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Interpretacin de la funcin enzimtica de las protenas a partir de la teora de unidades de nivel de integracin

CHOMIN CUNCHILLOS Fundacin para la Investigacin sobre Biologa Evolucionista Madrid

RESUMEN
La Funcin enzimtica realizada por las protenas globulares que gobiernan las transformaciones metablicas ha sido tradicionalmente interpretada como una catalisis molecular. Esta interpretacin presupone que el enzima acelera las transformaciones qumicas en que interviene sin consumirse, ni material ni energticamente, en ellas , ms en concreto, sin alterar su punto de equilibrio. Sin embargo, los datos aportados por la bioqumica sobre los mecanismos ntimos de las transformaciones metablicas, su dependencia de la temperatura, la vida media de los enzimas, etc.. parecen contradecir esta interpretacin. La interpretacin que la Teora de unidades de niveles de integracin, desarrollada por F. Cordn, hace de las protenas globulares, como unidades de un nivel de integracin intermedio entre el molecular y el celular, permite enfocar el problema de la catalisis enzimtica de un modo nuevo. Una primera consecuencia de este enfoque es que, frente a la diversidad de mecanismos enzimticos descritos para las distintas transformaciones metablicas, Cordn desarrolla un modelo general de transformacin metablica y, correspondientemente, otro de representacin de la misma, vlidos para todas ellas, lo que, entre otras consecuencias, hace posible el anlisis comparado de las transformaciones metablicas y, por lo tanto, la reconstruccin de su despliegue evolutivo.

Introduccin En el captulo anterior, hemos indicado que, segn esta teora, la protena constituye un nivel intermedio entre el molecular y el celular. El objetivo de este trabajo podra haberse centrado en la exposicin de los argumentos que, en nuestra opinin, permiten defender esta hiptesis 1. Sin embargo, somos conscientes de que la trascendencia de la misma slo se puede percibir plenamente desde la propia Teora de unidades de nivel (el hecho de que la protena constituya o no un nivel de integracin puede parecer carente de importancia si se considera desde una perspectiva terica diferente), por esta razn hemos preferido centrar este trabajo en un objetivo que permitiese llamar la atencin sobre alguna de las implicaciones tericas de este supuesto. En este sentido, si consideramos, desde la perspectiva de la Teora de unidades de nivel, que la protena es una unidad de nivel supramolecular, necesariamente, debemos replantearnos todas aquellas explicaciones de la protena fundamentadas en su supuesta naturaleza molecular. Ahora bien, aunque, en general, todas las explicaciones vigentes relativas a las funciones de las protenas mencionan expresamente su carcter molecular, pocas de ellas recurren, explcitamente, a propiedades estrictamente moleculares para explicar las propiedades de las protenas. La interpretacin de la actividad enzimtica como catlisis qumica es una notable excepcin, a cuya consideracin vamos a dedicar este trabajo. Antes de comenzar, conviene dejar claro que con este trabajo nos proponemos : - en primer lugar, exponer algunos hechos relevantes, relativos a la actividad enzimtica, que encajan mal en la interpretacin de los enzimas como catalizadores, en nuestra opinin, como consecuencia de que dicha interpretacin, que viene impuesta por la consideracin de la protena como molcula, hace una interpretacin forzada de estos datos; y, - en segundo lugar, plantear una interpretacin alternativa de la actividad enzimtica, a partir de considerar que la protena es una unidad de nivel supramolecular, as como algunas de sus consecuencias prcticas. Con este doble objetivo 2, a lo largo de este trabajo vamos a tratar de exponer : - en primer lugar, las caractersticas esenciales que debe reunir un catalizador qumico para ser considerado como tal ; - en segundo lugar, algunos datos referentes a la actividad de los enzimas que, en nuestra opinin, hacen sospechar que las protenas con funcin enzimtica no renen las condiciones requeridas para ser consideradas catalizadores qumicos ; - en tercer lugar, la interpretacin de la funcin enzimtica que se deduce de considerar los datos relativos a la misma desde la perspectiva de la teora de unidades de nivel ; y - en cuarto lugar, algunas de las consideraciones que se deducen de la interpretacin anterior y de las perspectivas que abre para la bioqumica y, en general, para la biologa. La catlisis qumica. En este apartado no podemos tratar extensamente todas las caractersticas de la catlisis, slo vamos a exponer, someramente, las que debe reunir cualquier molcula o sistema molecular para ser considerado como catalizador. Con este objetivo, nos parece conveniente comenzar por hacer unas breves consideraciones sobre los mecanismos de las reacciones qumicas. En una reaccin qumica del tipo A + B C + D, la velocidad de reaccin (nmero de reacciones por unidad de tiempo), en el sentido A + B C + D, viene dada por una expresin del tipo : v1 = Z1 P 1 [A]0 [B]0 e(-Q1/RT). Expresin en la que [A]0 y [B]0 representan las concentraciones iniciales de las correspondientes especies moleculares ; P1 y Z1 son dos coeficientes de proporcionalidad que representan, respectivamente, la frecuencia de pares de molculas A y B que se encuentran en la
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En F. Cordn, 1994. Se puede encontrar una exposicin ordenada de estos argumentos. Por lo tanto, queda fuera de los objetivos de este trabajo hacer una crtica exhaustiva de la interpretacin de la funcin enzimtica como catlisis qumica. Dado el enorme desarrollo de la enzimologa tal crtica debera desarrollar crticas parciales a todas y cada una de las explicaciones que la enzimologa ha desarrollado sobre tal supuesto, lo que, por su extensin, queda fuera de la intencin de esta ponencia. 2

posicin relativa 3 adecuada para que tenga lugar la reaccin, y la frecuencia de choques entre pares de molculas A y B. En consecuencia, el producto Z1 P 1 [A]0 [B]0, representa el nmero de colisiones 4 entre pares de molculas A y B que se dan en la posicin adecuada para que pueda tener lugar la reaccin. En cuanto al factor e(-Q1/RT) 5 representa la fraccin de pares de molculas A y B con una energa relativa superior a una dada, Q1, a la que se denomina energa de activacin de la reaccin. Como conclusin podramos decir que para que dos molculas, A y B, reaccionen es necesario que : que choquen, que lo hagan en la posicin adecuada, y con una energa suficiente, superior a la de activacin (Q1).

Conviene detenerse, aunque sea brevemente, en el significado del ltimo de los factores sealados (e(-Q1/RT)). Cuando el resto de las condiciones permanecen constantes, la velocidad de reaccin crece exponencialmente al aumentar la temperatura segn la expresin v = k e(-Q1/RT) (como se representa en la Figura 1). Como hemos indicado, esta relacin entre velocidad de reaccin y temperatura se interpreta suponiendo que Q1 representa un requisito energtico mnimo para que la reaccin tenga lugar, esto es, como la energa mnima de que deben disponer dos molculas, en el momento del choque, para que reaccionen.
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Figura 1

As, se supone que, en el curso de la transformacin de reaccionantes (A + B) en productos (C + D), se pasa, necesariamente, por un estado intermedio (AB*), estado de transicin o estado activado, cuya energa interna es superior tanto a la correspondiente a las molculas de los reaccionantes como a las de los productos (ver la Figura 2), de modo que, para que las molculas A y B reaccionen entre s deben disponer de un exceso de energa (Q1) que, sumado a sus propias energas internas, les permita alcanzar la energa interna correspondiente al estado de transicin. Hay que suponer, adems, que este suplemento de energa, en cuanto que depende de la temperatura, procede de la energa cintica (de traslacin, vibracin o rotacin) de las molculas

El trmino posicin es una imprecisin, conscientemente utilizada, a la que habra que dotar de contenido. En este factor, junto con aspectos espaciales y estructurales, habra que considerar tambin, por ejemplo, las interacciones de tipo electrosttico entre las distintas partes de las molculas reaccionantes, caracteres, todos ellos, difcilmente cuantificables. 4 Hablar de colisiones o choques entre molculas no deja de ser una analoga, referida al comportamiento de los cuerpos macroscpicos, hay que entender que con esta denominacin nos referimos a los encuentros entre molculas y a las interacciones que tienen lugar, en ellos, entre las diferentes partes de las molculas. 5 Expresin en la que R es la constante de los gases perfectos R=0,08206 atmsferas litro / K mol ; e es la base de los logaritmos naturales e = 2,71828, T representa a la temperatura, y Q es un valor, caracterstico de cada reaccin, al que se denomina energa de activacin de la reaccin. 3

reaccionantes. Bajo este supuesto, en el proceso de cada reaccin se pueden considerar dos fases (como se indica en la Figura 2):
AB* Q1

A+B

Q2 dH

C+D

II

Figura 2

Por otra parte, la energa de activacin sugiere una interpretacin del proceso de la reaccin en trminos de termodinmica. Esta interpretacin supone la existencia de un estado de transicin (AB*) intermedio entre la configuracin de las molculas correspondientes antes de la reaccin (A + B), y la de los productos de la reaccin (C + D), con una energa interna superior a la de las configuraciones de los substratos y de los productos. De acuerdo con esto, el proceso tendra lugar en dos fases (Figura 2). I. Una primera, en la que las molculas reaccionantes (A + B) alcanzan la energa interna correspondiente al estado de transicin (AB*) a expensas de sus propias energas internas y de una cantidad Q1 de energa procedente de sus respectivas energas cinticas. I. Una segunda fase en la que el estado de transicin (AB*) se transforma en los productos, liberando, como energa cintica de estas molculas, una cantidad Q2 de energa. En la reaccin en sentido contrario C + D A + B, cuya velocidad de reaccin viene dada por la expresin : v2 = Z2 P 2 [C]0 [D]0 e(-Q2/RT), tendra lugar el proceso inverso en el que se pueden diferenciar otras dos fases (Figura 3):
CD* = AB*

Q1

A+B

Q2

dH

C+D

II

Figura 3

I. En la que las molculas reaccionantes (ahora, C + D) alcanzan el estado de transicin (CD* = AB*) consumiendo para ello una cantidad Q2 de energa procedente de sus respectivas energas cinticas.

I. Una segunda fase en la que el estado de transicin (AB*) se transforma en los correspondientes productos (A + B) liberando, como energa cintica de los mismos, una cantidad Q1 de energa. Lgicamente, el balance energtico de una reaccin en el sentido A + B C + D, (Q2 - Q1 = H), es igual y de sentido contrario al de una reaccin en el sentido inverso C + D A + B, (Q1 - Q2 = -H). Si consideramos la situacin de equilibrio qumico, en la que el nmero de reacciones en ambos sentidos se compensa (v1=v2), tendremos la siguiente igualdad: Z1 P 1 [A]e [B]e e(-Q1/RT ) = Z2 P 2 [C]e [D]e e(-Q2/RT) expresin en la que [A]e, [B]e, [C]e y [D]e representan las correspondientes concentraciones en el equilibrio. Si reordenamos esta expresin se obtiene la siguiente : Z1 P 1 e(-Q1/RT) / Z2 P 2 e(-Q2/RT) = [C]e [D]e / [A]e [B]e = Ke donde Ke recibe el nombre de constante de equilibrio de la reaccin. Sus dos expresiones matemticas reflejan los dos aspectos del equilibrio qumico : Ke = [C]e [D]e / [A]e [B]e, nos indica que, en el equilibrio qumico, las concentraciones de las molculas reaccionantes y productos se mantienen constantes, aunque se sigan dando transformaciones en ambos sentidos (lgicamente, en el mismo nmero), como se puede comprobar utilizando istopos radiactivos. Ke = Z1P 1e(-Q1/RT)/Z2P 2e(-Q2/RT) = (Z1 P 1/ Z2 P 2)e(H/RT), refleja el hecho de que el equilibrio qumico represente un equilibrio termodinmico, en el que no hay perdida ni ganancia neta de energa, la cantidad de calor (Q2 - Q1 = H) aportada por cada reaccin en el sentido A + B C + D, se compensa exactamente con la cantidad consumida por cada reaccin en sentido contrario (Q1 - Q2 = H). Aunque estas consideraciones estn hechas pensando en una reaccin qumica bimolecular (colisional) son, en lo esencial, igualmente vlidas para transformaciones monomoleculares (intramoleculares), en las que la reaccin no depende directamente de los choques entre molculas (aunque estos puedan jugar un papel en la desestabilizacin de las molculas ). En estas transformaciones es de suponer que el nmero de choques y la posicin de las molculas en ellos contribuyen poco a que la reaccin tenga lugar, y lo mismo cabe pensar de la contribucin de la energa cintica de traslacin de las molculas para que stas alcancen el estado activado (salvo en lo que tal energa colabore, a travs de choques, a la desestabilizacin de dichas molculas). Hay que pensar, pues, que el estado activado, en este tipo de reaccin, se alcanza, fundamentalmente, a expensas de otros tipos de energa cintica molecular (de vibracin o de rotacin). Generalizando, se puede decir que, en la medida en que una reaccin qumica mantenga una dependencia de la temperatura del tipo descrito (el representado por una ecuacin del tipo v = k e(-Q/RT)), debemos pensar que el calor colabora a que las molculas reaccionantes alcancen el estado activado y, en consecuencia, que la energa interna de este estado se logra a expensas de algn tipo de energa cintica molecular, sea esta de traslacin, vibracin o rotacin. Los catalizadores Para que una molcula, o un sistema de ellas, pueda ser considerado un catalizador es necesario, por una parte, que acelere la reaccin y, por otra parte, que no cambie en el transcurso de la misma. El mecanismo de la catlisis, cualquiera que sea, no puede suponer gasto alguno (ni energtico, ni material) por parte del catalizador. Por lo tanto, un catalizador no puede cambiar el equilibrio qumico de una reaccin ya que, por tratarse de un equilibrio termodinmico, cualquie r desplazamiento del mismo supone un gasto de energa. Como consecuencia, si un catalizador aumenta la velocidad de la reaccin en un sentido debe aumentarla, en la misma proporcin, en el contrario ; esto es, se debe cumplir que v1/v2 = v1/v2 (donde v 1 y v2 son las velocidades de la reaccin en presencia del catalizador). En definitiva, una
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reaccin catalizada tiende a la misma situacin de equilibrio que sin catalizar, pero alcanza dicha situacin ms rpidamente. Los catalizadores pueden aumentar l a velocidad de una reaccin modificando cualquiera de los factores de los que sta depende, siempre y cuando los efectos sean los mismos en los dos sentidos de la reaccin. As, los catalizadores pueden proceder, por ejemplo, facilitando el nmero de choques o la posicin adecuada de las molculas reaccionantes en los mismos (siempre, claro est, en igual proporcin en los dos sentidos de la reaccin). Otra de las formas en que puede actuar un catalizador es disminuyendo el nivel energtico del estado activado (como se indica en la figura 4, en la que la lnea discontinua representa el progreso de la reaccin catalizada), de esta manera disminuyen, en la misma proporcin, las energas de activacin en los dos sentidos de la reaccin sin que se modifique su diferencia (Q1 - Q2 = Q1 - Q2 = H) y, consecuentemente, aumenta en igual proporcin el nmero de molculas de reaccionantes y de productos con energa cintica suficiente para superar la barrera energtica representada por el estado de transicin (estado activado). Muchos catalizadores modifican simultneamente varios de los factores citados (por ejemplo, una posicin ms favorable de las molculas en el momento del choque es de esperar que disminuya la energa requerida para alcanzar el estado activado). Probablemente, esta sea la forma en que actan algunos catalizadores de adsorcin, produciendo un aumento de la velocidad de reaccin como consecuencia: 1. de aumentar el nmero de choques entre reaccionantes (aumentar la concentracin eficaz de los mismos), 2. de favorecer la posicin adecuada de las molculas reaccionantes en el choque (disminuir la dificultad entrpica de la reaccin) 3. y de disminuir los requerimientos energticos de la reaccin. Cuando esto ocurre, es posible, que el catalizador, simultneamente, provoque una restriccin de los movimientos de las molculas reaccionantes, disminuyendo, en consecuencia, su energa cintica de traslacin (y, tal vez, las de vibracin y rotacin), pero, cualquiera que sea el mecanismo de la catlisis, en la medida en que la velocidad de reaccin catalizada mantenga una relacin de tipo exponencial respecto a la temperatura (del tipo, v = k e(-Q/RT)),la energa necesaria para que las molculas reaccionantes alcancen el estado de activacin debe proceder de su energa cintica (ste parece ser el significado de la relacin v = k e(Q/RT) 6 ) .
AB* AB' * Q1 Q' 1 A+B

Q2 dH

Q' 2

C+D

II

Figura 4

La afirmacin anterior es vlida siempre. nicamente en el caso en que la catlisis anulase totalmente la barrera energtica que representa el estado de activacin (si Q1 = 0) la reaccin tendra
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En algunos tipos de reacciones (por ejemplo. las sensibles a la luz) el estado de activacin se alcanza a expensas de una energa diferente a la trmica, pero en estos casos la velocidad de reaccin depende de la temperatura de forma, tambin, diferente a la sealada. 6

lugar sin consumir energa cintica de las molculas reaccionantes 7(como representa la lnea fina continua de la Figura 4), pero en este caso la velocidad de la reaccin en ese sentido (v1) perdera su dependencia exponencial respecto a la temperatura 8: v1 = P1 Z1 [A]e[B]e e0 = P1 Z1 [A]e[B]e Las transformaciones enzimticas Para explicar el funcionamiento de los enzimas, se describen cuatro tipos principales de mecanismos (vanse, por ejemplo, Walsh, 1977 y Jencks, 1969, 1975, 1981, Reuben, 1971, Hanson y Rose, 1977): La contribucin entrpica a la catlisis. La catlisis por intermediarios covalentes. La catlisis general cido-base. La catlisis por tensin o deformacin. Vamos a considerar brevemente algunos de los datos disponibles referentes a estos mecanismos postulados. Bajo la denominacin de contribucin entrpica a la catlisis se renen los datos relativos, fundamentalmente, a tres aspectos: la aproximacin de los substratos entre s; la mayor duracin del complejo enzima-substrato respecto a la de un choque simple entre molculas ; y la restriccin de los movimientos de los substratos. Entre otras cosas parecen probados los siguientes hechos : - Dentro del centro activo los metabolitos permanecen quietos, en una posicin fija, de modo que desaparecen incluso los movimientos intramoleculares de rotacin y vibracin. - La posicin de un metabolito respecto a los dems es fija y muy precisa y las distancias entre los tomos de diferentes molculas son equivalentes a las distancias entre tomos de la misma molcula (del orden del ). - El tiempo de duracin del proceso enzimtico es entre 106 y 109 veces mayor que el de una reaccin qumica producida por colisin molecular. Respecto al segundo grupo de mecanismos citados, los que se refieren a los intermediarios covalentes, slo vamos a sealar que en el transcurso de algunas transformaciones enzimticas se ha observado la formacin de uniones covalentes transitorias entre los metabolitos y los coenzimas o algn grupo prosttico del enzima. El tercer grupo de mecanismos se refiere a la catlisis general cido-base, que supone la cesin, observada en numerosos casos, de hidrogeniones por parte del enzima a los metabolitos. Como indicamos ms adelante, en nuestra opinin, este hecho puede ser ms general de lo que se supone. El ltimo grupo de mecanismos se refiere a que, en muchos casos, se ha observado que los metabolitos, dentro del centro activo, no se encuentran en su estado de mnima energa, sino que parecen estar sometidos a tensiones y deformaciones que, verosmilmente, colaboran a facilitar la reaccin. Hay que sealar que, aunque todos los mecanismos postulados surgen de observaciones ms o menos puntuales, algunos de entre ellos (por ejemplo, los relativos a la posicin de los metabolitos dentro del centro activo, el estado de congelacin de sus movimientos), en nuestra opinin, se deben considerar caractersticas generales de todas las transformaciones enzimticas, mientras que otros (por ejemplo, la existencia de intermediarios covalentes) slo tienen lugar en algunas de ellas.

Este supuesto se correspondera con un sistema en el cual dos molculas no tuvieran que cumplir ningn requisito energtico para reaccionar, de forma que lo hiciesen, independientemente de su energa cintica, siempre que se produjese su colisin en la posicin adecuada. Si tuviramos la misma situacin para una reaccin monomolecular habra que concluir que las molculas iniciales son inestables a cualquier temperatura y, por consiguiente, sera de esperar que el equilibrio de la reaccin estuviera muy desplazado hacia la formacin de productos, la presencia de molculas iniciales (reaccionantes) slo estara mantenida por su produccin a partir de las molculas productos (que s depende de la temperatura). 8 La velocidad de reaccin (v 1) seguira dependiendo de la temperatura en cuanto que el nmero de choques (P1) depende de la temperatura, tambin, pero esta dependencia no es de tipo exponencial . 7

Hay que destacar un ltimo aspecto en lo referente a los mecanismos propuestos para explicar la accin enzimtica: en todas las transformaciones enzimticas para las que se dispone de suficiente informacin, la transformacin de los metabolitos se puede resolver en una secuencia de estados intermedios en la transformacin separados entre s por movimientos lineales de pares de electrones 9, secuencia que es fija y caracterstica para cada una de las transformaciones enzimticas estudiadas. En nuestra opinin, este hecho debe considerarse como una caracterstica general de las transformaciones enzimticas, esto es, pensamos que todas ellas se pueden resolver en una secuencia de ese tipo. Algunos de estos datos, en concreto los relativos a la tensin y deformacin a que son sometidos los metabolitos, a su estricta ordenacin dentro del centro activo y a la paralizacin de sus movimientos 10, en nuestra opinin, no corresponden al comportamiento esperado de un catalizador. Veamos. - Dado que los metabolitos en la disolucin se mueven, tanto unos respecto a otros (movimientos de translacin y rotacin molecular), como con movimientos intramoleculares (de vibracin y rotacin interna), el hecho de que en el momento en que tiene lugar la reaccin molecular, los metabolitos en el centro activo del enzima, permanezcan quietos, supone que deben ser frenados, orientados y desplazados, hasta ser situados, quietos, en el centro activo, lo que tiene que requerir un gasto de energa. (Lo mismo cabe decir, cuando se produce, de la tensin y deformacin de los metabolitos.) Adems, este gasto no ser fijo ya que no es fijo el estado energtico de partida de las molculas, que se mueven desordenadamente dentro de la disolucin. - Adems, si, como parece, los metabolitos en el centro activo estn quietos y prximos, por un lado, parece evidente que la dificultad entrpica de la reaccin, la debida a las posiciones relativas de los reaccionantes, disminuye y, con ello, se facilita la reaccin, pero, por otro lado, desaparece, tambin, la fuente de energa que permite alcanzar a los reaccionantes la energa interna correspondiente al estado activado que, en una reaccin no enzimtic a, se salva a costa de energa cintica de los reaccionantes. Cul puede ser el mecanismo que permita alcanzar el estado de activacin en dos molculas quietas ?. - Finalmente, si las molculas, antes de tener lugar la reaccin, deben pasar de un estado energtico variable a otro de mnima energa, no se justifica, en nuestra opinin, la dependencia exponencial de la velocidad de reaccin respecto a la temperatura. Cul puede ser en este caso el papel de la temperatura ?
V

Toptima

Figura 5

Salvo en aquellas transformaciones en las que intervienen coenzimas del tipo de los hemo (clorofilas, citocromos, cobalamina,..) donde el movimiento puede afectar a electrones individualizados. 10 Todos ellos son rasgos caractersticos de la transformacin enzimtica, que sin duda contribuyen a asegurar el encuentro en la posicin adecuada de los metabolitos reaccionantes, aumentando la concentracin eficaz y disminuyendo la dificultad entrpica de la reaccin. 8

De hecho, la velocidad de las reacciones enzimticas no crece exponencialmente con la temperatura, sino que, para cada transformacin, existe una temperatura ptima para la que la velocidad de reaccin es mxima (vase la Figura 5) por encima de la cual la velocidad disminuye. La enzimologa actual interpreta esta curva como el resultado de dos procesos independientes y simultneos de signo contrario (Laidler y Peterman, 1983): por una parte, la velocidad de reaccin, en la reaccin enzimtica, tendra una dependencia de la temperatura, tpica, de tipo exponencial (como la mostrada en la Figura 1) ; y simultneamente, segn esta interpretacin, se dara un proceso de inactivacin trmica del enzima que se opondra al efecto anterior (Figura 6).(Este segundo proceso tambin mostrara una dependencia de tipo exponencial respecto a la temperatura 11).
Enzyme active

Figura 6

El resultado de la composicin de estos dos procesos sera un comportamiento del tipo descrito en la Figura 5. Esta interpretacin de la relacin entre velocidad de la reaccin y temperatura, en nuestra opinin, es consecuencia de la interpretacin del enzima como catalizador (que, a su vez, viene impuesta por la de la protena como molcula). Nos parece paradjico, por ejemplo, que la baja velocidad de reaccin que la mayora de las transformaciones enzimticas tienen a bajas temperaturas se atribuya a la escasa reactividad que los metabolitos presentan a esas temperaturas y se corresponda, segn esta interpretacin, con una elevada actividad del enzima. La crioenzimologa nos suministra algunos datos que ponen de manifiesto ms claramente esta paradoja : Mediante la combinacin de criosolventes y bajas temperaturas se ha conseguido mantener la actividad de numerosos enzimas a temperaturas alrededor de -100C. En estas condiciones las transformaciones enzimticas tienen lugar tan lentamente que, recurriendo a estas tcnicas, se pueden estudiar los pasos intermedios de la transformacin, pudiendo aislarse los complejos enzima-metabolito correspondientes a los metabolitos intermedios. De acuerdo con la interpretacin que estamos considerando, esta lenta velocidad de reaccin se debe corresponder con una elevadsima actividad enzimtica, casi la mxima, que se vera frenada por la escasa reactividad de los metabolitos. Por otra parte, esta explicacin entra en contradiccin con la que se hace del papel de los criosolventes en estos experimentos, que parecen cumplir una funcin conservadora de la estructura del enzima (y, con ello, de su actividad) que tiende a perderse con las bajas temperaturas (Fink y Geeves, 1983) Cmo puede, la actividad enzimtica a bajas temperaturas, tender a perderse y, simultneamente, ser cada vez ms elevada ? Por otra parte, si la velocidad de reaccin dependiera, como se propone, de la energa cintica de los metabolitos (de la temperatura de la disolucin) de la misma forma que lo hace en las reacciones no enzimticas, sera de esperar que esa energa se usara para desencadenar la reaccin. No slo no parece
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De acuerdo a esta interpretacin la energa de activacin de la reaccin sera mucho menor que la energa de inactivacin del enzima, esto explicara que el efecto de sta slo se dejara sentir a partir de una temperatura relativamente elevada. 9

ser as, sino que, si los metabolitos van a ser frenados al entrar en el centro activo, parece que cuanto mayor sea su energa cintica mayor ser el trabajo requerido para inmovilizarlos, esto es, mayor ser la dificultad energtica asociada a su transformacin. En cualquier caso , no entendemos qu relacin puede guardar el estado de movimiento de los metabolitos (su energa cintica) antes de entrar en contacto con el enzima con su transformacin en el centro activo, si la entrada va seguida siempre de su desaceleracin hasta quedar inmovilizados en el centro activo. As pues, el comportamiento de la velocidad de reaccin respecto a la temperatura en las transformaciones enzimticas no justifica, en nuestra opinin, una interpretacin cintica de las mismas como la propuesta para las reacciones no enzimticas. Un argumento relacionado con el anterior es el que se refiere a la vida media de los enzimas. La conservacin de los enzimas, una vez purificados, se lleva a cabo a bajas temperaturas, esto es, en condiciones en que la actividad enzimtica es nula o muy pequea, a estas temperaturas la vida media de un enzima puede ser desde varias horas a aos. Cuando las protenas con funcin enzimtica se mantienen a temperatura ambiente y su capacidad funcional es normal, su vida media es mucho menor. Walsh (1977) da como ejemplo una vida de 24 horas para un enzima con un nmero de recambio de 106/sg., lo que da un nmero total de transformaciones de 864 109 por partcula de enzima. Walsh interpreta que un nmero tan enorme de transformaciones justifica el carcter de catalizador del enzima. Ahora bien, siendo rigurosos, el nmero de reacciones en las que puede intervenir una molcula de un catalizador, puesto que no se consume en el ciclo reactivo, debe de ser infinito. El hecho de que el enzima pierda su capacidad cataltica al cabo de unas horas de actividad, indica que no se comporta de esa manera. Existe an otro aspecto de la transformacin enzimtica que, en nuestra opinin, supone una dificultad aadida para la interpretacin del enzima como catalizador, nos referimos a la distinta naturaleza que parecen tener las dos fases de la transformacin, cuando sta es llevada a cabo por enzimas. En una reaccin no enzimtica: A+ B + Q1 AB* C + D - Q2, el paso de los reaccionantes (A+B) al estado de transicin (AB*) consume una energa Q1, que se obtiene de la energa cintica de A y B. A su vez, en la segunda parte de la reaccin, se libera una energa Q2 en forma de energa cintica de los productos. De forma que el balance final de energa ser : dE = Q1 - Q2. Si consideramos la misma reaccin pero con intervencin de un enzima (E) : E+A+B E(AB*) E+C+D, los mecanismos descritos, al menos los referentes a la tensin y deformacin de los metabolitos, la congelacin de sus movimientos de traslacin, vibracin y rotacin, su orientacin y colocacin en el centro activo, parecen sugerir que la primera parte de la transformacin requiere un aporte de energa que (en cuanto que se pasa de unas condiciones variables : la llegada de los substratos al enzima con velocidad y en posicin aleatoria, a unas condiciones, ms o menos, fijas : los substratos ordenados, situados en la posicin adecuada y activados, dentro del centro activo) parece que tiene que ser variable; mientras que la segunda parte (en la que se parte de unas condiciones fijas : los substratos activados en el centro activo, para llegar a otras que, al menos en principio, tambin, son fijas : los productos abandonados en la disolucin) parece consistir en un proceso constante. Cualquier interpretacin del enzima como catalizador debe explicar cmo se puede recuperar en la segunda parte, aparentemente un proceso fijo, la cantidad de energa consumida en la primera parte, variable de reaccin a reaccin.

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Interpretacin de la funcin enzimtica a partir de la teora de unidades de nivel de integracin Desde el punto de vista de la Teora de unidades de niveles de integracin, esto es, considerando a las protenas como unidades de nivel directamente supramolecular, las transformaciones enzimticas no son reacciones catalizadas. Evidentemente, los enzimas aceleran las transformaciones en que intervienen, pero, en nuestra opinin, esto debe suponer, por su parte, la realizacin de un trabajo. A continuacin, consideramos, desde este enfoque, algunos aspectos de la transformacin enzimtica. Balance energtico de las transformaciones enzimticas. Desde un punto de vista energtico (y considerando las condiciones de experimentacin in vitro, esto es, metabolitos y enzimas disueltos), el desarrollo de cada transformacin enzimtica, segn esta interpretacin, podra ser representado en coordenadas de reaccin como en la Figura 7 12.
AB* W1

A+B

Q2

C+D

II

Figura 7

I. En la primera parte de la transformacin, la protena realiza un trabajo recogiendo los substratos de la disolucin (A+B), desplazndolos, frenando sus movimientos de translacin, rotacin y vibracin, y activndolos para que alcancen el estado de transicin (AB*). Cuando la transformacin tiene lugar in vitro, este trabajo, en nuestra opinin, debera ser variable de una reaccin elemental a la siguiente, en cuanto que son diferentes las condiciones de llegada (velocidad, posicin, etc..) de los substratos de una a otra vez. II. En la segunda parte de la transformacin las molculas reaccionantes pasan del estado activado (AB*), con un contenido energtico elevado, a los metabolitos productos (C+D), liberando calor en la disolucin. Hay que sealar, aunque en la Figura 7 no se manifieste, que la primera etapa debe durar mucho ms que la segunda e incluye una sucesin de acciones enzimticas sobre la molcula (captacin, desplazamiento, activacin), mientras que la segunda etapa consiste en la reaccin molecular en sentido estricto y tiene la duracin de una vibracin molecular, del orden de 10-13seg.. Este hecho es un reflejo de que la primera etapa tiene lugar entre dos niveles distintos, uno manejado por el otro, mientras que la segunda tiene lugar enteramente dentro del nivel molecular ; y, por otra parte, justifica la mayor duracin de la transformacin enzimtica, respecto a la no enzimtica. Otro rasgo a destacar de esta interpretacin es que, mientras que en las reacciones qumicas no enzimticas la primera y la segunda fase compensan sus energas estadsticamente, en el proceso enzimtico ambas energas tienen un carcter distinto (una es trabajo enzimtico y la otra calor molecular) por lo que no se pueden compensar. En un balance energtico correcto de estas transformaciones habra
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En realidad el esquema de la Figura 7 correspondera a una transformacin enzimtica en la que slo se diera un paso elemental (ver ms adelante). En en el caso ms general de transformacin enzimtica se dan varios pasos elementales sucesivos, lo que supone varios procesos de activacin de los metabolitos, llevados a cabo por el enzima, separados por otros tantos procesos de reaccin entre los metabolitos. La curva de coordenadas de reaccin tendra, en consecuencia, varios mximos, correspondientes a varias energas de activacin. 11

que considerar por separado lo que ocurre en el enzima y lo que tiene lugar en el sistema molecular. Esto es, por un lado, el enzima realiza un trabajo (W) y no se recupera de l, por lo tanto, debe de sufrir un desgaste paulatino ; por otro, el sistema molecular (la disolucin) recibir un aporte de energa (Q). Velocidad de reaccin y temperatura en las transformaciones enzimticas. En cuanto a la curva representada en la Figura 5, en nuestra opinin, refleja un fenmeno de adaptacin del enzima a la temperatura (que tiene su correspondencia por ejemplo, en la adaptacin del metabolismo a la temperatura, en clulas y animales), pero no de forma estadstica13, como debemos suponer que ocurre si atribuimos a la desnaturalizacin trmica del enzima un comportamiento ajustado a una ecuacin del tipo v=Ke-Q/RT . En nuestra opinin, la adaptacin trmica debe afectar de forma parecida a la mayor parte de las partculas de enzima (una disminucin de, por ejemplo, un 20% en la velocidad de reaccin global, en nuestra opinin, refleja, en lugar de un 20% de partculas de enzima inactivas, una disminucin de un 20% en la actividad de cada protena enzimtica). Segn esta interpretacin, cuanto ms lejos se encuentre una protena enzimtica de su temperatura ptima (por encima o por debajo) menor ser su actividad y, en consecuencia, la velocidad de reaccin variar respecto a la T dando una curva en forma de campana alrededor de la T ptima (muy semejante a la que se obtiene variando el pH y que, a su vez, refleja la adaptacin de la protena al pH). En cuanto a la desnaturalizacin trmica de los enzimas, la enzimologa actual considera dos procesos : - Un proceso reversible en el que, como consecuencia del calentamiento del enzima, se produce: 1) una prdida de actividad enzimtica cuando la T supera a la T ptima ; y 2) algunos cambios estructurales que afectan, sobre todo, a la estructura globular (terciaria) de la de la protena y que se pueden registrar por ejemplo mediante tcnicas de espectroscopia. - Un proceso irreversible que tiene lugar a temperaturas en general altas y en un margen ms o menos estrecho de temperatura y que se puede considerar un fenmeno brusco. El primero de estos dos procesos habra que interpretarlo, en nuestra opinin, como un proceso de adaptacin de la protena a la T, y, como hemos sealado antes, afectara por igual a todas las partculas enzimticas (esto es, todas - casi todas- sufriran cambios estructurales y, simultneamente, cambios en su actividad enzimtica). As pues, nos encontramos con dos interpretaciones diferentes del comportamiento de la velocidad de reaccin en funcin de la temperatura : la vigente, como combinacin de dos efectos independientes contrapuestos (aumento de la velocidad de reaccin como consecuencia del aumento de temperatura y progresiva desnaturalizacin trmica del enzima) ; y la que acabamos de exponer. Por ejemplo, para los puntos A, B y C, sealados en la Figura 8, tendramos :
V B

Toptima

Figura 8
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Segn esta interpretacin, la disminucin de la velocidad de reaccin que acompaa al aumento de temperatura, una vez superada la ptima, se debe atribuir a que haya ms partculas de enzima inactivas -desnaturalizadas. 12

En A, segn la interpretacin vigente, la baja velocidad de reaccin es la consecuencia de una gran proporcin de enzimas, plenamente activos, que actan sobre unos substratos poco reactivos, todo ello como consecuencia de las baja temperaturas. Para nosotros, por el contrario, en A la situacin refleja la accin de la mayor parte, si no todo, del enzima con una actividad muy baja. Si consideramos el enzima como un catalizador, la situacin representada en B es consecuencia de la combinacin de una proporcin de enzima activo menor que en A, favorecida por unos substratos ms activados trmicamente (lo que, en nuestra opinin, se contradice con la congelacin de movimientos del substrato en el centro activo, observada experimentalmente). Segn nuestra interpretacin, en B tendramos la mayor parte del enzima actuando con la mayor intensidad. De acuerdo con la interpretacin vigente, la baja actividad en C se debe a que queda muy poca cantidad de enzima activo, que acta sobre un substrato muy activado trmicamente. En nuestra opinin, en C estara actuando la mayor parte del enzima con una intensidad muy baja. Los mecanismos de las transformaciones enzimticas. En cuanto al curso de cada transformacin enzimtica, e l conocimiento que la bioqumica ha acumulado, a lo largo de este siglo, permite sacar las siguientes conclusiones, vlidas para todas las transformaciones metablicas: 1. tienen lugar en zonas especficas de protenas globulares (los centros activos); 2. son elementales, esto es, en cada centro activo se produce, por vez, una transformacin de sendas molculas de metabolitos substratos en sendas molculas de metabolitos productos; 3. en los citados centros activos, los metabolitos estn siempre situados en una posicin muy precisa en la que las distancias entre los tomos de las diferentes molculas son del mismo orden que las distancias entre tomos contiguos dentro de una molcula (el del ), adems, todas las molculas tienen impedidos sus movimientos. 4. Para todas las transformaciones enzimticas para las que disponemos de datos suficientes se puede establecer una serie de pasos intermedios entre substratos y productos, cada uno de ellos separado del siguiente por un movimiento lineal de pares de electrones entre dos puntos del complejo formado por los metabolitos reaccionantes, lo que resuelve la accin enzimtica en una secuencia, fija para cada funcin enzimtica, de desplazamientos lineales de pares de electrones, caracterstica de cada transformacin 14. A partir de los datos anteriores, que, en nuestra, opinin son aplicables a todas las funciones enzimticas, es posible reconstruir el siguiente modelo general de transformacin enzimtica : 1. Los metabolitos captados por el enzima son conducidos al centro activo y situados en una posicin caracterstica muy precisa, la conveniente para que tenga lugar la transformacin. 2. A continuacin, el enzima activa los metabolitos actuando sobre ellos (con toda probabilidad, como sealamos ms adelante, a travs de la conveniente polarizacin de algunos grupos qumicos correspondientes a ciertos restos aminocidos del centro activo), produciendo una secuencia, fija para cada funcin enzimtica, de desplazamientos de pares de electrones que provoca la rotura de algunos enlaces y la formacin de otros y que concluye con la transformacin de los metabolitos iniciales en otros, los productos. 3. Finalmente, los metabolitos producidos son sacados del centro activo que queda en la misma situacin que al comienzo, esto es, disponible para una nueva transformacin. Con arreglo a esta descripcin F. Cordn ha desarrollado un modelo de representacin que puede aplicarse, sin exclusin, a todas las transformaciones metablicas, lo que permite su comparacin , fundamental para reconstruir su filogenia (como consideramos en otra ponencia , vase Evolucin del metabolismo celular), y que tambin permite reconstruir razonablemente las secuencias de

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Como vemos ms adelante, a travs del metabolismo comparado, esta secuencia se puede deducir razonablemente para cualquier funcin enzimtica de las que hemos estudiado (F. Cordn 1990). 13

desplazamientos de pares de electrones caractersticas de funciones enzimticas para las que no se dispone de suficientes datos directos (F. Cordn, 1990). En este modelo (Figura 9), los metabolitos se representan por sus frmulas desarrolladas o semidesarrolladas (segn sea el nivel de detalle con el que se quiera analizar la transformacin metablica en cuestin), que se sitan, unas respecto a otras, en una posicin que intenta reflejar la que tiene lugar en el centro activo de la correspondiente protena.

Figure 9. Modelo de representacin

Como se explica en Evolucin del metabolismo celular, los metabolitos pertenecientes a los sectores bsicos del metabolismo celular presentan una porcin constante a lo largo de las rutas metablicas, caracterstica para cada sector metablico : un carboxilo en el sector de los aminocidos, un fosforilo en el de los azcares y un coenzima A en el de los cidos grasos. Por razones que se exponen en la citada ponencia, Cordn denomina partes proximales a estas porciones fijas. Con el fin de mantener un criterio de orden en la representacin de todas las transformaciones metablicas, representamos siempre estas partes proximales hacia la izquierda, de forma que el resto del metabolito (su parte reactiva o distal) queda situado hacia la derecha. Finalmente se unen los extremos de las partes proximales con lneas discontinuas, lo que permite, por una parte, representar la unin de los metabolitos al centro activo del enzima, por fuerzas de van der Waalls, y, por otra, unificar cada paso de la representacin. Como hemos indicado, a partir de este modelo de representacin es posible realizar una labor sistemtica de comparacin entre las transformaciones enzimticas, lo que nos ha permitido : 1. Deducir las secuencias de desplazamientos de pares de electrones para las transformaciones para las que no disponamos de datos suficientes, lo que, en nuestra opinin, apoya el carcter general del modelo de transformacin propuesto. 2. Deducir la filogenia del ncleo central del metabolismo celular (como exponemos en Evolucin del metabolismo celular. Finalmente, aplicando este modelo, podemos incorporar el centro activo a la representacin de la transformacin (siempre que dispongamos de suficientes datos sobre su estructura), lo que nos permite hacernos una idea de la forma en que el enzima interviene en la transformacin de los metabolitos. Tomemos como ejemplo la triosa-fosfato-isomerasa, enzima que gobierna la transformacin de gliceraldehdo en dihidroxiacetona (Figura 10) y sobre la que Knowles (1991) ha realizado una excelente revisin que aporta numerosos datos de detalle (este trabajo es, en nuestra opinin, uno de los pocos estudios de centros activos que ofrecen un nivel de detalle suficiente para hacer este tipo de consideraciones).

Figura 10. Transformacin de gliceraldehdo en dihidroxiacetona. 14

De los datos que nos ofrece Knowles podemos deducir que hay, al menos tres zonas del centro activo cuya estructura debe conservarse para que la transformacin tenga lugar con normalidad: 1) un bucle formado por una secuencia de 10 restos de aminocidos entre las posiciones 166 y 176, que parece suministrar una unin por puentes de hidrgeno al grupo fosforilo del substrato; 2) un resto de glutmico (Glu 165) cuyo carboxilo libre est situado de manera que su oxigeno se encuentra a una distancia de alrededor de 3 de los carbonos C1 y C2 del gliceraldehdo , cuando ste ocupa su lugar en el centro activo, y que, en la transformacin, parece actuar como base y ser responsable de la sustraccin del H+ en C2; y 3) un resto de histidina (His 95) cuyo N en est a una distancia de 3 de los oxgenos unidos a los carbonos C1 y C2 y que parece actuar como polo electrfilo en la transformacin (en la Figura 11 se recogen estos datos esquemticamente) 15.

Figura 11. Esquema del centro activo de la triosa-fosfato-isomerasa ocupado por el gliceraldehdo.

De todo ello, y teniendo en cuenta la secuencia de desplazamientos de electrones caracterstica de esta transformacin (representada en la Figura 10), se puede deducir que, durante la transformacin, en el centro activo de este enzima se deben producir los cambios que representamos en la Figura 12. A partir de esta figura, parece sugerente pensar que cada uno de los pasos elementales (desplazamientos lineales de electrones) que podemos considerar en la secuencia de desplazamientos de pares de electrones que caracteriza a esta funcin enzimtica se corresponde con (o, ms precisamente, est provocado por) la polarizacin de dos puntos del centro activo (en nuestro ejemplo, el carboxilo del glutmico 165 y el amino en de la histidina 95), de forma que la propia secuencia de desplazamientos de pares de electrones dentro del metabolito sera la consecuencia de una secuencia, correspondiente, de polarizaciones de grupos qumicos dentro del centro activo, como se representa en la Figura 13.

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Se sabe, adems, que la sustitucin del glutmico 165 por asprtico (el oxgeno se aleja de su posicin alrededor de 1 ) hace que el enzima disminuya su actividad 1000 veces ; si el glutmico es sustituido por alanina (el grupo carboxilo desaparece) la actividad del enzima disminuye 1000.000 de veces ; cuando se cambia la histidina 95 por glutamina, la actividad disminuye 100 veces ; y cuando la histidina es sustituida por asparraguina la actividad disminuye 10.000 veces. 15

Figura 12. Transformacin del gliceraldehdo en dihidroxiacetona.

Figure 13. Triosa-fosfato -isomerasa : cambios en el centro activo.

Aunque los datos anteriores corresponden a la triosa-fosfato-isomerasa, en la medida en que la secuencia de movimientos de electrones que caracteriza a la transformacin en que interviene este enzima tiene las mismas caractersticas que el resto de las transformaciones enzimticas, parece lgico suponer que el funcionamiento de otros centros activos no debe ser, esencialmente, diferente al de este enzima (aunque sern diferentes las secuencias de polarizaciones y los grupos qumicos y los restos de aminocidos implicados). De aqu se deduce, por otro lado, que la denominada catlisis general cido-base (la captacin y cesin de H+ por parte de grupos qumicos del centro activo del enzima) debe jugar un papel importante y de carcter general en la actividad enzimtica (aun cuando, en algunos casos, sea indetectable con los medios utilizados en la actualidad). Sin duda, el estudio detallado de otros centros activos, adems de ayudar a confirmar y concretar esta interpretacin, permitir la comparacin entre ellos y, con ello, ayudar tambin a puntualizar el despliegue filogentico del metabolismo celular.
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Nombre de archivo: funcin enzimtica.doc Directorio: C:\Documents and Settings\Administrador\Escritorio\Elena Cordn Plantilla: C:\Documents and Settings\Administrador\Datos de programa\Microsoft\Plantillas\Normal.dot Ttulo: Introduccin Asunto: Autor: TXOMIN Palabras clave: Comentarios: Fecha de creacin: 21/11/2005 14:03 Cambio nmero: 14 Guardado el: 22/11/2005 13:12 Guardado por: . Tiempo de edicin: 82 minutos Impreso el: 22/11/2005 13:12 ltima impresin completa Nmero de pginas: 17 Nmero de palabras: 6.723 (aprox.) Nmero de caracteres:38.323 (aprox.)

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