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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

4ta PRCTICA Morfologa bacteriana y coloracin gram Curso: Microbiologa pesquera

Alumna: Marilli Milagros Sosa Sarmiento

Profesora: Nancy Martinez Ordinola

Grupo: F*

Mesa: 1

Fecha de ejecucin: 18 marzo del 2011

Fecha de entrega: 26 abril del 2011

2011

INTRODUCCIN Tincin empleada en microbiologa para la visualizacin de bacterias en muestras clnicas. Tambin se emplea como primer paso en la diferenciacin bacteriana. El examen con microscopio ptico de preparacin con tincin de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos (esfricas), bacilos (alargadas) y formas espiralazas Las bacterias pueden diferenciarse con esta tincin en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos se tien de azul, mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se tien de rojo y se dice que son gramnegativos.

REVISION BIBLIOGRAFICA En cuanto a la reaccin gram. y caractersticas morfolgicas de los microorganismos visualizados, stas son: Gram: - Positivo: color azul. - Negativo: color rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo ser intenso). Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido a una mala extensin, fijacin o tincin, presencia de clulas viejas, dao en la pared celular o por particularidades especiales de la pared celular de ciertos microorganismos. - Neutro: no toman ningn color, siendo generalmente el fondo alrededor de ellos de un ligero gram (-). Los microorganismos pueden ser intracelulares. Esta reaccin gram ha sido vista en tinciones de muestras clnicas en donde estn presentes elementos fngicos o algunas espcies de micobacterias. Otras caractersticas: a examinar en el gram son si la tincin de los microorganismos es homognea, bipolar, en cuentas o gotas, punteada, en barras o irregular. Formas: - Totales: cocos, cocoides, cocobacilares, bacilos, filamentosos (ramificados o no) y levaduriformes. - Extremos: redondeados, afilados, romos, en forma de palo de tambor o inflado (por vacuolas, esporas, acmulos de cualquier naturaleza) y cncavos. - Lados: paralelos, ovoides, cncavos e irregulares. - Eje mayor: recto, curvado o en espiral. - Pleomorfismos: variacin en la forma de un mismo conjunto de microorganismos. Ocurre en algunas espcies de difteromorfos, Bacteroides spp., filamentosos ramificados (Actinomyces spp, ), por tratamientos antibiticos Tamaos: teniendo en cuenta que el tamao medio de un hemate es de 7 mm y el de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos polimnorfonucleares son de 0,2-0,3 mm: - Totales: minsculo (< 0,3 mm), pequeo (0,3-0,5 mm), medio y grande. - Longitud: corto (0,5-1 mm), medio, largo y filamentoso (10-30 mm). - Anchura: delgado, medio y grueso. - Pleomrficos: variacin en el tamao de un mismo conjunto de bacterias.

Caractersticas agrupacionales: microorganismos aislados, en pares, en cadenas, ttradas, en grupo o arracimados, en empalizada, en letras chinas, empaquetados Las bacterias adoptan las ms diversas formas: esfrica, alargadas, espirimiladas. La pared celular rgida, determina la forma de las bacterias

MATERIALES Y MTODOS 1- Fijacin de la cepa Materiales o o o o o Portaobjeto Agua destilada Asa de siembra o Kolle cepa mechero

Mtodos o o o o Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Se usa el asa de siembra, Flamear el asa de siembra, tomar una pequea cantidad del cultivo bacteriano (cepa) y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el portaobjeto a la llama del mechero, tener mucha precaucin de no calentar demasiado el portaobjeto pues las clulas pueden deformarse o romperse.

2- Coloracin Materiales o o o o o Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Agua destilada Safranina

Mtodos

o o o o o o o o o

Teir con cristal violeta 1min al portaobjeto Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1min. Decolorar con alcohol-acetona hasta que la preparacin deje de perder color Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teir con safranina (30seg) Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparacin. Examinar al microscopio con aceite de inmersin y fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.

OBSERVACION DEL MICROSCOPIO (OBJETIVO DE INMERSION 100X)

Enterobacter

Staphylococcus Aureus

RESULTADOS Se observo dos tipos de bacterias:

Gnero o especie: Enterobacter Morfologa: bacilos Gram. Negativa: color rojo o Se observo en el microscopio que Enterobacter aparecen aisladas

Gnero o especie: Staphylococcus Aureus

Morfologa: cocos Gram. Positiva: color azul o Se observo en el microscopio que el staphylococcus aureus aparece en pares sea agrupados, cadenas cortas y tipo de asociacin cocos en racimo

DISCUSION Los Staphylococcus Aureus se colorearon de azul ya que retuvieron la mezcla de yodo y violeta, al ser su pared celular ms gruesa y cerrarse los poros de la misma, se retuvo la solucin en su interior. El Entorobacter no retuvo la solucin de yodo y violeta en su interior ya que su pared celular es ms delgada y no se cerraron los poros de la misma, tornndolas del color rojo. Enterobacter debido a que la muestra estuvo pasada se observo al comienzo color azul, pero normalmente el enterobacter es gram. Negativa (color rojo) Un microorganismo gram. positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram. Negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante Este mtodo de coloreado de bacterias es muy factible ya que al ser transparentes en medio natural se hace virtualmente imposible distinguirlas en la placa. Al colorearlas y someterla a un colorante de contraste se facilita su observacin y permite distinguir adems entre bacterias de diferentes tipos. Las bacterias reaccionan diferente antes los diversos reactivos, por lo que se las puede clasificar en distintos grupos segn estas cualidades derivadas de su composicin y estructura.

CONCLUSIONES Las tinciones son muy importantes para diferenciar formas bacterianas segn la coloracin obtenida en la prctica as la Enterobacteria tuvo un color rojo, staphylococcus Aureus tuvo color azul. Las bacterias gram negativas se tornan de color rojo. Las bacterias gram positivas se tornan de color azul. El reactivo violeta sirve de medio principal de coloracin, y su tiempo de reposo en la placa puede variar dependiendo de su concentracin. El yodo, independientemente de su reaccin con el reactivo colorante, fija el color a la muestra. Las bacterias poseen diferente estructura y composicin unas de otras, lo que hace posible su diferenciacin. Otros bacterias presentan agrupadas y otros aisladas

RECOMENDACIONES Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin ya que pueden conducir a errores. Observar bien, repetidas veces al microscopio las formas del microorganismo y que color identificas.

CUESTIONARIO

1- CUALES SON LAS TECNICAS DE TINCION Tincin de esporas (wirtz-conklin y tcnica de sheaffer y fulton) Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Tincin de acido -alcohol resistencia Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes bacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lpidos que la hace impermeable a los agentes hidroflicos, por lo tanto estos microorganismos no se tien adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloracin de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de Ziehl-Neelsen (Tincin cidoRpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin decolorante una mezcla de etanol y cido clorhdrico. Son bacilos cido-alcohol resistentes por lo que la tincin de Zieh1Neelsen es til para la coloracin de estos microorganismos obtenidos de muestras clnicas o de cultivo. Con esta tincin, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos son difciles de teir con la tincin de Gram, y se observan como bacilos gram positivos con tincin irregular. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cido-alcohlica y por eso se denominan Bacilos cido Alcohol Resistentes (BAAR). Tincin de Gram. Est dividido en gram positivo y gram negativo. El organismo estudiado para gram positivo fue la Sarcina ya que manifest una tonalidad violeta debido a que fij en su estructura el cristal violeta como colorante. El microorganismo estudiado para gram negativo fue, Escherichia Coli, debido a que mostr una tonalidad rosada porque fija el colorante safranina. Tincin de cpsulas Indicador de probable patogeneidad. La cpsula es una cubierta altamente hidratada, fija ms los colorantes. Se hace por los pasos siguientes: 1.- tincin negativa seguido de tincin simple, fondo

oscuro y clula con halo. 2.- tincin simple con cristal violeta, se lava con sulfato cprico, as se consigue que la clula aparezca teida y alrededor de ella se ve un halo azul brillante debido al sulfato. Ej.: tincin de la pared celular (tcnica de knaysi), tcnica del rojo congo. 2- CUALES SON LOS CUIDADOS QUE HAY QUE TENER EN CUENTA PARA REALIZAR UNA COLORACION GRAM

Coloracin gram. Las molculas colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autenticas, pero son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denomina artefactos y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente

3- DE 6 EJEMPLOS DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

Gram Positivas -Clostridium -Streptococcus -Bacillus -Mycobacterium -Listeria -Nocardia

Gram Negativas - Escherichia coli - Shigella - Salmonella - Neisseria - Brucella - Kingella

BIBLIOGRAFIA Garrido Fara Germn Isauro, Miguel ngel Cornejo Cortes y Elsa Salinas Jimnez, 2003 Manual de colorantes para laboratorios de Ciencias biolgicas UNAM Mxico 95 pp JAWETZ. Microbiologa Mdica. Editorial El Manual Moderno. 15 edicin. 1996. Pp.834,835,836,837,838. (2). ZINSSER. Microbiologa. Editorial Mdica-Panamericana, 20 edicin.. 1997. Pp. 208,209,210,211.(3) Schlegel, H. G.. 1997. Microbiologa general 9. ed. Barcelona : Omega, 654p