, demostrndose que cada una es nica y precisa. Esta secuencia se conoce como estructura primaria. La estructura primaria determina la estructura tridimensional de las protenas, siendo la conexin entre la secuencia de bases nitrogenadas en un gen y la funcin de la protena. Es bien conocido en la actualidad que una falla en el orden de los aminocidos de una protena, lo cual afecta su estructura tridimensional, tiene profundos efectos en su funcin dentro del organismo y, usualmente, dando origen a una enfermedad, que podra ser seria o incluso fatal. ii. Estructura secundaria de las protenas Una cadena polipeptdica puede tomar formas tridimensionales especficas. Dos de estas formas fueron propuestas por Linus Pauling y Robert Corey, en 1951: la alfa hlice ( -hlice) y la hoja beta (hoja ). Posteriormente se han ido descubriendo otras estructuras menos regulares pero igualmente importantes, tales como las vueltas beta y omega (vuelta y vuelta ). La hlice es una estructura cilndrica, formada por la unin de puentes hidrgeno entre la columna vertebral de una cadena polipeptdica, formada por los enlaces peptdicos. Las cadenas laterales (grupos R) de los aminocidos quedan hacia afuera de esta estructura. Casi todas las hlices que se encuentran en la naturaleza tienen sentido a la derecha, y se representan grficamente en forma de lazos o cilindros. Una protena puede tener desde nada hasta casi el 100% de su estructura en forma de hlice.

Figura 2-8. (A) Figura de lazo representando las cadenas laterales como esferas verdes. (B) Vista lateral de un modelo de una hlice, representando los puentes de hidrgeno entre los grupos NH y CO. (C) Vista del extremo de la columna vertebral dentro de la hlice, con los grupos laterales (verdes) hacia fuera. (D) Un modelo tridimensional de la figura C muestra el poco espacio dentro de la hlice.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 18

La otra estructura que Pauling y Corey dilucidaron fue la hoja plegada . La denominacin se debe nicamente al hecho de ser la segunda estructura que descubrieron, despus de la hlice. La cadena polipeptdica en la hoja se encuentra totalmente desplegada, y no enrollada como en la hlice . En estas cadenas, los grupos laterales, o R, de los aminocidos adyacentes se dirigen a lados contrarios. La hoja se forma cuando varias secciones de la hebra se unen de forma paralela o antiparalela por medio de puentes de hidrgeno, formados entre el O del grupo carboxilo y el H del grupo amino de la cadena principal. La direccin de una hebra se dibuja como una flecha ancha apuntando hacia el extremo carboxilo.

Figura 2-9. Formacin de hojas-. Formaciones diversas de las hojas .


Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 19

Las hojas pueden ser relativamente planas, paralelas o antiparalelas, aunque la mayora suele tomar una forma tridimensional con cierto giro. La hoja es un elemento estructural importante en muchas protenas, tales como protenas que se unen a cidos grasos.

Figura 2-10. Hojas como elemento estructural en las protenas. Pueden representarse por modelos moleculares (a), o por medio de flechas que indican la direccionalidad de la hebra polipeptdica: (b) vista frontal, (c) vista lateral. La mayora de protenas poseen formas compactas, globulares, que requieren varias idas y vueltas de sus cadenas polipeptdicas. Para lograr estas idas y vueltas, existen varias estructuras tpicas llamadas vueltas . La distribucin de las hlices, de las hojas y de las vueltas sobre una cadena polipeptdica se refiere usualmente como estructura secundaria.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 20

iii. Estructura terciaria de las protenas El arreglo tridimensional de las hlices, hojas , vueltas y cualquier otra estructura de la cadena polipeptdica se conoce como estructura terciaria. La primera protena que se conoci con detalle atmico fue la mioglobina, la protena encargada de almacenar oxgeno en ciertas partes del cuerpo. Alrededor del 70% de los 153 aminocidos se encuentran en forma de hlices a. Su capacidad de unirse al oxgeno depende de la presencia de un grupo hem, hacia el centro de la molcula. La forma como la cadena est doblada, est como en la mayora de protenas, compleja y asimtrica. Interesantemente, la parte interna de la mioglobina est formada casi completamente por residuos hidrofbicos, mientras que la externa, de residuos hidroflicos. Este diseo estructural es importante, especialmente en aquellas protenas que actan o existen dentro de un medio acuoso, o incluso las insertadas en la membrana celular.

Figura 2-11. Estructura de la mioglobina. Los residuos hidrofbicos se muestran en amarillo, los hidroflicos en azul y los dems, en blanco. iv. Estructura cuaternaria de las protenas Hasta el momento se han considerado tres niveles de estructura de las protenas. La estructura primaria se refiere a la secuencia de aminocidos en la protena; la estructura secundaria se refiere al arreglo tridimensional que toman los aminocidos respecto a sus vecinos directos, siendo dos elementos importantes la hlice y la hoja ; y la estructura terciaria se refiere al arreglo tridimensional de toda la cadena en s, tomando en cuenta residuos lejanos entre s, como en el caso de la unin con puentes disulfuro. La estructura cuaternaria se refiere en especial a aquellas protenas que poseen ms de una cadena polipeptidica, cada una de ellas llamada una subunidad. La estructura cuaternaria se refiere a la orientacin espacial de las subunidades de una protena. Aunque algunos consideran que la forma ms sencilla de la estructura cuaternaria proteica es un dmero, otros consideran que el monmero es parte de la estructura cuaternaria. El nmero de subunidades en una protena es ampliamente variable. Por ejemplo, la mioglobina humana es un monmero, la hemoglobina humana es un tetrmero (con dos pares de subunidades iguales), y la cpsula

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 21

del rinovirus es una protena compleja que consta de sesenta copias de cuatro subunidades distintas. v. Relacin estructura funcin en las protenas En ciertos experimentos de la funcin de las protenas se ha demostrado que la secuencia de aminocidos en una protena especifica su conformacin tridimensional. Esto es vital, ya que la conformacin de una protena est ntimamente relacionado con la capacidad de la misma de llevar a cabo una funcin especfica. Por ende, la informacin necesaria para la conformacin especfica de una protena funcional est contenida dentro de la secuencia de los aminocidos que posee, la cual, a su vez, est contenida en el gen que la codifica. En algunos casos especficos, existe la necesidad de la accin de protenas especficas, llamadas chaperonas. Estas protenas ayudan a la protena en formacin a doblarse sobre s misma en la forma adecuada para llevar a cabo su funcin. En esencia, es necesario recordar que para que una protena lleve a cabo su funcin de forma correcta, es vital que posea su conformacin tridimensional de forma igualmente correcta. b. cidos nuclicos Actualmente se sabe que la informacin requerida por cada organismo para su formacin y su funcionamiento se encuentra codificada en el material gentico. La mayor parte de organismos, incluyendo al ser humano, posee esta informacin en forma de cido desoxirribonucleico, ADN, aunque algunos virus poseen su informacin gentica en forma de cido ribonucleico, ARN. El ADN fue descubierto en 1869 por Johann Friedrich Miescher, un bioqumico suizo trabajando en Alemania. Miescher trabaj con extractos de leucocitos humanos, que inicialmente fueron mezclas de ADN protenas cromosmicas, pero posteriormente, al mudarse al Basel en Suiza, logr extractos de cidos nuclicos puros a partir de espermas de salmn. Las pruebas qumicas que realiz Miescher mostraron que el ADN es cido y muy rico en fsforo, y sugirieron que las molculas individuales son muy grandes, aunque no fue sino hasta alrededor de 1930 que se logr apreciar la magnitud del tamao de las molculas de ADN. Tres aos antes de este descubrimiento, Gregor Mendel public los resultados de sus famosos experimentos con plantas de arveja, que llevara a cabo en el jardn del monasterio donde viva, en la ciudad de Brno, en lo que es ahora la Repblica Checa. Como es bien sabido, Mendel estableci una hiptesis que indicaba que la herencia es controlada por factores unitarios, actualmente conocidos como genes. Es muy poco probable que Miescher y Mendel supieran uno del otro y, de haber ledo sus trabajos, es poco probable que hicieran alguna conexin entre genes y ADN. En esa poca no se conoca la funcin real del ADN, aunque se supona que fuese una reserva celular de fsforo. Por muchos aos, los genetistas pudieron realizar grandes avances basndose en los trabajos de Gregor Mendel, sin poner mucha atencin a dilucidar el material que formaba los genes. No fue sino hasta los inicios del siglo veinte en que se iniciaron los intentos por averiguar de qu estaban formados los genes. En 1903, WS Sutton se dio cuenta que los patrones de herencia seguan el comportamiento de los cromosomas durante la divisin celular. Esta observacin llev a la teora cromosmica, la cual era universalmente aceptada como cierta alrededor del ao 1930, cuando ya se saba que los cromosomas estn formados principalmente de ADN y protena, en
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 22

aproximadamente iguales cantidades. Algunos bilogos pensaron que la combinacin de ADN y protena (nucleoprotena) era el material gentico, pero otros no concordaban. En la actualidad, puede ser difcil comprender por qu en ese tiempo se tenda a favorecer las protenas como posible formador de genes. En resumen, los bioqumicos pensaban que todas las molculas de ADN eran iguales, lo cual significaba que el ADN no tena variabilidad suficiente requerida para funcionar como material gentico. No fue sino hacia el final de la dcada de 1930 que se empez a reconocer la variabilidad del ADN. A principios del siglo veinte, antes que existieran los antibiticos, un grupo de cientficos, cuyo inters era principalmente encontrar formas ms eficientes de tratar la neumona, realizaron experimentos que ayudaron a establecer la forma en que se comporta el material gentico. En aquella poca, el nico tratamiento disponible para la pneumona era la administracin temprana de un antisuero preparado al inyectarle clulas muertas de Streptococcus pneumoniae a un animal. Para mejorar la produccin de este antisuero, se estudiaron las propiedades inmunolgicas de la bacteria. Se demostr que existe un amplio rango de diferentes tipos, o cepas, de S. pneumoniae, cada una caracterizada por una mezcla especfica de azcares contenidas en la gruesa cpsula que las rodea. En 1923, Frederick Griffith, un oficial mdico britnico, descubri que, adems, existen varias cepas de S. pneumoniae que no poseen una cpsula y que no causan neumona. Esto no fue gran sorpresa, ya que en esa poca ya se conoca de ms bacterias que tenan cepas virulentas encapsuladas y cepas no virulentas no encapsuladas.

Figura 2-12. Experimento de Griffith. Este experimento demuestra que un componente de las bacterias inactivadas por calor puede transformar las bacterisa no virulentas vivas en virulentas.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 23

Sin embargo, cinco aos ms tarde, Griffith obtuvo resultados inesperados en sus estudios. Realiz un experimento en el cual prepar varias mezclas de cepas para inyectarlas en ratones de laboratorio. Tal como se esperaba, Griffith demostr que los ratones inyectados con cepas encapsuladas y virulentas de las bacterias desarrollaban neumona y moran, mientras que los ratones inyectados con cepas no encapsuladas avirulentas sobrevivan sin problema. De la misma manera, la inyeccin de una cepa virulenta inactivada por calor no causaba el desarrollo de neumona en los ratones y los mismos sobrevivan. Finalmente, sin embargo, al inyectar a los ratones una mezcla de bacterias encapsuladas virulentas inactivadas por calor con bacterias no encapsuladas no virulentas, los ratones desarrollaban neumona y moran. An ms sorprendente fue el hallazgo de bacterias virulentas encapsuladas vivas en los tejidos de los ratones muertos, que invariablemente eran exactamente la misma cepa que las bacterias virulentas inactivadas por calor que componan la mezcla originalmente administraba. De alguna forma, las bacterias no virulentas sin cpsula haban adquirido la habilidad de fabricar cpsulas y los azcares que las identifican, proceso que en ese momento se denomin transformacin. Sin embargo, no se lleg a conocer cul era el componente, el elemento transformador, que transmita la informacin. En la Universidad de Columbia, Nueva York, Oswald Avery y sus colaboradores se propusieron descubrir de qu material estaba hecho el elemento transformador. Los resultados se obtuvieron en 1944: al tratar al elemento transformador con varias enzimas, ste se vea inactivado nicamente por enzimas que degradan ADN y no por las que degradan protena o ARN.

Figura 2-13. Experimento de Avery. El elemento transformador no se ve afectado por las enzimas que degradan protena o ARN, pero s por las que degradan ADN. A pesar que los experimentos de Avery fueron meticulosos, no dieron lugar a la aceptacin general que el ADN fuese el material gentico. Muchos cientficos del momento no tenan claro que la transformacin era, de hecho, un fenmeno gentico. Otros simplemente dudaban de la veracidad del experimento, en especial sobre la especificidad de la desoxirribonucleasa usada en el experimento. Un segundo experimento fue llevado a cabo por Alfred Hershey y Martha Chase, en 1952, con propsitos distintos a determinar la composicin del material gentico. Hershey y Chase eran dos de un grupo de bilogos que estudiaban el ciclo de infeccin de los bacterifagos, un grupo de virus que infectan bacterias. Los fagos son estructuras relativamente simples formadas nicamente por ADN y protena. El ADN se encuentra dentro del fago, y est rodeado por una cpside protenica. Para replicarse, el fago debe entrar a la clula bacteriana, y dirigir a la clula para que exprese los genes contenidos en el material gentico del fago, permitiendo la sntesis de nuevas partculas virales y su posterior liberacin de la clula bacteriana, causndole la muerte. El objetivo del experimento de Hershey y Chase era determinar si la partcula completa del fago ingresaba a la bacteria infectada, o si parte de la partcula se quedaba fuera. Si solamente un componente ingresaba a la bacteria, ste debiese ser el material gentico del fago.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 24

Figura 2-14. Estructura de un bacterifago Su estrategia experimental estaba basada en el uso de marcas radiactivas. Como el ADN contiene fsforo, y ste no est presente en las protenas, el istopo radiactivo del fsforo, 32P puede usarse para marcar especficamente al ADN. Por otro lado, la protena puede marcarse especficamente usando un istopo radiactivo de azufre, 35S. De esta forma, los investigadores permitieron que algunas partculas del virus infectaran bacterias de E. coli durante unos pocos minutos, para luego colocar el cultivo en una licuadora. La idea era separar cualquier parte del fago que estuviera unida a la parte externa de la clula. Para diferenciarlas, los investigadores centrifugaron la muestra a velocidad que permitiera precipitar las bacterias y dejar en suspensin las partculas desprendidas de la superficie bacteriana. El anlisis posterior de la pastilla de precipitado revel que contena el 70% del fsforo radiactivo, mientras que solamente contena alrededor del 20% de azufre radiactivo. En un experimento paralelo, se usaron partculas virales con marcaje radiactivo para infectar clulas bacterianas, pero se dej que ocurriera todo el proceso de infeccin. Se encontr que las nuevas partculas virales tenan la mitad del fsforo radiactivo (la mitad del ADN original), pero solamente menos del 1% de protena radiactiva.

Figura 2-15. Ciclo de infeccin del bacterifago.


Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 25

Figura 2-16 Experimento Hershey-Chase Los resultados del experimento de Hershey y Chase sugirieron que el ADN era el principal componente del fago que ingresaba a la clula y, por tanto, era el principal o nico componente que se pasa de una generacin de fagos a la siguiente. Sin embargo, los investigadores fueron cautelosos al enunciar sus conclusiones, indicando que el ADN era una posibilidad como componente del material gentico, pero que no podra generalizarse, ya que el organismo que estaban estudiando no era considerado convencional, ya que muchos bilogos no lo consideran siquiera como organismo vivo. Sin embargo, la importancia de este estudio no radica en la conclusin que el ADN fuese de hecho el material gentico, sino que abra la posibilidad que el ADN pudiese ser el material gentico. Fue este hecho el que permiti que otros investigadores, como Watson y Crick, dirigieran su atencin al ADN como molcula de inters biolgica y, en especial, gentica. i. La estructura del ADN Los nombres James Watson y Francis Crick estn tan ligados al ADN que es fcil olvidar que, cuando iniciaron sus investigaciones sobre el ADN en 1951, ya se conoca la estructura detallada del polmero de ADN. Su contribucin no fue determinar la estructura de ADN en s, sino demostrar su distribucin tridimensional.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 26

El ADN es un polmero lineal, sin ramificaciones, en las que las subunidades son cuatro nucletidos (o, ms correctamente, desoxinucletidos) que pueden unirse uno tras otro en cualquier orden hasta formar cadenas de cientos, miles o incluso millones de unidades. Cada nucletido en el ADN est formado por tres componentes: Una pentosa: especficamente 2-desoxirribosa Una base nitrogenada: puede ser una citosina, una timina, una adenina o una guanina. La base se encuentra unida al carbono 1 del azcar a travs de un enlace -N-glucosdico con el nitrgeno 1 en las pirimidinas (C, T) o el nitrgeno 9 en las purinas (A, G). Un grupo fosfato: puede tener una cadena de uno, dos o tres fosfatos unida al carbono 5 del azcar. Los grupos fosfatos se designan como , y , siendo el directamente unido al azcar el .

Figura 2-17. Estructura de un desoxinucletido y las posibles bases que lo conforman. En un polinucletido, los nucletidos individuales se unen a travs de enlaces fosfodister entre los carbonos 5 y 3. Durante la reaccin de adicin nicamente se utilizan nucletidos trifosfato, por lo que se involucra la prdida de dos de los tres grupos fosfato, es decir, un pirofosfato. Note que los dos extremos del polinucletido son qumicamente distintas, ya que una de ellas posee un grupo trifosfato sin reaccionar unido a su respectivo carbono 5, (extremo 5) y el otro posee un grupo hidroxilo sin reaccionar en su carbono 3 (extremo 3). Esto le da una direccin a la molcula, la cual afecta en especial las reacciones de sntesis, las cuales nicamente pueden llevarse a cabo en una direccin (53) y no en la contraria (35). Por ende, la replicacin de ADN conlleva una complicacin que se ver en detalle ms adelante.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 27

Figura 2-18. Estructura detallada de un polinucletido y la reaccin de adicin en el extremo 3. ii. La estructura del ARN Al igual que el ADN, el ARN tambin es un polmero, pero con dos diferencias importantes. En primer lugar, el azcar en el nucletido de ARN es ribosa, y segundo, en lugar de timina, la opcin en base nitrogenada es uracilo. El ARN tambin posee enlaces fosfodister, pero son un tanto menos estables que los del ADN. Sin embargo, las funciones del ARN no requieren que los polinucletidos sean mayores de unos cuantos miles de nucletidos en longitud. Al igual que el ADN, el ARN tambin tiene direccionalidad en sus molculas.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 28

Figura 2-19. Estructura del ARN iii. La doble hlice Segn el libro La doble hlice, escrito por James Watson, su trabajo con Francis Crick fue una carrera desesperada contra Linus Pauling, el famoso bioqumico americano, quien errneamente propuso un modelo de triple hlice para el ADN, dndole tiempo para que Watson y Crick tomaran la delantera. Actualmente es difcil separar los hechos de la ficcin, pero es de todos conocido y aceptado que el modelo de doble hlice, propuesto por Watson in Crick en 1953 fue el descubrimiento biolgico ms importante del siglo veinte. Para establecer el modelo de la doble hlice, Watson y Crick usaron cuatro tipos de informacin: Datos biofsicos de varios tipos, incluyendo la cantidad de agua contenida dentro del ADN. Patrones de difraccin de rayos S, la mayora producidos por Rosalind Franklin, que revel la naturaleza helicoidal de la molcula, brindando algunas dimensiones importantes dentro de la hlice. La relacin entre las bases, descubiertas por Erwin Chargaff, que demostr que en varias fuentes distintas de ADN, se mantena la relacin de 1:1 entre adenina y timina, al igual que entre guanina y citosina. En este hecho se basaron las reglas de apareamiento de bases que se dan en la doble hlice. Construccin de modelos, que fue la nica tcnica importante que Watson y Crick usaron de ellos mismos. El modelo a escala permiti el posicionamiento relativo de los tomos, para verificar que fueran posibles y lgicos

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 29

Figura 2-20. (A) dos representaciones de la doble hlice y (B) forma en que se unen las bases complementarias. Note que las hebras son antiparalelas, indicando que una hebra va en una direccin, mientras que la complementaria va en la direccin opuesta. La doble hlice tiene varias caractersticas que le permiten ser una molcula de gran estabilidad. La ms importante, por supuesto, es el apareamiento de bases. Este acoplamiento de bases involucra la formacin de puentes de hidrgeno entre la adenina en una hebra y la timina en la otra, o entre la citosina en una hebra y la guanina en la otra. Los puentes de hidrgeno son atracciones electrostticas dbiles entre un tomo electronegativo (como nitrgeno u oxgeno), y un hidrgeno unido a otro tomo electronegativo. Los puentes de hidrgeno son ms dbiles y largos que los enlaces covalentes, aunque son las
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 30

interacciones no covalentes ms fuertes. El apareamiento de las bases AT y CG explican las relaciones halladas por Chargaff, adems de ser las nicas permitidas por su estructura tridimensional y su posicin relativa dentro de la doble hlice para formar puentes de hidrgeno, adems que para caber dentro de la hlice, la pareja siempre debe ser entre una purina y una pirimidina. Por su parte, el ARN tambin puede formar pares de bases, AU y CG. Adems, el ARN puede formar pares de bases con otra molcula de ARN o con una molcula de ADN, pero la forma predominante de pareamiento de bases dentro del ARN es intramolecular. Esto es de especial importancia dentro del ARN ribosomal y el ARN de transferencia.

Unidades de medida del ADN


Dado que el ADN es de doble hlice, la longitud de una molcula se expresa en tantas pares de bases. (bp). Un kilo par de bases (kb) es 103 bp y una mega par de bases (Mb) es 106 bp. Un giga par de bases (Gb) es 109 bp. En resumen: 1 kb = 1000 bp 1 Mb = 1000 kb = 1 000 000 bp 1 Gb = 1000 Mb = 1 000 000 kb = 1 000 000 000 bp Las longitudes de las molculas de ARN no se pueden expresar de la misma forma, ya que la mayora de molculas de ARN son de una sola hebra. Es por ello que se expresa la longitud de ARN en tantas pares de bases.

c. Descripcin del dogma central de la biologa molecular El dogma central de la biologa molecular, establece que la informacin gentica codificada dentro del ADN se transcribe a unidades transportables y manejables, compuestas de ARN mensajero. Cada una de estas unidades contiene la informacin para la sntesis de una protena en particular (o un pequeo nmero de ellas). Sin embargo, el flujo en una sola direccin propuesta por este dogma, es decir, ADNARNProtena, no refleja el rol de las protenas en la facilitacin del flujo de la informacin. Podra representarse la relacin entre las molculas de la siguiente forma, tomando en cuenta que las protenas catalizan la sntesis tanto del ADN como del ARN (deben involucrarse enzimas especficas). replicacin transcripcin traduccin

Accin de protenas especficas en procesos especficos Figura 2-21. Esquema simplificado del dogma central de la biologa molecular.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 31

Este tro crtico de macromolculas, ADN, ARN y protenas, se encuentran presentes en todas las clulas. Los mecanismos por medio de los cuales se realiza la transferencia de informacin hasta expresarse en protenas se comprende bastante bien en la actualidad. Un tema de investigacin recurrente en la biologa molecular es cmo descifra la clula cul protena fabricar, en qu momento y en qu cantidades. i. Replicacin Antes de la divisin celular, cada clula debe duplicar su ADN con exactitud extraordinaria, a pesar de ocurrir a una impresionante velocidad de 1000 nuclotidos por segundo. Una hebra de ADN puede funcionar como molde para su replicacin, haciendo uso de la complementariedad de bases. Este proceso implica el reconocimiento de cada nucletido en el ADN molde por un nucletido complementario libre, y requiere que el ADN se encuentre desnaturalizado, es decir, con sus dos hebras separadas.

Figura 2-22. El ADN de doble hlice acta como su propio molde para replicacin. Dado que un nucletido nicamente se unir a su complementario, una molcula de ADN puede copiarse fielmente en base a complementariedad.

Figura 2-23. Replicacin semiconservadora. En cada replicacin, cada una de las dos hebras de ADN funciona como molde, por lo que las hebras originales de ADN permanecen intactas a travs de muchas generaciones.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 32

Durante la replicacin del ADN dentro de la clula, cada una de las dos hebras del ADN original funciona como un molde para la formacin de una hebra nueva completa. Debido a que cada una de las dos clulas hijas en una mitosis hereda una nueva doble hlice de ADN que contiene una hebra original y una hebra nueva, se dice que el ADN se replica de forma semiconsevadora (Ver Figura 2-22). En 1957 se descubri la primera ADN polimerasa, enzima que dirige la polimerizacin de cidos nuclicos, especficamente ADN. Los sustratos de esta enzima incluyen los desoxirribonuclesidos trifosfato, y se requiere la presencia de un molde de ADN de una sola hebra. La reaccin qumica base de este proceso se detalla en la figura 2-24, y la enzima a cargo de realizar el proceso se ilustra en la figura 2-25.

Figura 2-24. La adicin de un desoxinucletido en el extremo 3 de una cadena de nucletidos es la reaccin fundamental de la replicacin de ADN. Como se muestra, la complementariedad entre la base del ADN molde y el nuevo nucletido gua la formacin de una nueva hebra de ADN sobre la hebra existente, tambin llamada hebra molde.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 33

Figura 2-25. La sntesis de ADN se cataliza por la ADN polimerasa. La ADN polimerasa cataliza la adicin ordenada de los desoxirribonucletidos al extremo 3 de una cadena de nucletidos, guindose por una cadena preexistente, la hebra molde. A principios de la dcada de 1960 se llevaron a cabo estudios sobre cromosomas completos sufriendo replicacin. Estos estudios revelaron una regin localizada de replicacin que se mueve progresivamente sobre el ADN original de doble hebra. Debido a su forma en Y, este se conoce como horquilla de replicacin. En ella, el ADN nuevo se polimeriza sobre el ADN existente por un complejo de enzimas que incluye la ADN polimerasa. Inicialmente, el sistema de replicacin se consideraba relativamente simple: el crecimiento continuo de las dos nuevas hebras hijas, nucletido por nucletido, en la horquilla de replicacin, a medida que sta se mueve de un extremo de la molcula de ADN a la otra. Sin embargo, dada la orientacin antiparalela de las hebras de una molcula de ADN, este mecanismo requerira que una hebra hija se polimerizara en direccin de 5 a 3, y la otra en direccin opuesta, requiriendo dos molculas de ADN polimerasa. Aunque la polimerizacin de 3 a 5 es qumicamente posible, no se ha encontrado ninguna enzima que catalice esta adicin, por lo que no podra darse dentro del sistema de replicacin de ADN. (Ver Figura 2-26)

Figura 2-26. Modelo incorrecto de la replicacin del ADN.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 34

Entonces, cmo se logra el crecimiento de la hebra que va en sentido 3 a 5? A finales de la dcada de 1960, los resultados de ciertos experimentos sugirieron la respuesta. Se agreg timina radiactiva a bacterias en divisin por unos cuantos segundos, de manera que solamente fuera marcado el ADN recin replicado. Este experimento revel la existencia transitoria de fragmentos de 1000 a 2000 pares de bases, ahora conocidos como fragmentos de Okazaki, que se dan justo en la horquilla de replicacin. Estos fragmentos se encontraron nicamente en la hebra que crece en direccin 3 a 5, para unirse posteriormente, creando largas cadenas de ADN. En estudios siguientes se encontraron estos mismos fragmentos en eucariotas, pero mucho ms pequeos (100-200pb).

Figura 2-27. Estructura asimtrica de la horquilla de replicacin. Por lo tanto, la horquilla de replicacin tiene una estructura asimtrica (Ver Figura 2-27). La hebra nueva que se sintetiza de forma continua se conoce como hebra conductora o lder, mientras que la que crece de forma fragmentada se conoce como hebra retardada. Para esta ltima, la polimerizacin se da en direccin contraria al crecimiento neto de la hebra de AND, por lo cual su polimerizacin se retrasa, ya que debe esperar a que la hebra lder exponga la hebra original sobre la cual debe sintetizarse el fragmento de Okazaki. El hecho que la hebra retardada se sintetice en fragmentos significa que nicamente un tipo de polimerasa es necesaria, la que cataliza la polimerizacin en direccin 5 a 3. En general, la fidelidad del copiado de ADN es muy alta, cometiendo un promedio de un error por cada 109 nucletidos copiados, mucho mayor a la que se esperara si se toma en cuenta que s es posible aparear las bases de forma diferente al usual AT y GT en ADN, con
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 35

cambios en estructura tridimensional muy pequeos. Esta alta fidelidad se debe en especial manera a varios procesos de revisin de lectura durante la replicacin. Estos procesos actan de forma continua para corregir los errores que pudieron haberse dado. El primer paso de revisin la lleva a cabo la ADN polimerasa, justo antes que el nucletido se agregue a la cadena en crecimiento. Luego que el siguiente nucletido se une a la enzima, y antes de formar el enlace fosfodister que lo une al resto de la cadena, la enzima debe sufrir un cambio conformacional. Una base incorrecta tiende a separarse de la enzima durante este cambio conformacional ya que la base correcta tiene una afinidad ms alta por la polimerasa en movimiento por ser la nica que puede unirse a la hebra molde. Solamente despus de esta revisin puede formarse el enlace covalente entre el nuevo nucletido y el ltimo de la cadena en crecimiento. La siguiente revisin, conocida como revisin exonucleoltica, se da justo despus que un nucletido incorrecto ha sido agregado covalentemente a la cadena creciente de ADN. Para poder realizar polimerizacin, la ADN polimerasa requiere que la cadena de ADN molde tenga ya unida a ella un trozo de la cadena nueva ubicada en su lugar complementario. Si se ingresa un nucletido incorrecto, ste lograr colocarse en su lugar solamente un instante, ya que al no ser complementario, rpidamente sufrir un rechazo y no integrar bien la cadena. La ADN polimerasa no puede continuar en una cadena de esa manera, as que borra el error con su actividad exonucleasa, es decir, retirando el nucletido equivocado, preparando la molcula para recibir los siguientes nucletidos (Ver Figura 2-28). Interesantemente, solamente el crecimiento de 5 a 3 permite la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa, una de los mtodos de revisin en la replicacin de ADN, pudiendo ser sta una razn para que no se observe la replicacin en esa direccin. Muy a pesar de todos estos procesos de revisin, la ADN polimerasa ocasionalmente comete errores. Sin embargo, la clula an puede corregir estos errores por procesos de reparacin. La ADN polimerasa no puede iniciar su trabajo de polimerizacin si la nueva cadena no se ha empezado a formar, problema que se resuelve con un cebador o primer. En el caso de la hebra lder, solamente se requiere este cebador o primer una sola vez, mientras que en la hebra retardada se requiere cada vez que se inicia un fragmento de Okazaki. Para lograrlo, se involucra una ADN primasa, la cual usa ribonuclesidos trifosfato para sintetizar primers de ARN en la hebra retardada. En los eucariotas, estos primers son de unos 10 nucletidos, formados a intervalos de 100 a 200 nucletidos sobre la hebra retardada. Una vez formado el primer, la ADN polimerasa reconoce el sitio y puede empezar un fragmento de Okazaki. La sntesis de cada fragmento termina cuando la ADN polimerasa se encuentra con el primer del fragmento anterior. Para producir una hebra continua de ADN en la hebra retardada, se da un sistema de reparacin de ADN que acta velozmente para eliminar los primers de ARN y sustituirlos por ADN. La ADN ligasa une los diferentes fragmentos de ADN producidos durante el proceso para completar la cadena. La figuras 3-24 ilustra el proceso completo. Sin embargo, antes de iniciar todo el proceso de replicacin, existe un problema que debe resolverse: el ADN se encuentra enrollado fuertemente como doble hlice y debe abrirse para que puedan unirse los nuevos nucletidos. La fuerza con que est unida la doble hlice es tan fuerte, que es necesario subir la temperatura a casi el punto de ebullicin del agua para poder separarlas, lo cual obviamente no es posible dentro del organismo. Para poder separar las hebras a condiciones normales, es necesaria la actuacin de dos tipos diferentes de protenas: las ADN helicasas y las protenas de unin a hebras simples de ADN.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 36

Figura 2-28. Accin exonucleasa de la ADN polimerasa como correccin de errores durante la replicacin.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 37

Figura 2-29. La sntesis de ADN en la hebra retardada. En eucariotas, los primers de ARN se forman cada alrededor de 200 pares de bases en la hebra retardada, siendo cada primer de unos 10 nucletidos. Este primer se borra por un sistema especial de reparacin de ADN que reconoce la hebra de ARN sobre el ADN y la fragmenta, dejando vacos que posteriormente llenan la ADN polilmerasa y la ADN ligasa. Las ADN helicasas usan la hidrlisis de ATP para impulsarse sobre una hebra de ADN, interponindose entre ambas hebras, separndolas a medida que avanza, a una velocidad de hasta 1000 pares de bases por segundo. En principio, la apertura de la doble hebra de ADN en la horquilla de replicacin puede deberse a dos ADN helicasas actuando en conjunto, una sobre la hebra lder y una sobre la retardada. Las protenas SSB (protenas ligantes a ADN monocatenario, por sus siglas en ingls) se unen cooperativamente a las hebras sencillas de ADN, sin cubrir las bases, que permanecen disponibles para su complementacin. Estas protenas, aunque incapaces de abrir una hebra de ADN directamente, ayudan a mantener abierto el ADN, estabilizando cada hebra por separado. Adems, su unin cooperativa cubre y desenrrolla la hebra molde para la hebra retardada, previniendo la formacin de hlices en horquilla que se forman fcilmente en ADN monocatenario (es decir, en hebra simple), ya que stas pueden detener la replicacin por parte de la ADN polimerasa. A medida que la horquilla de replicacin se mueve sobre la hebra doble de ADN, crea un problema de tensin, ya que, en teora, para lograr la replicacin, todo el sistema debiese girar rpidamente sobre la hebra doble de ADN original. Para evitarlo, las ADN topoisomerasas tienen capacidad de cortar momentneamente un enlace fosfodister de la hebra original y usar el restante para lograr que el trozo pequeo de ADN vaya liberando la tensin al girar, para posteriormente volver a formar el enlace en su lugar original.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 38

ii. Transcripcin La transcripcin es uno de los medios por los cuales las clulas leen y expresan las instrucciones genticas en su ADN. Una ventaja es que pueden fabricarse muchas copias de ARN a partir del mismo gen, y una copia del ARN usarse para fabricar muchas molculas de protenas idnticas, por lo que la clula es capaz de sintetizar grandes cantidades de protena de forma rpida cuando sea necesario. A la vez, cada gen puede transcribirse con diferente eficiencia, permitiendo que la clula haga grandes cantidades de una protena y pocas de otras. An ms, la clula puede regular le expresin de cada gen segn las necesidades del momento, por medio del control de la produccin del ARN a partir de cada gen. El primer paso de una clula para expresar un gen es copiar una porcin especfica de la secuencia del ADN, un gen, a una secuencia de ARN. La informacin en ARN, aunque se copia a otra forma qumica, est escrita bsicamente en el mismo lenguaje de nuclotidos, por lo cual se le denomin transcripcin. Al igual que el ADN, el ARN es un polmero formado por cuatro diferentes tipos de nucletidos unidos por enlaces fosfodister. Solamente se diferencia del ADN en dos aspectos: usa ribosa (en lugar de desoxirribosa, como el ADN) y sustituye el uso de la timina (T) por el uracilo (U), el cual tambin es complementario a la adenina (A). Por otra parte, el ARN se da dentro de la clula mayormente como hlice simple, y no doble como el ADN, aunque es perfectamente capaz de contener pequeas porciones de hlice doble, hacindolo muy verstil en las formas tridimensionales que puede tomar. Todo el ARN en una clula se produce a travs de la transcripcin de ADN, proceso con ciertas similitudes a la replicacin de ADN que se discuti anteriormente. La transcripcin se inicia con la apertura y desenrollamiento de una pequea porcin de la doble hlice de ADN para exponer las bases en cada hebra de ADN. Una de las dos hebras de ADN acta como molde para la sntesis de la molcula de ARN. Al igual que en la replicacin de ADN, la secuencia de la cadena de ARN se determina por la unin complementaria de los nucletidos nuevos y los nucletidos en la hebra molde. Por tanto, el ARN final tendr una secuencia exactamente complementaria a la de la hebra de ADN que se us como molde.

Figura 2-30. La transcripcin de ADN produce una molcula de ARN de hlice simple, complementaria a una hebra de ADN Sin embargo, la transcripcin se diferencia de la replicacin en varias formas importantes. En primer lugar, el ARN no permanece unido al ADN molde, sino se va retirando, para volver a formar la doble hlice de ADN al terminar. En segundo lugar, debido a que solamente se copia un gen, las hebras de ARN producidas por transcripcin son mucho ms cortas que las hebras de ADN producidas por replicacin.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 39

La enzima involucrada en la transcripcin es la ARN polimerasa, que cataliza la formacin de los enlaces de fosfodister entre los nucletidos para formar una cadena lineal. La ARN polimerasa se mueve paso a paso sobre el ADN, desenrollando el ADN justo frente al sitio activo para polimerizacin para exponer una nueva regin de la hebra molde, y as permitir que las nuevas bases se complementen en ella. De esta forma, la cadena de ARN crece, un nucletido a la vez, en direccin 5 3, usando como sustratos los nuclesidos trifosfato (ATP, CTP, UTP y GTP).

Figura 2-31. El ADN se transcribe por accin de la ARN polimerasa. sta se mueve sobre el ADN, desenrrollndolo en su sitio activo. A medida que avanza, la polimerasa aade un nucletido a la vez a la cadena creciente de ARN, usando la cadena de ADN expuesta como molde. El ARN resultante es una hebra simple complementaria a la regin de ADN usada como molde. La liberacin inmediata del ARN del ADN molde implica que puede realizarse varias copias de ARN de un mismo gen en un tiempo relativamente corto. Es posible que dos polimerasas trabajen en secuencia, con 20 nucletidos por medio, para lograr muchas copias al mismo tiempo. A pesar que la ARN polimerasa lleva a cabo una funcin muy parecida que la ADN polimerasa, difiere en aspectos clave. Primero, cataliza la unin de ribonucletidos, y no de desoxirribonucletidos. Segundo, es capaz de iniciar la transcripcin de un gen sin la necesidad de un primer o cebador. Debido a que el ARN no guarda informacin gentica de forma permanente, la ARN polimerasa no requiere ser tan precisa como la ADN polimerasa, y pude cometer un error por cada 104 nucletidos copiados (comparados con el error por cada 107 nucletidos copiados de la ADN polimerasa), siendo sus consecuencias mucho menores que las de los errores en ADN. La mayor parte de los genes de una clula especifican la secuencia de aminocidos en protenas. El ARN que se transcribe de estos genes se conoce como ARN mensajero. El producto final de una minora de genes, sin embargo, es el ARN en s. Algunas de estas molculas de ARN que no son mensajero funcionan como componentes estructurales o enzimticos para varios procesos en la clula. Por ejemplo, parte del ARN pequeo nuclear dirige la edicin del ARN pre-mensajero, el ARN ribosomal es el principal componente del ribosoma, y los ARN de transferencia son los adaptadores que seleccionan los aminocidos y los llevan a su lugar para su incorporacin en una protena.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 40

Cada segmento transcrito de ADN se conoce como unidad de transcripcin, y en eucariotas suele llevar la informacin nicamente de un gen, codificando ya sea una sola molcula de ARN o una sola protena. En algunas bacterias, algunos grupos de genes continuos frecuentemente se transcriben como una sola unidad, resultando en una molcula de ARNm que lleva la informacin de varias protenas independientes. Para transferir un gen de forma precisa, la ARN polimerasa debe reconocer el lugar en el genoma donde debe empezar y terminar la transcripcin. Es ms, este paso es crucial en el control de la expresin gnica, ya que es el punto principal en donde las clulas regula cul protena sintetizar y a qu velocidad. En las bacterias, la ARN polimerasa es realmente un complejo de varias subunidades. Una subunidad especfica, llamada factor sigma () es la mayormente responsable de leer las seales en el ADN para indicar dnde iniciar la transcripcin. Este factor, cuando est unido al resto de la enzima, reconoce el sitio promotor, permitiendo que la enzima se una fuertemente al ADN e inicie el proceso de transcripcin. A diferencia que en la replicacin, en la transcripcin solamente es necesario abrir una porcin de la doble hlice, exponiendo la secuencia de ADN que servir como molde para la fabricacin del ARN. Durante el inicio del proceso, el factor se va relajando, hasta disociarse y permitir que la ARN polimerasa trabaje ms fluidamente en la transcripcin, la cual contina hasta encontrar una segunda seal, la de terminacin. En bacterias, esta seal parece ser una secuencia especfica que permite que el ARN producido se doble en forma de gancho y cause la separacin de la enzima del ADN, terminando la transcripcin. Esta enzima no puede iniciar transcripcin nuevamente sin antes haber unido a ella el factor y encontrado el sitio promotor. La transcripcin en eucariotas requiere de tres polimerasas distintas, aunque similares en estructura (ARN polimerasas I, II y III). Estas polimerasas son similares a las bacterianas, compartiendo similitudes en sus subunidades y caractersticas estructurales. Sin embargo, las ARN polimerasas I y III se especializan en transcribir genes que codifican el ARN ribosomal, el ARN de transferencia y varios ARNs pequeos. La ARN polimerasa II es la principal involucrada en la transcripcin de la mayora de genes, incluyendo a los que codifican protena. Aunque la ARN polimerasa eucariota es similar a la bacteriana (Figura 3-27), existen varias diferencias importantes entre las dos: la ARN polimerasa eucariota es ms grande que la bacteriana la ARN polimerasa bacteriana es capaz de iniciar la transcripcin del ADN al tener incorporada la subunidad de factor , la ARN polimerasa eucariota no puede, ya que depende de un gran grupo de protenas llamadas factores generales de transcripcin, que deben ensamblarse en el sitio promotor antes que la polimerasa pueda iniciar la transcripcin. La transcripcin eucariota debe manejar un ADN superenrrollado en nucleosomas y otros rdenes estructurales superiores en la cromatina.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 41

Figura 2-32. Similitudes estructurales entre la ARN polimerasa bacteriana y eucariota. Las regiones con similitudes estructurales estn indicadas en verde. La enzima eucariota es de mayor tamao (12 subunidades, en lugar de cinco) y algunas regiones adicionales, mostradas en gris. Las esferas aqua indican tomos de Zn como parte estructura, y el rojo, el tomo de Mg en el sitio activo, donde se lleva a cabo la polimerizacin. Los factores generales de transcripcin ayudan a la ARN polimerasa II a posicionarse de forma correcta, ayudndole a abrir las dos hebras de ADN para permitir que inicie la transcripcin. Estos factores de transcripcin son generales dado que funcionan en todos los promotores que usa la ARN polimerasa II, y consisten de un grupo de protenas que interactan entre s, y que se designan como TFIIA, TFIIB, etc. (TFII por factores de transicin para la ARN polimerasa II, por sus siglas en ingls). Sus papeles se describen en la Figura 328. El proceso de ensamblaje se inicia con la unin del factor general de transcripcin TFIID a una secuencia corta de ADN de doble hlice, principalmente formado por nucletidos T y A, llamada secuencia TATA, o TATA box. sta secuencia, la ms importante aunque no nica secuencia de iniciacin de transcripcin, se encuentra generalmente 25 nucletidos antes del punto de inicio de transcripcin. La unin de la TFIID causa una distorsin del ADN en ese punto, lo cual se cree que funcionan como una marca fsica para localizacin de un promotor activo dentro de un gran genoma. Los dems factores se van uniendo al ensamblaje, para luego incluir la ARN polimerasa II, para completar el complejo de iniciacin de transcripcin. Despus que la ARN polimerasa ha iniciado la transcripcin, la mayora de los factores generales de transcripcin se liberan del ADN para estar disponibles para iniciar otra ronda de transcripcin. Tras la liberacin de los factores generales de transcripcin, la ARN polimerasa contina con la polimerizacin de ARN, ayudado por otro grupo de protenas, factores de elongacin, que le ayudan a transcribir a pesar de los nucleosomas, y complejos de de remodelacin de cromatina, para poder transcribir a travs de las conformaciones ms complicadas de la cromatina. En las bacterias, el ARN mensajero se transcribe directamente por la ARN polimerasa desde un punto de inicio en el genoma a un punto final en el mismo. En eucariotas, la situacin es distinta, ya que el gen eucariota posee una gran porcin de ADN que nunca llega a expresarse a protenas. Estas secuencias, llamadas intrones, descartarse del ARN mensajero por medio del proceso de edicin de ARN. Este proceso le brinda a los eucariotas
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 42

la posibilidad de sintetizar diferentes protenas a partir del mismo gen. Los ARN mensajeros ya editados, llamados maduros, se reconocen en los poros nucleares antes de dejarlos salir al citoplasma.

Figura 2-33. Para iniciar la transcripcin, ARN polimerasa II requiere el ensamblaje de los factores generales de transcripcin (llamados TFIIA, TFIIB, etc). (A) El promotor contiene la TATA box 25 nucletidos antes del inicio de transcripcin. (B) El factor de transcripcin TFIID reconoce y se une a la TATA box, lo cual permite la unin del TFIIB. (C) La distorsin producida por esta unin no se ilustra, por simplicidad. (D) El resto de factores de transcripcin y la ARN polimerasa misma se unen al ensamblaje. (E) El TFIIH usa ATP para abrir la doble hlice en el punto de inicio de transcripcin, permitiendo el inicio de la misma. Este factor tambin fosforila la enzima para cambiar su configuracin para desligarse de los factores de transcripcin e iniciar la fase de polimerizacin.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 43

Adems de ARN mensajero, la transcripcin produce ARN ribosomal. Existen cuatro tipos de ARNr en un ribosoma eucariota. Tres de esos cuatro se encuentran en un ARNr precursor, el cual debe ser transcrito y modificado, antes de separarlo en las tres molculas funcionales de ARNr. El cuarto tipo de ARN ribosomal se transcribe por separado, por una polimerasa distinta. iii. Traduccin A finales de la dcada de 1950, los cientficos de la poca centraron su atencin al problema de codificacin. Queran saber cmo era posible que una secuencia lineal de nucletidos pudiese codificar una secuencia lineal de molculas qumicas muy distintas, los aminocidos, para formar protenas. En la actualidad, el proceso ha sido descifrado paso a paso. Una vez se ha producido un ARN mensajero maduro, la secuencia de sus bases se usa para sintetizar una protena. Debido a que la naturaleza qumica de los componentes de ambas molculas son tan distintas, este proceso se conoce como traduccin. Adems, debido a que existen solamente cuatro nuclotidos para codificar a veinte aminocidos, no puede pensarse en la correspondencia de uno a uno entre nucletido y aminocido. La secuencia de nucletidos en el gen del ADN, a travs del uso del ARNm, se traduce a una secuencia de aminocidos en una protena usando reglas que se conocen como cdigo gentico, el cual fue descifrado a principios de la dcada de 1960. La secuencia de nucletidos en una molcula de ARNm se lee de forma consecutiva en grupos de tres. Dado que el ARN tiene cuatro posibles nucletidos, existen 4x4x4=64 posibles combinaciones de nucletidos para 20 aminocidos. Esto quiere decir una de dos cosas: o que hay combinaciones que no se usan, o que el cdigo es redundante, es decir, que se usan diferentes combinaciones para un mismo aminocido. La correcta es la segunda, ya que algunos aminocidos estn codificados por ms de una combinacin. El cdigo gentico, que se ha mostrado conservado a travs de las especies, se muestra en la figura 2-34. Se han encontrado algunas diferencias, pero se encuentran principalmente en el ADN mitocondrial, el cual tiene su propio sistema de transcripcin y de sntesis de protenas que operan de forma independiente que el resto de la clula.

Figura 2-34. El cdigo gentico. Por convencin, los codones siempre se escriben con el nucletido 5 terminal a la izquierda. Note que muchos aminocidos estn representados por ms de un codn, que tienden a contener los mismos nucletidos en la primera y segunda posicin. Tres codones no especifican un aminocido, sino un sitio de terminacin de traduccin, mientras que un codn codifica tanto iniciacin de traduccin a la vez que al aminocido metionina. Los codones en una molcula de ARN no identifican ellos mismos al aminocido que codifican. De hecho, la traduccin de un ARNm a protena depende de molculas adaptadoras que pueden reconocer tanto el codn como el aminocido correspondiente. Esta molcula se conoce como ARN de transferencia (ARNt) y consisten de alrededor de 80 nucletidos de
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 44

longitud. Estas molculas poseen una estructura tridimensional especfica, parecida a una hoja de trbol, con dos reas de especial importancia: el anticodn, grupo de tres nucletidos complementarios al codn que reconocern en el ARNm, y el extremo 3, donde se une covalentemente el aminocido correspondiente al codn que reconocer en el ARNm, como se ilustra en la Figura 2-35.

Figura 2-35. Molcula de ARNt. Varias ilustraciones del mismo ARNt, en este caso, especfico para fenilalanina (Phe). (A) Estructura en trbol, usada convencionalmente para mostrar la complementacin de bases para formar las dobles hlices que le dan la estructura. Los ARNt contienen bases inusuales, tales como (pseudouridina) y D (dihidrouridina) (B y C) Vistas de la estructura tridimensional del ARNt, segn anlisis de difraccin de rayos X. Todos los ARNt tienen estructura muy similar. (D) Secuencia lineal de nucletidos de la molcula, con cdigo de color que corresponde a las figuras A, B y C. La redundancia del cdigo gentico se da debido a dos razones: existe ms de un ARNt por aminocido, y algunos ARNt pueden unirse con ms de un codn. Los humanos tenemos 497 genes para ARNt, pero en ellos solamente se cubren 48 anticodones especficos, ya que algunos pueden tolerar una unin perfecta solamente en los primeros dos nuclotidos, y una no tan perfecta en el tercero. Hemos visto que la decodificacin del cdigo gentico depende de molculas adaptadoras que asocian el aminocido correcto con el anticodn especfico. Para asegurar la decodificacin correcta del cdigo gentico, es vital asegurar tambin la unin del aminocido correcto al ARNt correcto. El reconocimiento y la unin del aminocido correcto al ARNt depende de las enzimas llamadas aminoacil ARNt sintetasas, la cual se encarga de unir covalentemente cada aminocido a su respectivo ARNt. En la mayora de las clulas hay una sintetasa especfica para cada aminocido, dando un total de veinte enzimas. Para formar protenas, los aminocidos deben unirse entre s en cadenas a travs de la formacin de un enlace peptdico, entre el grupo carboxilo libre de la cadena en crecimiento y el grupo amino libre del aminocido entrante, inicindose la sntesis de protenas desde el

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 45

extremo N-terminal, paso a paso, al extremo C-terminal. Quien dirige esta reaccin es, a la larga, la secuencia de nucletidos que se encuentra en el ARNm. En principio, una secuencia de ARN tiene tres marcos de lectura posibles, dependiendo de dnde se inicie el proceso de decodificacin. Sin embargo, solamente una de ellas contiene la secuencia correcta para la protena requerida. Esto se resuelve con una seal al inicio de cada mensaje de ARN para definir el marco de lectura correcto para el inicio de la sntesis proteica.

Figura 2-36. La secuencia de nucletidos de un ARNm se lee de 5 a 3 en grupos secuenciales de tres nucletidos. Por tanto, la misma secuencia de ARN podra codificar tres secuencias de aminocidos totalmente distintas, segn el nucletido donde se inicie la codificacin. Cada una se conoce como marco de lectura, y solamente una de ellas es la correcta. Para asegurar que se est usando el marco de lectura correcto y para asegurar una exactitud alta (alrededor de 1 error por cada 10,000 aminocidos incorporados), la sntesis proteica se da dentro de un organelo celular especfico para ello, el ribosoma. El ribosoma es una compleja mquina cataltica formada por ms de cincuenta protenas distintas y varias molculas de ARN (ARN ribosomal, o ARNr). Una clula eucariota tpica contiene millones de ribosomas en su citoplasma, donde se realiza la sntesis proteica. Los ribosomas, tanto eucariotas como procariotas, poseen dos subunidades, una grande y una pequea, que se encuentran separadas cuando el ribosoma no est activo. La subunidad pequea provee un marco de lectura sobre el cual los ARNt pueden unirse exactamente a los codones del ARNm, mientras que la subunidad grande cataliza la formacin de los enlaces peptdicos que unen los aminocidos a la cadena polipeptdica en crecimiento. Ambas unidades se unen al inicio de la cadena de ARNm para iniciar la sntesis proteica. A medida que cada codn va entrando al ribosoma, los ARNt van unindose al codn adecuado, aadiendo los aminocidos en el orden correcto. Al encontrar un codn de alto, el ribosoma libera la cadena polilpeptdica y sus unidades se vuelven a separar. Estas subunidades pueden usarse para la sntesis de otra protena u otra molcula de ARNm. Para lograr estos pasos con gran precisin y rapidez, el ribosoma posee cuatro sitios de unin dentro de su estructura: una para el ARNm y tres para el ARNt, conocidos como sitios A, P y E. Una molcula de ARNt puede unirse a los sitios A y P solamente si su anticodon se complementa con un codn en el ARNm unido al ribosoma. Los sitios A y P estn suficientemente cerca como para que las dos molculas de ARNt en ellos estn unidos a
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 46

codones contiguos. Esto hace que siempre se use el mismo marco de lectura en todas las adiciones de aminocidos. Una vez se ha iniciado la sntesis proteica, cada aminocido nuevo se agrega a la cadena creciente en un ciclo de reacciones en tres pasos principales. Considere el punto en donde ya se inici la traduccin y se han unido los primeros aminocidos. Como se muestra en la figura 3-32, en el primer paso, un ARNt con el siguiente aminocido en la secuencia se une al sitio A, formando pares de bases con el codn del ARNm en ese sitio, de forma que el sitio P y el sitio A tienen sus respectivos ARNt de forma adyacente. En el segundo paso, el extremo carboxilo de la cadena polipeptdica en crecimiento se libera de su ARNt respectivo y reacciona con el amino libre del siguiente aminocido, unido al ARNt del sitio A, formando un nuevo enlace peptdico. Esta reaccin es catalizada por un sitio de actividad peptidil transferasa que se encuentra en la unidad grande del ribosoma. Esta reaccin est acompaada de un cambio de conformacin en el ribosoma, que obliga al corrimiento de los ARNts a los sitios E y P. En el paso tres, otra serie de cambios conformacionales mueve el ARNm exactamente tres nucletidos dentro del ribosoma y regenera las condiciones para volver al primer paso. La iniciacin y terminacin de la traduccin se da a travs de variaciones en el ciclo descrito anteriormente. El lugar donde se inicia la traduccin es de especial importancia, ya que determina el marco de lectura que se seguir. La traduccin del ARNm siempre se inicia en el codn AUG, necesitndose un ARNt especial para iniciar. Este ARNt iniciador siempre lleva consigo el aminocido metionina (en bacterias, formilmetionina), de forma que todas las protenas recin sintetizadas inician con el aminocido metionina, como extremo N-terminal. Este ARNt iniciador tiene una secuencia de nucletidos distinta a la del ARNt que normalmente lleva metionina. En los eucariotas, el ARNt iniciador (unido a metionina) se une a la subunidad ribosomal pequea con protenas adicionales conocidas como factores de iniciacin eucariotas (eIFs, por sus siglas en ingls). Solamente este ARNt iniciador, ya unido a la metionina, es capaz de unirse a la unidad ribosomal pequea sin la presencia de ribosoma completo. Posteriormente, la unidad ribosomal pequea se une a un ARNm, ayudado por otros factores de iniciacin, y se mueve hasta encontrar el codn de iniciacin, el primer AUG. En este punto, los factores de iniciacin se disocian, dejando libre el espacio para que se una la subunidad ribosomal grande y completar el ribosoma, que sigue con la traduccin. El punto en el ARNm donde debe terminar la traduccin se seala por la presencia de uno de tres codones (UUA, UAG o UGA), llamados codones de terminacin. Estos codones no son reconocidos por ARNts, sino por el ribosoma mismo, indicndole que termine la traduccin. Ciertas protenas, llamadas factores de liberacin, se unen al ribosoma en el codn de terminacin en el sitio A, y esta unin obliga a la peptidil transferasa del ribosoma a aadir una molcula de agua en lugar de otro aminocido, liberando el extremo carboxilo de la protena y, por ende, a la protena misma. Posteriormente, el ribosoma libera al ARNm y sus unidades se separan, pudiendo iniciar el ciclo de traduccin nuevamente. El proceso de expresin gnica no se termina con la traduccin, ya que para que una protena sea de utilidad a la clula, debe doblarse para obtener una conformacin tridimensional nica, unirse con cualquier cofactor que sea necesario para su actividad, ser modificada correctamente y ensamblarse adecuadamente con otras subunidades proteicas con las que deba funcionar. Esta conformacin est determinada por la secuencia de aminocidos que forman la protena, y se va obteniendo a medida que va creciendo la cadena
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 47

polipeptdica en el ribosoma, como se muestra en la figura 3-33. El proceso se hace ms eficiente con ayuda de las chaperonas moleculares. Aquellas protenas que no se doblen correctamente son reconocidas y degradadas por proteasas especficas.

Figura 2-37. Cada aminocido que se agrega a la cadena polipeptdica creciente se selecciona a travs de la complementariedad con el siguiente codn del ARNm. El ciclo de tres pasos que se muestra aqu se repite una y otra vez durante la traduccin. Tal como se muestra, la direccin de la traduccin se da en la direccin 5 a 3 del ARNm, y se inicia la cadena polipeptdica desde su lado N-terminal, agregando los nuevos aminocidos entrantes al lado C-terminal.
Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013 Pgina 48

Figura 2-38. Se muestra una cadena polipeptdica en formacin, tomando su forma secundaria y terciara a medida que va surgiendo del ribosoma. El extremo N-terminal, que se forma primero, se va doblando primero, mientras que el extremo C-terminal an se sintetiza. Aqu, la protena se termina de doblar despus de haber sido liberada del ribosoma. iv. En resumen

Figura 2-39. En resumen El paso de ADN hasta protena es realmente una compleja serie de pasos consecutivos que dan como resultado la produccin de protenas listas para su uso correcto.

Tecnologa Biomolecular, Texto de apoyo, 2013

Pgina 49

También podría gustarte