INTRODUCCIN

El empleo de plantas medicinales es parte de una muy difundida tradicin emprica en nuestro pas, apoyada en elementos culturales y en la notable La Organizacin Mundial de la Salud (OMS), reconoce y estimula el gran valor de las plantas medicinales en la atencin primaria de millones de personas y considera que el 80% de la poblacin mundial utiliza estos recursos como principal fuente de atencin primaria de sus problemas de salud (Farnsworthet al; 1989). Las plantas contienen principios activos cuya actividad resulta ser favorable para combatir algunos microorganismos como parsitos, bacterias y hongos.

Illicium verum Hooker fillius, comnmente llamado ans estrellado, es un miembro de las Magnoliaceae. Se distribuye en el Atlntico, Norteamrica y las zonas tropicales y subtropicales de Asia. Se cultiva extensivamente en Kwangsi (Sureste de China) y en Tonkin (Indo-China), un rea con factores ecolgicos particulares (Wealth of India, 1948). El fruto tiene un sabor agradable, aromtico, dulce y un grato olor que se parece al ans. Se usa como un agente aromatizante en confitera, caramelos, chicles, tabaco, encurtidos, piensos, licores y preparativos farmacuticos. Tambin se usa en productos de perfumera y jabones. El fruto se mastica para perfumar el aliento y ayudar a la digestin. El aceite esencial de ans estrellado es estimulante, eupptico, carminativo, suavemente expectorante y diurtico (Vergueshe J., 1998). Se conoce su utilidad en flatulencias, dolores espasmdicos y disentera. Alivia los clicos y es un ingrediente comn en las pastillas para la tos. El aceite se emplea en reumatismos y tambin como antisptico. Es til contra los piojos y chinches, formando parte de los aerosoles para desparasitar el ganado. Se usa como antipirtico y en la sarna. Tambin es muy til en el estreimiento y en el insomnio. Estudios preliminares revelan que el ans estrellado tiene propiedades antimicrobianas. Realizando una bsqueda de especies con actividad antimicrobiana, el extracto alcohlico de ans estrellado mostr una significativa inhibicin del crecimiento de algunos microorganismos como B. subtilis, E. coli y S. cerevesiae (De M., 1998).

En el presente estudio ser utilizado como modelo la planta Illicium verum y se desarrollarn diferentes tcnicas como: i) obtencin de un extracto (fro o caliente), ii) cromatografa preparativa, iii) pruebas qumicas, iiii) evaluacin de actividad biolgica y iv) prueba de citotoxicidad con Artemia salina, para conocer tanto su caracterizacin qumica como actividad biolgica.

MATERIALES Y MTODOS

I.

Preparacin del extracto de Illicium verum

Extracto caliente: El extracto se prepar a base de Metanol. Brevemente, 30 g del material vegetal seco se adicion a 250 mL de Metanol. Se calent a 150 C por 5 minutos. Posteriormente, se filtr el extracto empleando papel filtro y fue concentrado a temperatura ambiente.

Extracto fro: El extracto se prepar a base de Metanol. Brevemente, 30 g del material vegetal seco se adicion a 250 mL de Metanol. La preparacin se dej reposar por 6 de das. Posteriormente, se filtr el extracto empleando papel filtro y fue concentrado a temperatura ambiente.

II.

Cromatografa preparativa

El extracto previamente concentrado fue resuspendido en 4 mL de metanol. La resuspencin fue adicionada con la ayuda de un capilar en la placa de slica. La cromatografa (Fig. 1) se corri en tres diferentes sistemas Benceno: Acetona 9:1 y Cloroformo: Metanol 9:1; posteriormente, fueron observadas las bandas que correspondientes a cada uno de los compuestos separados con ayuda de luz ultra violeta UV.

Caracterizacin qumica y evaluacin biolgica del extracto de Illicium verum

Fig.1 Cromatografa preparativa Una vez que se corrieron las cromatografas, stas se revelaron con la ayuda del cloruro de cobalto para, posteriormente, observar las bandas que corresponden a los compuestos separados con dichos sistemas de solventes.

III.

Pruebas qumicas

Se realizaron pruebas qumicas para determinar la presencia de flavonoides (Shinoda), taninos (compuestos fenlicos), saponinas, antronas (azcares), esteroles y terpenos (Liebermann-Burchard), permanganato (compuestos insaturados), bicarbonato de sodio (grupos carboxilo), cumarinas, alcaloides (Dragendorff) y sesquiterpenlactonas (Baljet).

PERMANGANATO. Identificacin de insaturaciones. Adicin gota a gota de una solucin de permanganato de potasio al 2 % en agua. Resultado positivo si el extracto presenta una decoloracin al aplicar ms de tres gotas del reactivo.

BICARBONATO DE SODIO. Disolver 1-2 mg de extracto en metanol, se le agregan 2 3 gotas de cido sulfrico concentrado. Agitar ligeramente. Luego se agregan 2 3 gotas de la solucin de bicarbonato de sodio al 10 %. La aparicin de burbujas y permanencia por ms de un minuto, es resultado positivo.

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CUMARINAS. Disolver de 1-2 mg de extracto en NaOH al 10 %. Prueba positiva si desaparece coloracin amarilla al acidular la preparacin.

REACCIN DE DRAGENDORFF. Identificacin de Alcaloides. Disolver de 1-2 mg de extracto, aadir 2 3 gotas de los reactivos A (nitrato de bismuto y cido actico glacial) y B (yoduro de potasio). La aparicin de una coloracin naranja a rojiza, se considera positiva.

REACCIN BALJET. Identificacin de Sesquiterpenlactonas. Se utilizan dos soluciones que se mezclan en volmenes iguales antes de usarse. Reactivo A: 1 g de cido pcrico en 100 mL de etanol. Reactivo B: NaOH al 10 % (p/v). Se colocan de 2-3 mg del extracto y de tres a cuatro gotas del reactivo. Se considera prueba positiva la aparicin de color naranja o rojo.

REACCIN DE SHINODA. Adicin de 5 gotas de HCL y limadura de magnesio metlico. La prueba ser positiva para flavonas si se produce una coloracin de naranja a roja, si es rojo indica la presencia de flavonoles y si es magenta la presencia de flavonas.

TANINOS. Adicin de 5 gotas de cloruro frrico 5 %. La formacin de coloraciones de azul a negro indica la presencia de derivados de cido glico y coloraciones verdes de derivados del catecol.

SAPONINAS. Agitar vigorosamente 1 mL de extracto y observar la altura y estabilidad de la espuma producida. Se considera positivo si la espuma alcanza una altura entre 8 y 10 mm y se mantiene estable por 30 min.

ANTRONAS. Adicin de 500 mg de polvo de antronas y adicionar 3 gotas de HCL concentrado. Se considera positivo con la formacin de un anillo azul o violeta en la interfase.

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LIEBERMANN-BURCHARD. Adicin de 1 mL de cloroformo, anhidro actico y HCL concentrado. La prueba ser positiva si: i) forma una coloracin azul o verde indicar la presencia de saponinas esteroidales y ii) con la formacin de una coloracin rosa, rojo, magenta o violeta, indica la presencia de saponinas triterpenoides.

IV.

Pruebas de actividad biolgica

Las pruebas empleadas para conocer la actividad biolgica del extracto de Illicium verum fue empleando una cepa de Klebsiella pneumoniae. Se estandariz el cultivo de la cepa a 0.5 Mc Farland (1X106 UFC/mL). Posteriormente, se inocularon la cepa en agar slido por toda la placa, consecutivamente se realizaron pocillos en el agar en los cuales se deposit 20 L de cada uno de los extractos (fro, caliente) de Illicium verum, as como los controles. Se incubaron 24 h a 37 C y finalmente se observ la presencia o ausencia del halo de inhibicin.

V.

Prueba de citotoxicidad con Artemia salina

La toxicidad en vivo de un organismo animal puede usarse como mtodo conveniente para el seguimiento y fraccionamiento en la bsqueda de nuevos productos naturales bioactivos. Uno de los ensayos ms utilizados es la prueba de citotoxicidad con nuplios de Artemia salina.

Una vez preparado el medio artificial para el cultivo de Artemia salina, se verific que la medida del pH estuviera entre 7 y 8. Se someti a burbujeo con una bomba de oxigeno por una hora, con el fin de saturar de este elemento la solucin. Se adecu un recipiente que hiciera las veces de cmara de incubacin para el desarrollo (eclosin) de 45 mg de huevos de Artemia salina, en 450 ml de medio artificial. Esta consta de una zona oscura y una zona iluminada permanentemente. Como fuente de luz se coloc una lmpara de 110 watios a 40 cm de distancia de las cmaras. Encendidas desde el momento de cultivo

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hasta la culminacin del bioensayo. A las 24 horas se observ la eclosin de los nauplios, los cuales se dejaron madurar durante 48 horas, tiempo establecido para la utilizacin en el bioensayo.

Para la prueba, se prepararon 3 soluciones a distintas concentraciones: 2, 1.5 y 0.1 mg/mL de cada uno de los extractos en metanol. Posteriormente, se colocaron cierto nmero de nuplios por pozo en placas de 96 pocillos. Despus, se agregaron 20 uL de cada tratamiento. Las pruebas se verificaron a las 24 h de incubacin. Se contaron los nuplios mviles e inmviles y en base al resultado, se estableci cules de los extractos era txico.

VI.

Determinacin cualitativa de capacidad antioxidante (DPPH)

Se emple el modelo de decoloracin del radical libre DPPH (Joyeux et al., 1995). Se coloc cierta cantidad de cada extracto en etanol. Posteriormente, en una placa de slica gel se coloc una muestra de cada solucin de extracto. Una vez seca la muestra se esparci sobre la placa la solucin reactivo constituido por 1,5 mL de la solucin etanlica (20 mg/mL) del radical libre DPPH. La placa se someti a cromatografa para el revelado final. Se tom como resultado positivo, el resplandecimiento del extracto.

RESULTADOS Y DISCUSIN

I.

Obtencin del extracto de Illium verum

La Tabla I muestra los rendimientos obtenidos durante la preparacin de los extractos, en donde se puede observar que se obtuvo un rendimiento para el extracto caliente y fro de 9.77 y 14 %, respectivamente. Dichos porcentajes aunque bajos, son aceptables, ya que existen reportes de extractos realizados con etanol (con 18.01 % de rendimiento). Por lo tanto el metanol al ser un solvente que posee polaridad similar, puede ser comparado con el mismo resultado (De M., et al, 1998). El rendimiento obtenido es menor al reportado,

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posiblemente, porque en el caso de la extraccin en caliente slo fue de 5 minutos (comparado con los procesos en soxhlet que duran minutos o hasta horas) lo que limita el rendimiento del extracto. Para el extracto en fro, se obtuvo un porcentaje de rendimiento mayor, esto pudo deberse a que la extraccin fue ms prolongada (6 das).

Tabla I. Obtencin de los extractos de Illium verum. EXTRACTO CALIENTE Muestra vegetal (g) Peso de extracto (g) Rendimiento (%) 30.7 3 9.77 EXTRACTO FRO 30.6 4.3 14

II.

Cromatografa preparativa

En la Fig. 2 se muestran los resultados obtenidos en la cromatografa preparativa, en donde se observa que existe una mayor banda en los dos sistemas (Benceno:Acetona, 9:1 y Cloroformo:Metanol, 9:1). Sin embargo, es en el sistema A dnde el compuesto muestra una mayor afinidad por la fase mvil. Esto indica que el extracto posee en su mayora compuestos de baja polaridad, lo cual puede comprobarse al observar el sistema B, ya que el compuesto se mantiene y muestra menos afinidad por los compuestos. Esto puede deberse a que el organo presenta en su composicin de metabolitos secundarios, una mayor proporcin de compuestos terpenoides (monoterpenoidesacclicos, monocclicos y biciclicos), as como ceras (Liu P., et al, 2012).

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Fig. 2 Cromatografa preparativa del extracto de Illium verum A) Benceno:Metanol (9:1) y B) Benzeno:Metanol (9:1)

III.

Pruebas qumicas

En la tabla II se muestran los resultados obtenidos durante la realizacin de las pruebas qumicas al extracto caliente de Illium verum, en donde se observa que result positivo para la reaccin Permanganato, Taninos, Shinoda, Antronas, Cumarinas, Baljet y Liebermann-Burchard. Por su parte, el extracto en fro dio resultado positivo para todas las pruebas excepto la de Dragendorff (Alcaloides). Para el caso de la presencia de compuestos insaturados, se sabe que el ans estrellado, contiene un alto porcentaje de anetol, compuesto aromtico al que se debe el sabor distintivo de la planta, as como su accin antimicrobiana (De M., et al, 2001). As mismo, entre los terpenos que se pueden aislar de I. verum encontramos el limoneno, -pineno, -mirceno, -pineno, -cimeno, linalol, carveol, vernenona, carvona, -elemeno, entre otros (Liu P., et al, 2012). Entre los flavonoides que se han aislado del ans estrella estn la rutina y el kaempferol-3-Orutinsido (Hall R. V., et al, 2002). Entre los taninos ms abundantes de la planta encontramos al anisaldehdo (Durst D., et al, 2007). Otro tipo de compuestos que se
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encuentran en la planta son los cidos orgnicos como el qunico y el siqumico. Dentro de las sesquiterpenlactonas ms importantes aisladas de esta especie estn las veranisatinas A, B y C (Chvez H. K., 2009).

Con los resultados anteriores podemos mencionar que el ans estrella contiene numerosos metabolitos secundarios, entre los que destacan los monoterpenos, terpenos y triterpenos. Este resultado es congruente con la cromatografa en capa fina, en la cual se aprecia la separacin de un conjunto de compuestos poco polares como lo son todas las clases de terpenos.

Tabla II. Pruebas qumicas en extracto de Illium verum.

PRUEBA RESULTADO EXTRACTO CALIENTE Permanganato (Compuestos insaturados) Bicarbonato de Sodio (Grupos carboxilo) Taninos Shinoda (Flavonoides) Saponinas Antronas (Compuestos con azcares) Cumarinas Dragendorff (Alcaloides) Baljet (Sesquiterpenlactonas) Liebermann-Buchard + + + + + + + + + + + + + + + RESULTADO EXTRACTO FRO +

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IV.

Pruebas de actividad biolgica

En la tabla III se muestran los resultados obtenidos al realizar las prueba antimicrobiana del extracto de Illicium verum. Se observa como al adicionar una cantidad definida del extracto fro o caliente (100 ug), este tiene cierta capacidad de inhibir el crecimiento de Klebsiella pneumoniae a las 24 horas de incubacin, esto al compararlo contra una cantidad de Gentamicina (20 mg/mL). Como se observa en los resultados la inhibicin por parte de los extractos en el crecimiento de la bacteria es muy pobre comparado con el antibitico estndar. Estos resultados son atribuibles a que la concentracin del antibitico estaba muy por encima a la que se aplico de los extractos. Por lo tanto, la concentracin de los extractos no puede ser comparado. Por su parte, extractos de Illicium verum han demostrado con anterioridad que ante un cultivo de Klebsiella pneumoniae la planta muestra una CMI de 45 g/mL (De M., et al, 2001).

Por lo anterior, es recomendable repetir el ensayo biolgico considerando las CMI reportadas en literatura para el extracto, as como el control que se considera aplicar.

Tabla III. Evaluacin de la actividad antimicrobiana de Illicium verum. EXTRACTO Inhibicin (cm) de Klebsiella pneumoniae Caliente Fro CONTROL (Gentamicina) 0.6 1.3 3.2

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V.

Prueba de citotoxicidad con Artemia salina

Para la prueba de citotoxicidad con Artemia salina, despus de la incubacin de cada uno de los extractos a distintas concentraciones (2, 1 y 0.5 mg/mL) se contabilizaron los nuplios vivos. La tabla IV muestra los resultados obtenidos. Como se puede observar, ambos extractos muestran un alto porcentaje de letalidad, destacndose por poco el extracto fro. Estos resultados muestran que el extracto metanlico de Illicium verum tiene una alta toxicidad, por lo que en futuras aplicaciones medicas debe ser considerado con importancia dicho aspecto. Como se menciona en literatura, el ans estrellado es conocido por su neurotoxicidad, provocar crisis convulsivas, hepatotxicidad,

hipocalcemia, entre otros efectos adversos (IMSS, 2002).

Tabla IV. Prueba de citotoxicidad con Artemia salina de los extractos de Illicium verum. Extracto Concentracin 2 1 0.5 FRO Letalidad (%) 100 100 100 CALIENTE Letalidad (%) 100 100 92.85

*Concentracin = mg/mL; % de letalidad=nuplios muertos/nuplios vivos X 100

VI.

Determinacin cualitativa de capacidad antioxidante (DPPH)

La figura 3 muestra los resultados para la prueba de DPPH. La modalidad en la que se elabor este ensayo permite determinar cualitativamente la capacidad antioxidante de los extractos naturales de plantas. En nuestro caso, el extracto de Illicium verum muestra cierta resplandecencia cuando se revel la cromatografa. Por lo tanto, el extracto tiene capacidad antioxidante. Se ha demostrado con anterioridad, que extractos naturales ricos en anetol tienen una alta capacidad antioxidante (Muoz A. A., et al, 2009). El anetol es un compuesto abundante en los extractos de Illicium verum, por lo tanto, es de esperarse el resultado obtenido.
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Fig. 3 Determinacin cualitativa de capacidad antioxidante (DPPH) de los extractos (fro/caliente) de Illicium verum.

CONCLUSIN

Se obtuvo un extracto de Illicium verum, el cual fue caracterizado mediante cromatografa preparativa, pruebas qumicas, dentro de las cuales destaca la identificacin de terpenos, compuestos insaturados, cumarinas, taninos, flavonoides, entre otros. As mismo, se evalu su actividad antimicrobiana contra Klebsiella pneumoniae resultando en cierta inhibicin del cultivo pero aun deficiente cuando se compara con el antibitico gentamicina. Se determin que ambos extractos, tanto fro como caliente, muestran una alta toxicidad en los ensayos con Artemia salina (de 92.85 a 100 %). Finalmente, los extractos (fro y caliente) resultaron con capacidad antioxidante cuando se sometieron a la prueba cualitativa de DPPH.

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