UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

ESPECTROFOTOMETRIA
Diego A. Mendoza Figueroa - 2011215021
E.A.P. Farmacia y Bioqumica

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Informe N 3 de Bioqumica I

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Muchos Experimentos en bioqumica dependen de la medicin de absorcin de luz monocromtica de una sustancia en solucin en la regin visible ultravioleta del espectro electromagntico. Diversos compuestos sean o no coloreados tienen la capacidad de absorber la luz de una determinada longitud de onda,, pero en otros casos es necesario transformar la luz en una derivado coloreado usando reactivos apropiados. Las molculas de inters absorben la luz en la longitud comprendido entre 200 nanmetros (nm) como las aminocidos, aromticos, nucleicos protenas y otros. biolgico de onda, y 800 purinas, cidos

Para realizar el color (colorimetra) como la transmitancia (fotometra) de luz de una solucin pueden usarse como medida de su concentracin. Para realizar las medidas de concentracin se utiliza un instrumento llamado espectrofotmetro el cual contiene un prisma de dispersin entre la fuente de la luz y la muestra para poder seleccionar la longitud de onda analtica adecuada. La onda espectrofotomtrica consiste en comparar la transmisin de luz a travs de una solucin que contiene muestra.

Encontrar la curva espectral de un colorante. Determinar la longitud de onda analtica o de mayor observancia. Determinar la curva de calibracin y factor de calibracin mediante concentraciones progresivas del colorante.

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Un espectrofotmetro o colormetro hace uso de la transmisin de la luz a travs de una solucin para determinar la concentracin de un soluto dentro de la solucin. Un espectrofotmetro difiere de un colormetro en la manera en la cual la luz es separada en sus longitudes de onda componentes. Un espectrofotmetro usa un prisma y un colormetro utiliza filtros. Ambos se basan en un diseo simple en el cual la luz de una determinada longitud de onda pasa a travs de una muestra y se mide la cantidad de luz que es transmitida. Esto es realizado colocando una fotocelda del otro lado de la muestra. Todas las molculas absorben energa radiante en una longitud de onda u otra. Esas que absorben energa dentro del espectro visible son conocidos como pigmentos. Las protenas y los cidos nucleicos absorben luz en el rango ultravioleta. El diseo de un espectrofotmetro incluye una fuente de luz, un prisma, un portaceldas y una fotocelda. Conectado a cada equipo se tienen apropiados sistemas elctricos o mecnicos para controlar la intensidad luminosa, la longitud de onda, y para la conversin de energa recibida por la fotocelda en un cambio de voltaje. La fluctuacin de voltaje es mostrada en una escala mtrica, es presentada digitalmente, o es almacenada en una computadora para su posterior anlisis. Los espectrofotmetros son muy tiles por la relacin de la intensidad de color en una muestra y su relacin con la cantidad de soluto dentro de la muestra. Por ejemplo, si usted usa una solucin de una sustancia roja en agua, y mide la cantidad de luz azul absorbida cuando atraviesa la solucin, una fluctuacin medible de voltaje puede ser inducida en una fotocelda. Si una solucin roja es diluida a la mitad por la adicin de agua, entonces el color ser aproximadamente 1/2 de intenso y el voltaje generado en la fotocelda ser aproximadamente la mitad. Es decir, hay una relacin entre el voltaje y la cantidad de colorante en la muestra. Dada la geometra de un espectrofotmetro lo que es medido en la fotocelda es la cantidad de luz que llega a la celda. El medidor de voltaje lee la cantidad de luz transmitida a la fotocelda. La transmisin de la luz no es una funcin lineal, es ms bien una funcin de tipo exponencial. Podemos monitorear el nivel de transmisin y convertirlo en un porcentaje de la cantidad de luz transmitida en comparacin a cuando ningn colorante est presente. As, si la 1/2 de la luz se transmiti, entonces podemos decir que la solucin tiene un porcentaje de transmitancia del 50 %. Note que es siempre un dato comparativo con una solucin que no contiene colorante.

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La transmitancia es el porcentaje de luz que pasa a travs de una muestra. Lo que hace a todo esto fcil de aplicar, es la conversin de esa informacin de porcentaje de transmitancia en una funcin logartmica conocida como absorbancia (o densidad ptica). Principio de la Espectrofotometra Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. La espectrofotometra ultravioleta-visible utiliza haces de radiacin del espectro electromagntico, en el rango UV de 80 a 400nm, principalmente de 200 a 400nm y en el de la luz visible de 400 a 700nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la regin ultravioleta y visible del espectro. Al campo de luz uv de 200 a 400nm se le conoce tambin como rango de uvcercano, la espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo electromagntico de la luz visible, de 400 a 700nm. Adems, no est de ms mencionar el hecho de que la absorcin y transmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentracin como de la distancia recorrida. Las aplicaciones principales son:

Determinar la cantidad de concentracin en una solucin de algn compuesto utilizando las frmulas ya mencionadas. Para la determinacin de estructuras moleculares. La identificacin de unidades estructurales especificas ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomeras). Determinar constantes de disociacin de indicadores cido-base.

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La Ley de Beer-Lambert Definicin La absorbancia: Es el negativo del logaritmo en base 10 de la transmitancia. A = - log10T A=absorbancia T=transmitancia

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La absorbancia es ms til en espectrofotometra que la transmitancia, debido a que la representacin grfica de la concentracin versus la absorbancia produce una lnea recta. La representacin grfica de la concentracin versus la transmitancia es exponencial. El -log calcula el inverso de la transmitancia, de tal manera que la absorbancia aumenta con la concentracin creciente de colorante. La transmitancia decrece cuando se aumenta la cantidad de colorante rojo en nuestro ejemplo. La relacin de la absorbancia con la concentracin se encontr por dos bioqumicos que tiene la ecuacin para una lnea recta, y= mx +b, dnde la m es la pendiente de la lnea y b es la intercepcin de la recta con el eje y. Si la medicin se realiza de tal manera que b = 0 (es decir, una solucin que no contiene colorante no tiene absorbancia), y si substituimos a absorbancia por y, entonces la concentracin por x, m, llegamos a la formulacin de la Ley de Beer-Lambert: A = Cl Dnde:

A = absorbancia C = concentracin molar = el coeficiente de extincin molar para una determinada longitud de onda l = distancia que atraviesa la luz por la muestra en centmetros

Los equipos y las celdas estn diseados de tal manera que l siempre es 1 cm y por tanto es ignorado. Note que la pendiente de la lnea recta resultar de la representacin grfica de la concentracin (el eje vertical o Y) vs la absorbancia (el eje de las abscisas o X). Para utilizar un espectrofotmetro hay que preparar una serie de diluciones con concentracin conocida. Una de estas muestras no contendr soluto y es conocido como el BLANCO. Se usa para ajustar el instrumento para leer transmitancia del 100 % o 0 de absorbancia. En la prctica, un valor de transmitancia (la absorbancia infinita) de 0 % es establecido colocando un objeto opaco la fuente de luz y la fotocelda. El control electrnico es accionado a fin de que muestre una lectura de transmitancia de 0 %.. La muestra BLANCO (no contiene soluto o colorante) es colocada en el porta celda, y el

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espectrofotmetro reajustado para leer transmitancia de 100 %. Todas la dems medidas sern hechas solo por introducir las muestras en el porta celdas y medir el % de transmitancia. La mayora de espectrofotmetros tienen sistema de conversin del % de transmitancia en absorbancia. Despus de registrar la absorbancia para una serie de muestras de concentracin conocida (estndares), se hace una grfica del valor de absorbancia (el eje vertical o Y) vs la concentracin (el eje de las abscisas o X). La pendiente de la lnea es el coeficiente de extincin (). Note que esto puede ser computado directamente por rearreglo de la ley de BeerLambert, as: = A/C Este valor puede calcularse para cada lectura y el promedio asumida como el valor de la pendiente. Recuerde que este valor es una constante. As, una vez que se calcula, subsiguientemente puede usarse para determinar una concentracin desconocida por un nuevo rearreglo de la ley del Beer-Lambert C=A/ Cualquier valor de absorbancia puede ser fcilmente convertido a una concentracin correspondiente solamente dividiendo la absorbancia por . El uso de la ley del Beer-Lambert es fcil de observar con coloraciones rojas. No es tan fcil visualizar, sin embargo, es preciso para medir longitudes de onda no visibles. Tantas longitudes de onda en el infrarrojo o ultravioleta (UV) pueden ser medidas. La UV es muy til para los bilogos debido a que muchas molculas (todas las protenas y todos cidos nucleicos) absorben luz ultravioleta. Los nicos cambios que se necesita hacer es el uso de celdas de cuarzo en lugar de celdas o tubos de vidrio o plstico. El vidrio y el plstico absorben la luz UV y por lo tanto son inapropiados para el uso en un espectrofotmetro UV. Un equipo capaz de utilizar luz visible (usualmente con una lmpara de tungsteno o halgeno) y luz UV es conocido como un espectrofotmetro UV/Vis.

Espectrofotmetro Balanza analtica Azul de metileno Agua destilada Tubos de ensayo Pipetas Fiolas de 100ml

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1. Experimento N 1: Espectros de absorcin y Longitud de Mxima Absorcin. Previamente se prende el equipo, para que este caliente antes de usarlo. 30 minutos antes es lo correcto. A continuacin se prepara una solucin de Azul de metileno, que ser nuestra muestra a analizar en el espectrofotmetro. La solucin se prepara al 1% (1mg en 100 ml). Luego de ello, una vez calentado el equipo se procede a su calibracin, utilizando una muestra en blanco, en este caso agua destilada. La absorbancia debe marcar 0. A continuacin se procede a la determinacin de la absorbancia en distintas longitudes de ondas, comenzando por 500 nm y asi ir aumentando de 20 en 20 nm COLORANTE Long. De Onda (nm) Abosrbancia 500 550 600 620 AZUL DE METILENO 640 660 680 700 710

2. Experimento N 2: Curva de calibracin El objetivo del presente experimento es poner en evidencia la ley de Lamber-Beer, mediante la construccin de la curva de calibracin para el azul de metileno, usando concentraciones progresivas de este colorante y las absorbancias obtenidas mediante el espectrofotmetro. Se utilizara el mtodo de absorcin visible, que considera longitudes de onda comprendidas entre 330 y 700 nm. A continuacin se prepara en tubos de ensayo, diferentes concentraciones con el colorante respectivamente como se muestra en el recuadro.

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1 0,0 5,0 2 1,0 4,0 3 2,0 3,0 4 3,0 2,0 5 4,0 1,0 6 5,0 0,0

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AZUL DE METILENO(10mg/L) AGUA DESTILADA EN ml

Luego se mide la absorbancia de cada uno a 660 nm de longitud de onda. Cabe resaltar que luego de cada medicin se calibra el equipo con agua destilada despus de cada medicin.
Factor de calibracin= [ ] sustancia/absorbancia de la sustancia

3. Experimento N 3: Concentracin de una muestra desconocida Determinar la concentracin de la muestra de acuerdo: Al factor de calibracin Abs * FC =Concentracin Grficamente mediante la grfica lineal Mediante la ecuacin lineal

Espectros de absorcin y longitud de mxima absorcin, curva de calibracin Preparada la solucin procedemos a medir la solucin con diferentes longitudes de onda, para lo cual se debe respetar los procedimientos respectivos para as asegurar una buena absorcin de la muestra de azul de metileno. Hay que tener en cuenta que para cada muestra distinta hay que colocar una solucin en blanco para as calibrar el espectrofotmetro. longitud de onda 500 550 600 620 640 660 680 700 710 absorbancia 0.001 0.012 0.039 0.049 0.064 0.092 0.065 0.009 0.002

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absorbancia
0.1

0.075

absorbancia ABSORBANCIA

0.05

0.025

0 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 LONGITUD DE ONDA

Como se puede observar, la curva de mayor absorbancia se da a nivel de la longitud de onda de 660 nm dando una absorbancia de 0.092 Determinar el factor de calibracin y la ecuacin lineal Para lo cual se tomar una parte de la solucin principal y se la someter a dilucin
1 0,0 5,0 2 1,0 4,0 3 2,0 3,0 4 3,0 2,0 5 4,0 1,0 6 5,0 0,0

AZUL DE METILENO(10mg/L) AGUA DESTILADA EN ml

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Una vez realiza la disolucin debemos calcular la concentracin de cada tubo para as determinar las concentraciones por mililitro (mg/ml). mg/ml 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 absorbancia a 660nm 0.000 0.052 0.067 0.096 0.115 0.138

absorbancia a 660nm
0.160 0.140 0.120 0.100 absorvancia 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000 0.000 absorbancia a 660nm Linear (absorbancia a 660nm) y = 12.971x + 0.0131 R = 0.9675

0.002

0.004

0.006 mg/ml

0.008

0.010

0.012

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ABSORBANCIA A 660nm
0.160 0.140 0.120 absorvancia 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000 0.000 absorbancia a 660nm Poly. (absorbancia a 660nm) y = 1236x2 + 45,62x + 0,003 R = 0,999

0.005

0.010

0.015

mg/ml

Para determinar el factor de calibracin de muestra solucin debemos tomar en cuenta algunos clculos para tener los datos ms exactos por lo cual tomaremos el cuadro anterior y lo modificaremos para as tener los valores respectivos: C mg/ml 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,030 A absorbancia a 660nm C*A C2 0,000 0 0 0,052 0.000104 0,000004 0,067 0.000268 0,000016 0,096 0.000576 0,000036 0,115 0.00092 0,000064 0,138 0,000138 0,0001 0.468 0.002006 0,00022

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( (

)( )(

)( )

Una vez hallada el factor de calibracin se puede aplicar la siguiente frmula

Determinar la concentracin de la sustancia desconocida

Determinar la concentracin de la muestra de acuerdo: Al factor de calibracin Grficamente mediante la grfica lineal Mediante la ecuacin lineal Para este caso. Debido a que nuestro factor de correccin nos dio un valor negativo, debido a un posible mal calculo no se puede realizar la determinacin de la sustancia desconocida. Por lo que se tomaran lo datos del otros grupo de laboratorio. En este caso se desconoce la concentracin pero hemos medido su absorbancia la cual es 0.372

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Al factor de calibracin

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Grficamente mediante la grfica lineal

0.625 0.600 0.575 0.550 0.525 0.500 0.475 0.450 0.425 0.400 0.375 0.350 0.325 0.300 0.275 0.250 0.225 0.200 0.175 0.150 0.125 0.100 0.075 0.050 0.025 0.000 0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025 0.0030 0.0035 0.0040 0.0045 0.0050 0.0055 0.0060 0.0065 0.0070 0.0075 0.0080 0.0085 0.0090 0.0095 0.0100 0.0105 0.105 0.210 0.310 absorbancia a 660nm 0.453 0.583

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Lo cual nos da una concentracin aproximadamente de acuerdo a la absorbancia de 0.372 Concentracin igual a 0.0066 Mediante la ecuacin lineal

Ecuacin lineal: 57,9857x - 0, 0131

Aplicando la formula obtenemos que la concentracin de la sustancia es de: 0.006641292

Se encontr la curva espectral de un colorante, como el azul de metileno al 1%. Se requiere de clculos precisos para hallar dicha curva espectral, por lo que se tuvo que aplicar mtodos matemticos. Se determin la curva de calibracin y el factor de calibracin mediante concentraciones progresivas del colorante. Cabe resaltar que para hallar dichos datos es necesario que exista exactitud en el momento de los clculos para as evitar errores en las grficas para demostrar cada punto. Esto nos servir como base para el clculo de otras sustancias en las que se necesite del empleo del espectrofotmetro, y de alguna manera realizar los clculos establecidos en este informe.

1. Explique la ley de Beer-Lambert Ley de Bouguer-Beer-Lambert Transmitancia y absorcin de las radiaciones Al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones, por las leyes mencionadas anteriormente, hay una prdida que se expresa con la ecuacin:

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It/Io=T-kdc''

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Donde It , es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoelctrica (llamada radiacin o intensidad transmitida); y Io que es la que intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiacin intensidad incidente) y la relacin entre ambas (T) es la transmitancia. En el exponente, el signo negativo se debe a que la energa radiante decrece a medida que el recorrido aumenta. Donde k es la capacidad de la muestra para la captacin del haz del campo electromagntico, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometra que recorre la radiacin, y c es la concentracin del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta. La ecuacin simplificada de la ley de Beer-Lambert A dc

Comprende a la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbancia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiacin (d) y el factor de calibracin () El factor de calibracin relaciona la concentracin y la absorbancia de los estndares. La absorcin (o absorbancia) es igual a A, la que es el logaritmo reciproco de la transmitancia: A=log1/T lo que es igual a: A=-logT

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Las ecuaciones mencionadas de las leyes son vlidas solo y solo s: La radiacin incidente es monocromtica. Las especies actan independientemente unas de otras durante la absorcin. La absorcin ocurre en un volumen de seccin trasversal uniforme. 2. Explique los tipos de radiacin de acuerdo a la longitud de onda. Las propiedades de absorcin de energa de las molculas pueden ser usadas para medir la concentracin de stas en solucin. Para la mayora de las aplicaciones de laboratorio se utilizan longitudes de onda en el rango ultravioleta (200-400 nm), visible (400-700 nm) o el rojo cercano (700-800 nm).

Rayos X Visible 10-11 10-9 10-7 10-5

Microondas 10-1 101 103

10-3

, cm
Rayos gamma Infrarrojo Ultravioleta Radio

Regiones del espectro magntico

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3. Explique los colores de la luz visible con sus respectivas longitudes de onda. Al incidir radiacin electromagntica visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o totalmente reflejada. En el primer caso el objeto aparecer de color negro y en el segundo de color blanco. Puesto que nosotros percibimos los objetos por medio de la luz reflejada, si hacemos incidir un haz de luz blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, ste absorber ciertas longitudes de onda y reflejar otras, siendo stas ltimas las responsables del color. Se dice que este color (observado) es complementario del que se percibira si la luz absorbida se pudiera detectar. Dado que en la parte experimental de esta prctica las medidas van a realizarse con espectrofotometra visible, es conveniente conocer para qu longitud de onda tiene cada color su mxima absorcin, lo que se muestra en la tabla siguiente:

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Espectro visible
Color (nm)
630 780 590 630 560 590 490 560 450 490 380 - 450

4. Qu es transmitancia? Si se considera que se dispone de una fuente de radiacin que hace llegar a la muestra un haz de radiacin, de longitud de onda previamente seleccionada, cuya potencia es P 0, la muestra de espesor b absorbe una parte de esa radiacin incidente, de forma que la potencia del haz disminuye despus de atravesar la muestra siendo su nueva potencia P. El cociente entre la potencia de la radiacin que sale de la muestra y la de la que incidi sobre ella, se define como transmitancia: T=P/P 0. La transmitancia tambin puede expresarse en tanto por ciento, multiplicando el cociente anterior por 100. Es ms frecuente utilizar el

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concepto de absorbancia, o densidad ptica, que se define como el logaritmo de la transmitancia cambiado de signo: A = log (P 0 /P) = - log T De acuerdo con estas expresiones, si la muestra no absorbe radiacin, P y P 0 coinciden, por lo tanto A=0, y se transmite toda la radiacin T=1 (100% de transmitancia). Si, en otro caso, se transmite solo un 1% de radiacin (T=0.01), P=P 0 /100, la absorcin de radiacin que ha tenido lugar corresponde a A=2.

5. Cules son las ventajas y desventajas de la espectrofotometra? Ventajas Sensibilidad relativa elevada. Facilidad para realizar mediciones rpidas. Grado de especificidad relativamente elevado. Menor tiempo de espera para resultados

Desventajas Variaciones en la absortividad a altas concentraciones (>0.01M) debido a interacciones electrostticas de molculas muy cercanas entre s. Dispersin de la luz debido a la presencia de material particulado en la muestra. Fluorescencia o fosforescencia de la muestra. Cambios en el equilibrio qumico dependientes de la concentracin. Por ejemplo s el analito se asocia, disocia o reacciona con el disolvente en funcin de su concentracin.

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