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NEUROFARMACOLOGA

Mtodos de evaluacin de trastornos cognitivos en modelos animales


F. Navarrete a, J.M. Prez-Ortiz a, T. Femena a, M.S. Garca-Gutirrez a, M.E. Garca-Pay a, C. Leiva-Santana b, J. Manzanares a
MTODOS DE EVALUACIN DE TRASTORNOS COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES Resumen. Introduccin. El aumento de la prevalencia de la disfuncin cognitiva y la demencia, asociado, entre otros factores, al envejecimiento de la poblacin en los pases desarrollados, ha despertado un gran inters por el estudio de la etiopatognesis del dficit cognitivo y de las posibles dianas farmacolgicas para mejorar la funcin intelectual o frenar la neurodegeneracin subyacente en estos sntomas. Desarrollo y conclusiones. Un instrumento esencial a tal fin es la utilizacin de modelos animales de las enfermedades humanas que cursan clnicamente con deterioro cognitivo y demencia. En esta revisin analizamos los modelos animales de estos trastornos y las principales pruebas que, mediante la observacin de la evolucin de la conducta del animal de experimentacin, permiten valorar sus funciones cognitivas y su modificacin por los tratamientos experimentales que se quieran ensayar, de cara a su posible aplicacin a los pacientes. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45] Palabras clave. Atencin. Conducta. Demencia. Deterioro cognitivo. Memoria. Modelos animales.

INTRODUCCIN Disfuncin cognitiva en neurologa y patologa mdica En medicina, los trastornos de las funciones cognitivas se asocian generalmente con las llamadas demencias degenerativas primarias, de especial importancia por su alta frecuencia y prevalencia en las poblaciones con un ndice de envejecimiento creciente, tpicas de los pases desarrollados. Se trata de un grupo heterogneo de enfermedades caracterizadas por un deterioro mental progresivo que incluye combinaciones variables de prdida de memoria, alteraciones del juicio, el clculo, el lenguaje, la orientacin, las habilidades y la conducta, y trastornos psiquitricos. Los hallazgos anatomopatolgicos de este grupo de enfermedades consisten en la prdida de neuronas, localizada preferentemente en la corteza cerebral, junto con cambios degenerativos de las neuronas supervivientes, inclusiones proteicas y alteracin vascular y de la gla. La localizacin de la prdida neuronal y la naturaleza de los cambios degenerativos y de las inclusiones son los factores que diferencian a las distintas afecciones [1]. Ejemplos de este grupo de enfermedades degenerativas seran las demencias frontotemporales, la demencia con cuerpos de Lewy difusos y la enfermedad de Alzheimer. Esta ltima es el prototipo de enfermedad demenciante neurodegenerativa por excelencia, al ser la ms frecuente y la mejor estudiada [2]. Sin embargo, a medida que el inters por el estudio de las funciones intelectuales ha ido aumentando, se ha comprobado que existen alteraciones cognitivas en otras enfermedades neurolgicas degenerativas cuyas manifestaciones cardinales consisten en un trastorno del movimiento, como las ataxias cerebeAceptado tras revisin externa: 30.06.08.
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Instituto de Neurociencias de Alicante. Universidad Miguel HernndezCSIC. San Juan de Alicante, Alicante. b Servicio de Neurologa. Hospital General de Alicante. Alicante, Espaa. Correspondencia: Dr. Jorge Manzanares. Instituto de Neurociencias de Alicante. Universidad Miguel Hernndez-CSIC. Apartado de Correos 18. E-03550 San Juan de Alicante (Alicante). E-mail: jmanzanares@umh.es Los autores manifiestan la inexistencia de posibles conflictos de inters. 2008, REVISTA DE NEUROLOGA

losas, las enfermedades de las motoneuronas o las distrofias musculares, y que engloban a la enfermedad de Parkinson [3,4], el temblor esencial [5], la enfermedad de Huntington [6,7], la parlisis supranuclear progresiva [8], las ataxias hereditarias [9], la esclerosis lateral amiotrfica [10] y las miopatas [11]. Es de destacar que prcticamente todas las enfermedades neurolgicas adquiridas o secundarias del sistema nervioso, incluidas las traumticas, vasculares, infecciosas, inflamatorias, desmielinizantes, tumorales, iatrognicas, txicas, metablicas o psiquitricas, se han asociado con deterioro intelectual o demencia [12]. Tambin algunas enfermedades sistmicas, como el dolor crnico [13] o las afecciones reumticas [14] y digestivas [15,16], se han asociado con la disfuncin cognitiva. Por lo tanto, la ubicuidad de la disfuncin intelectual en la patologa humana, junto con el hecho de que la alteracin cognitiva es siempre una causa importante de incapacidad para el paciente, y de estrs y sobrecarga para los familiares, los cuidadores y la sociedad en general, subraya la importancia del problema y la necesidad de profundizar en el conocimiento de las causas, los mecanismos patognicos y el tratamiento de estos trastornos. Pese al espectacular avance de las tcnicas y los conocimientos en neuroimagen, neuroqumica, neurogentica, neuropsicologa, neurofisiologa y neurofarmacologa, la investigacin con pacientes presenta importantes limitaciones que hace imprescindibles los estudios experimentales con modelos animales de los distintos tipos de disfuncin cognitiva. Hay una gran variedad de modelos animales de deterioro cognitivo, clasificados en funcin del mecanismo por el que ste se produce, sea seleccin o manipulacin gentica, utilizacin de agentes ambientales durante el desarrollo o la edad adulta, o manipulacin farmacolgica de la respuesta cognitiva del animal. Aunque los estudios in vitro de tejido cerebral tienen su inters, en el campo de la farmacologa cognitiva es necesario utilizar uno o varios modelos animales para determinar la utilidad de un nuevo frmaco y su posologa, debido a la complejidad de la funcin cognitiva, en la que intervienen mltiples estructuras cerebrales interconectadas. El objetivo de esta revisin es describir las principales pruebas de conducta usadas en animales de experimentacin para

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evaluar una serie de trastornos cognitivos, examinando sus fundamentos, sus ventajas e inconvenientes y su potencial proyeccin en la clnica. Funcin cognitiva: atencin, aprendizaje y memoria Antes de mostrar las pruebas de conducta que se emplean en la evaluacin del deterioro cognitivo, es importante describir una serie de conceptos relacionados con la funcin intelectual. El sistema de cognicin en general se compone de procesos de funcionalidad y de aprendizaje y memoria. Entre los de funcionalidad, se incluyen, por una parte, procesos de preatencin, en los que se realiza el filtrado de la informacin sensoriomotora para centrar la atencin en los elementos ms relevantes del entorno [17] y cuya alteracin genera una sobrecarga sensorial y una fragmentacin cognitiva que podra contribuir a Figura 1. Tipos de memoria y estructuras cerebrales relacionadas. En funcin de cmo se recibe y almacena la cabe distinguir dos grandes tipos de memoria: la implcita, que no requiere un aprendizaje conscienlas alteraciones que se dan en informacin, te, y la explcita, producto de un esfuerzo cognitivo consciente. distintos trastornos psicticos [18], y por otra parte, procesos de atencin, esto es, atencin reflexiva, orientacin visual, orientacin aprendida, vigilancia, habituacin y atencin selectiva, mantenida o dividida. En los procesos de aprendizaje y memoria se incluyen el aprendizaje asociativo, espacial o no espacial, y la memoria a corto y largo plazo. Se puede definir el concepto de memoria como la retencin a largo plazo de representaciones internas dependientes de la experiencia [19]. La memoria se puede dividir en dos grandes bloques: memoria implcita (no declarati- Figura 2. Prueba go/no go. Este ensayo tiene lugar en cmaras de conducta operante donde va) y explcita (declarativa) [20,21]. La memo- el animal recibe estmulos go a los que debe responder presionando una palanca, por lo cual reria implcita es la resultante de procesos de cibir una recompensa, o estmulos no go, frente a los que debe retener su respuesta. aprendizaje no consciente realizados a travs de hbitos y habilidades, mediante estimulacin o sensibilizarepresentacin consciente del suceso o para ejecutar una rescin previa, y en los que interviene la musculatura esqueltica o puesta motora aprendida. bien respuestas emocionales y de aprendizaje no asociativo. La memoria explcita o declarativa engloba la retencin del conoci- En la memoria explcita se incluyen tres categoras diferentes: miento de determinados acontecimientos, lugares o hechos, y memoria inmediata, memoria a corto plazo y memoria a largo en ella toma parte el lbulo medio temporal del diencfalo. Esta plazo [20,22]. informacin se retiene mediante un esfuerzo consciente y a traTodos los aspectos mencionados anteriormente del aprendivs de asociaciones nuevas [21]. La adquisicin de la memoria zaje y la memoria se han estudiado a lo largo de los aos gracias explcita es un proceso que requiere tres fases: a modelos animales, que han permitido conocer las estructuras Codificacin: captacin de detalles sobre los estmulos y el cerebrales que intervienen en su funcionamiento (Fig. 1). entorno para su posterior consolidacin (procesamiento de Tipos de modelos animales de trastornos cognitivos la informacin para almacenarla). Almacenaje: retencin de la informacin a lo largo del tiempo. Los modelos animales de trastornos cognitivos se han basado ma Recuperacin: utilizar la informacin retenida para crear una yoritariamente en primates, ratas y ratones, cuyos procesos neu-

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ronales son similares a los de la funcin cognitiva humana. Se pueden distinguir varios tipos de modelos experimentales: Modelos farmacolgicos: permiten la evaluacin de frmacos. Modelos genticos: basados en animales manipulados genticamente (transgnicos y knock-out) [23-28]. Modelos toxicolgicos: para determinar la toxicidad de metales pesados, txicos y neurotoxinas [29]. Hay modelos animales que simulan sndromes especficos de dficit cognitivo en los cuales el factor desencadenante es el envejecimiento [30-32] o los traumatismos craneoenceflicos [33,34]. Recientemente, se han empleado tambin otros modelos complementarios que se realizan con animales no mamferos, como peces cebra (Danio reiro), moscas del vinagre (Drosophila melanogaster) y gusanos (Caenorhabditis elegans), para cribar compuestos potencialmente txicos o teraputicos, y determinar alguna de las bases neuromoleculares de la funcin cognitiva. PRUEBAS DE CONDUCTA PARA LA EVALUACIN DE TRASTORNOS COGNITIVOS EN MODELOS ANIMALES A la hora de abordar el estudio de la funcin cognitiva utilizando modelos animales debemos tener presentes sus mltiples dimensiones y decidir cul de ellas deseamos investigar para elegir la prueba especfica ms apropiada. Evaluacin de la atencin Preatencin Inhibicin prepulso. Permite evaluar la capacidad de un individuo para filtrar la informacin disponible a travs de la aplicacin de un estmulo de baja intensidad (prepulso) que antecede a un estmulo intenso (pulso). Si a un estmulo alto le precede uno de menor intensidad, la respuesta al segundo estmulo se reduce. En esta prueba se mantiene constantemente un sonido neutro (blanco) con el objetivo de crear un ruido de fondo estable. El estmulo acstico prepulso se aplica entre 4 y 18 dB por encima de este ruido de fondo y precede sistemticamente al estmulo mayor (pulso) cuya magnitud vara entre 100 y 120 dB y que se aplica durante 60 a 140 ms. El prepulso auditivo inicial inhibe la magnitud de la respuesta de sobresalto posterior ante el pulso, inhibicin que se incrementa conforme aumenta la intensidad del prepulso [35]. Atencin Orientacin y habituacin. Para medir la respuesta de orientacin visual en ratas y ratones se utiliza una tcnica que consiste en colocar un objeto en el campo de visin del animal y evaluar la capacidad que tiene para rastrear el objeto. Una manera de llevar a cabo la prueba es colocar el animal en un rea circular donde primero se le deja pasar una fase de habituacin de unos dos minutos, seguida de la introduccin de un pequeo objeto que durante 12 segundos se mueve siguiendo el permetro del rea circular en el campo de visin del ratn. Cada presentacin del objeto constituye un ensayo de la prueba y en cada ensayo se mide la respuesta de orientacin en intervalos de uno o dos segundos. Se considera que el animal se orienta cuando dirige su cabeza hacia el objeto o bien lo rastrea mientras se encuentra girando. Prueba go/no go. Este ensayo se divide en pruebas go y pruebas no go. La prueba go consiste en la presentacin de un estmulo

al animal de experimentacin (por ejemplo, luz), ante el cual el animal debe responder y recibir una recompensa por ello. En el caso de la prueba no go se aplica una determinada seal antes de la seal go (por ejemplo, un tono antes de la luz) y el animal de experimentacin tiene que aprender a retener su respuesta para recibir el refuerzo (Fig. 2). La prueba est constituida por tres fases: Formacin: el ratn aprende a realizar una tarea con el objetivo de conseguir un refuerzo y tras esto se le aplica la seal go durante cinco das consecutivos en los que se llevan a cabo 40 pruebas al da. Prueba go: comienza con la presentacin de la seal go y, cuando el ratn responde a dicho estmulo dentro de un determinado perodo de tiempo (por ejemplo, 60 segundos), se le suministra la recompensa. Es entonces cuando el ratn dispone de un tiempo determinado, 20 segundos, para localizar y consumir la comida. Un fallo en cualquier parte de la prueba supone la interrupcin antes de la siguiente prueba go. Cuando el ratn complete con xito el 85% de las pruebas go durante al menos tres das consecutivos, se introduce en la prueba go/no go. Prueba go/no go: esta fase dura aproximadamente 10 das, durante los cuales se van intercalando aleatoriamente las pruebas go y no go. Tras la seal no go, el ratn debe aprender a contener su respuesta durante unos 15 segundos para recibir la recompensa. Si el ratn responde antes de tiempo o mientras se est aplicando la seal, se considera fallo y no se le proporciona la recompensa. Si el ratn no logra retrasar su respuesta durante un perodo determinado (15 segundos), se debe repetir la prueba con un intervalo de tiempo menor (2-10 segundos), con el fin de averiguar si el dficit se debe a una incapacidad para retrasar su respuesta durante un perodo prolongado o a una incapacidad de aprender la tarea no go. Inhibicin latente. Esta prueba permite estudiar la atencin selectiva del ratn, as como determinados aspectos del aprendizaje y la memoria. El concepto de inhibicin latente hace referencia al retraso que se produce en el condicionamiento a un estmulo cuando ese estmulo ha sido presentado previamente sin ninguna consecuencia [36]. El procedimiento consistira en tener dos grupos de animales, el primer grupo se coloca en el aparato donde se realiza la prueba y se permite que lo explore durante una hora. El segundo grupo se coloca en el aparato el mismo tiempo pero reciben el estmulo condicionado (por ejemplo, un tono intermitente y/o luces). Al da siguiente, los ratones son examinados en el mismo aparato y el estmulo condicionado precede a un shock elctrico en las patas (estmulo aversivo). Si el ratn sale de la cmara durante el tono de 8 segundos, se considera respuesta de evitacin. Si abandona la cmara tras el tono de 8 segundos y durante la presentacin del siguiente tono de 8 segundos y shock elctrico, la respuesta se registra como escape. Si no abandona la cmara en ninguno de los momentos expuestos anteriormente, se considera que la respuesta es fallida. Con este sistema se consiguen curvas de aprendizaje a lo largo del tiempo en las cuales la evitacin, el escape y las respuestas fallidas del ratn pueden seguirse con detalle. Cuando se procede a comparar ambos grupos, se observan claras diferencias entre ellos. La inhibicin latente se pone de manifiesto en los ratones que han sido expuestos previamente al estmulo, ya que muestran un retraso en la adquisicin de la respuesta condicionada.

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Evaluacin del aprendizaje y la memoria Memoria no espacial Prueba de reconocimiento de objetos. Desde que Ennaceur et al [37] introdujeron la prueba de reconocimiento de objetos, se ha ido incrementando su uso como modelo de investigacin y poderosa herramienta experimental para valorar los efectos de los frmacos sobre la memoria y los mecanismos neurobiolgicos relacionados con el aprendizaje y la memoria [38-45]. Esta prueba se fundamenta en la tendencia natural de los ratones a explorar nuevos objetos y ambientes y compararlos con otros que les son fami- Figura 3. Prueba de reconocimiento de objetos. El experimentador puede estudiar la memoria a corto y largo plazo liares. Al exponer al ratn a modificando el intervalo de tiempo entre la primera exposicin a dos objetos idnticos y las siguientes exposiciones, en las que se evala el grado de exploracin del objeto familiar frente a otro nuevo. una serie de objetos se espera a que ste los explore y se mide el tiempo de exploracin, que se define como el pe- to y la memoria en ratas y ratones. La prueba de reconocimienrodo durante el cual el animal olisquea o toca el objeto con las to social se centra en el grado de familiaridad entre dos indivipatas delanteras a una distancia menor o igual a 1 cm. En cada duos. Tal y como se describe en la figura 4, se lleva a cabo en parte de la prueba se cambian los objetos y al inicio se estable- una jaula que tiene una ventana con una malla de alambre [48]. ce el intervalo de tiempo entre la exposicin inicial y las si- Junto a la jaula donde se realiza la prueba se coloca otra circular guientes, con lo que se consigue una valoracin de la memoria a que, a su vez, est dividida en dos cmaras, cada una de ellas corto y largo plazo. La prueba se realiza en un campo abierto con una ventana con una malla de alambre. La prueba comienza que situamos en una habitacin homogneamente iluminada y con la habituacin, situando al ratn en la jaula principal durancon objetos que deben ser de similar textura, color y tamao, te 10 minutos para que se familiarice con el entorno y dejando vaca la cmara circular. Posteriormente, en uno de los comparpero de distinta forma (Fig. 3). En una primera fase de habituacin, se coloca el animal en timentos de la cmara circular se coloca un ratn que llamareel campo abierto sin ningn objeto y se deja transcurrir un tiem- mos familiar, ya que estuvo en contacto previamente durante po variable (10-30 minutos) para que se familiarice con el en- cinco minutos con el ratn experimental (se puede utilizar un torno. A las 24 horas se realiza el entrenamiento, para lo cual se ratn de su misma jaula) y en el otro compartimento se coloca colocan dos objetos idnticos (objetos A) en distinta posicin un ratn nuevo, que nunca ha sido expuesto al ratn experimen(posicin 1 y posicin 2) y se deja el animal en el interior de la tal. La caja circular se gira para enfrentar, por medio de las vencaja durante 5 o 10 minutos, en los que se contabiliza el tiempo tanas de acoplamiento, al ratn de la caja principal con cada uno de exploracin (T). En la siguiente fase se deja un objeto A (que de los dos compartimentos en sesiones de cinco minutos. La exllamaremos objeto familiar) y se coloca en la otra posicin un periencia se realiza cuatro veces. En las tres primeras el animal objeto nuevo (objeto B). La memoria a corto plazo se mide a la se enfrenta a un ratn familiar y durante el transcurso de estas hora y a las tres horas del entrenamiento, anotando el tiempo de sesiones el ratn se acostumbra a esa exposicin y vara su inexploracin de los objetos familiar (TA) y nuevo (TB). Transcu- vestigacin social (habituacin). En la cuarta exposicin se gira rridas 24 horas desde el entrenamiento, se mide la memoria a la cmara y se muestra el ratn nuevo (deshabituacin). En tolargo plazo, para lo cual se cambia el objeto B por un objeto das las sesiones se mide el tiempo de exploracin, definido conuevo (C) y se sigue el mismo procedimiento. El resultado es- mo el tiempo que el animal emplea en acercarse u olisquear la perado es que los ratones sin deterioro cognitivo exploren ms ventana de acoplamiento. Los ratones con una funcin cognitiel objeto nuevo que el familiar. En cambio, para un ratn con al- va no deteriorada pasarn ms tiempo olisqueando a los ratones guna alteracin en la funcin cognitiva, el objeto familiar y el nuevos que a los familiares; los que tengan un dficit cognitivo nuevo le parecern igual de novedosos y no habr diferencia en- no distinguirn entre los ratones familiares y los nuevos (su tre los tiempos de exploracin. tiempo de exploracin ser similar). Prueba de reconocimiento social. El procedimiento del reconocimiento social lo introdujeron Holloway y Thor [46] y posteriormente fue desarrollado por Robert Dantzer et al [47] para estudiar la regulacin neuropeptidrgica sobre el comportamienMemoria espacial Laberinto acutico de Morris. Una de las pruebas ms comnmente utilizadas por los investigadores para el estudio de la memoria espacial es el laberinto de agua diseado por Morris

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Figura 4. Prueba de reconocimiento social. La exposicin repetida del animal a un individuo familiar precede a una ltima confrontacin con un individuo desconocido, momento en el que se evala el grado de interaccin respecto al que se produjo con anterioridad.

Figura 5. Laberinto acutico de Morris. En esta prueba se evala el tiempo de latencia que emplea el animal en alcanzar la plataforma sumergida, que representa un estmulo reforzante de escape. Si la plataforma permanece en el mismo lugar, se evala la memoria espacial de referencia, y si vara, se analiza la memoria espacial de trabajo.

[49]. La prueba se desarrolla en una piscina circular dividida en cuatro cuadrantes imaginarios (designados como noroeste, suroeste, noreste y sureste) que dispone de una plataforma mvil de escape oculta y parcialmente sumergida. En uno de los cuadrantes se sita la plataforma mvil, que debe quedar a una altura de 0,5 cm por debajo del agua. Los puntos de escape se localizarn en siete posiciones diferentes, a igual distancia, fijadas aleatoriamente a travs de la prueba, y se deben utilizar los mismos para todos los animales. Alrededor de la piscina se colocan numerosas seales visuales para facilitar la orientacin espacial del animal. Las seales luminosas son las ms utilizadas en este tipo de laberinto (Fig. 5). En una primera fase de adquisicin se introduce al animal con el hocico apuntando hacia las paredes de la piscina para que busque la plataforma durante 60 o 120 segundos. En caso de no que no la encuentre, se le coloca entre 20 y 30 segundos sobre sta. Se considera que un animal ha encontrado la plataforma cuando permanece en ella 5 o 10 segundos. Despus se retira el animal de la plataforma y se le deja descansar cuatro minutos antes de iniciar el siguiente ensayo. Este procedimiento se repite con cada animal hasta 12 entrenamientos consecutivos. La capacidad del animal para localizar eficientemente la plataforma depende de la utilizacin de las claves que rodean a la piscina (son necesarias al menos dos seales fuera del laberinto para localizar la meta invisible). Esta fase de adquisicin o aprendizaje puede durar varios das. Dos das despus de finalizar la fase anterior se lleva a cabo una ltima prueba de retencin o ensayo de investigacin sin plataforma durante 60 o 100 segundos. Si el animal ha aprendido, nadar ms tiempo en el cuadrante meta, es decir, donde previamente estaba situada la plataforma. Las medidas conductuales ms utilizadas son la latencia de escape en los ensayos de adquisicin (tiempo que transcurre hasta que alcanza la plataforma) y el porcentaje de tiempo en el cuadrante meta durante la prueba final. La adquisicin se refleja en las menores latencias de escape a lo largo de los das y el mayor porcentaje de tiempo en el cuadrante meta.

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Laberinto de Barnes. Esta prueba permite estudiar el aprendizaje y la memoria espacial, la memoria de trabajo y de referencia, y la memoria a corto y largo plazo, as como otras tareas ms complejas en ratas y ratones. Fue diseada por Barnes en la Universidad de Arizona [50] y consiste en un laberinto seco donde se utilizan luz y ruido como estmulos aversivos. El refuerzo que recibe el animal es escapar de estos estmulos. El laberinto est constituido por un disco de plstico opaco elevado del suelo mediante un trpode (Fig. 6). A lo largo del permetro del disco se distribuyen 20 agujeros de 5 cm de dimetro y debajo de uno de ellos se coloca un cajn de escape de plstico opaco. Se pueden situar diversas pistas espaciales alrededor del cilindro, que permanecern constantes durante todo el estudio, y tambin se pueden colocar debajo de algunos agujeros cajones falsos en los que parece posible introducirse, pero cuyo espacio disponible es en realidad tan pequeo que impide que el animal se pueda esconder. Un foco de luz (de unos 150 W) y un generador de ruido (sobre 80 dB) constituyen los estmulos aversivos. El procedimiento comienza con un entrenamiento que consiste en colocar el animal en la caja de escape y dejarlo all durante un minuto, para continuar un minuto ms tarde con las diversas sesiones de exploracin. Todas las sesiones empiezan colocando el animal en el centro del laberinto en el interior de una cmara de inicio, que consiste en un cilindro opaco de unos 10 cm de alto. Al cabo de 10 segundos, se retira la cmara de inicio, se conectan la luz y el zumbido, y se deja que el animal explore el laberinto. El estrs producido por estos estmulos inducir al animal a buscar un espacio cerrado donde esconderse. La sesin termina cuando el animal encuentra el tnel de escape o cuando transcurren cinco minutos, momento en el que se le introducira manualmente en dicho tnel. Cuando el animal entra en la cmara de escape, los estmulos aversivos cesan y se le deja en la oscuridad un minuto antes de devolverlo a su jaula. El tnel de escape est situado siempre debajo del mismo agujero, que se elige de forma aleatoria para cada animal. La prueba se realiza durante varios das hasta que en siete u ocho pruebas consecutivas se produzcan menos de tres errores. Se valoran el aprendizaje espacial y la memoria midiendo el tiempo que invierte el animal en encontrar el cajn refugio y el nmero de errores que comete antes de encontrarlo. Se considerar un error cada vez que intente introducirse en un agujero que no es el correcto. Los intentos sucesivos en un mismo agujero equivocado se consideran el mismo error. Aprendizaje asociativo Prueba de evitacin pasiva. La prueba de evitacin pasiva es una prueba unidireccional que permite estudiar el aprendizaje adquirido y la memoria. El animal se condiciona con un estmulo aversivo y posteriormente se valora si recuerda esa experiencia. Para llevar a cabo esta prueba se utiliza una caja con dos compartimentos, uno claro y otro oscuro, separados entre s por una puerta corredera. En el compartimento claro hay una luz potente enfocando directamente al ratn, mientras que en el oscuro hay un circuito cerrado que producir pequeas descargas elctricas. Se pretende que el ratn aprenda a evitar el compartimento oscuro donde se le aplica la descarga [51]. La prueba comienza con un entrenamiento que consiste en colocar al ratn en el compartimento iluminado. A los 5 segundos se abre la puerta y se le permite dirigirse al compartimento oscuro (el ratn tender espontneamente a desplazarse a los

Aversin: luces 150 W

Cajn refugio

Falso cajn

Figura 6. Laberinto de Barnes. El animal se sita primero en el centro del aparato en una cmara de inicio y a continuacin se le deja que explore los diversos orificios ante la exposicin a estmulos aversivos, como luces y sonidos. Se evala el tiempo que emplea en encontrar la salida que conduce al cajn refugio.

espacios oscuros, pues la luz directa le produce ansiedad). En el momento en que el ratn entre con las cuatro patas en la cmara oscura se cerrar la puerta y recibir una descarga elctrica de 0,1-0,4 mA durante 2 segundos. Treinta segundos despus de la aplicacin de la descarga, se devuelve al ratn a su jaula hasta el momento de la prueba, que consiste en volver a poner el ratn en la cmara iluminada y levantar la puerta que separa las dos cmaras. Durante la prueba no se aplica al animal ninguna descarga y se observa durante 5 minutos, registrando diversos parmetros, entre los que se incluyen el tiempo de latencia hasta que entra en la cmara oscura (como indicador de memoria), el nmero de veces que cruza de una cmara a otra, el tiempo total que pasa en cada una de las cmaras y la frecuencia con la que se asoma a la cmara oscura hasta que realmente entra en ella. El ensayo se puede llevar a cabo a los 30 o 60 minutos del entrenamiento, para evaluar la memoria a corto plazo, y a las 8 y 24 horas, para valorar la memoria a largo plazo. Es posible utilizar otras variantes experimentales en las pruebas de evitacin pasiva, como las empleadas en la tarea de evitacin inhibitoria del descenso de la plataforma (step-down inhibitory avoidance task). Prueba de evitacin activa. Las pruebas de evitacin activa requieren varias sesiones de aprendizaje, a diferencia de las de evitacin pasiva, en las que el ratn aprende en una sola sesin, pero nos permiten examinar funciones cognitivas complejas y valorar la adquisicin y consolidacin de la memoria en un mismo animal durante el experimento [52]. La prueba de evitacin activa se puede clasificar en evitacin activa de un sentido y evitacin activa de dos sentidos. La diferencia radica en que en la

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prueba de evitacin activa de un sentido el ratn siempre recibe el shock elctrico en la misma cmara/localizacin (es unidireccional) [53], mientras que en la de dos sentidos el animal aprende, a travs de diferentes pistas, a predecir la descarga elctrica, independientemente de la cmara de ensayo (contexto) donde se produzca (es bidireccional) [54]. La prueba de evitacin activa de un sentido se realiza en una caja con dos compartimentos comunicados entre s por una puerta e iluminada con luz natural. En un compartimento se coloca una bombilla y, cuando sta se enciende, se emite un sonido durante 10 segundos y se abre simultneamente la puerta para que el ratn pueda cambiar de compartimento. Al cesar el estmulo luminoso y sonoro el ratn recibir una descarga de 0,1 mA durante 20 segundos si no ha cambiado de compartimento, hasta que escape a la cmara adyacente. Esta prueba, repetida hasta 20 veces al da y con intervalos de 20 segundos, constituye el perodo de entrenamiento. En cada ensayo se registra el tiempo de latencia hasta que se produce la respuesta de evitacin (escapar a la otra cmara). Se considera como fallo si esta respuesta no se produce. Este entrenamiento diario se repite hasta que el ratn alcanza un criterio que refleja aprendizaje. Las curvas de aprendizaje a lo largo del tiempo revelan adquisicin y consolidacin de la evitacin. En la prueba de evitacin activa de dos sentidos, el ratn puede recibir la descarga elctrica en cualquiera de las dos cmaras, dependiendo de su localizacin actual. El animal debe resolver un conflicto, ya que la cmara donde recibi la descarga en el ensayo previo se convierte en cmara segura durante la siguiente prueba. Por lo tanto, tiene que aprender a inhibir su tendencia a evitar el compartimento donde acaba de recibir una descarga y utilizar el estmulo condicionado para predecir y evitar una nueva descarga [54]. Esta prueba se realiza en una caja con dos compartimentos iluminados con una bombilla cada uno. Se introduce el ratn en uno de los dos compartimentos y se le permite explorarlo durante cinco minutos. A continuacin se conecta el sistema de sonido y luz que constituye el estmulo condicionado. Si el animal no cruza a la cmara adyacente tras 8-10 segundos, se le aplica un shock elctrico. La luz, el sonido y el shock elctrico cesan si el animal cruza a la otra cmara o si transcurren 10 segundos desde la aplicacin del shock elctrico. Las respuestas se codifican como evitacin (el ratn pasa a la cmara adyacente tras el estmulo condicionado pero antes del shock elctrico), escape (el animal cruza a la otra cmara durante el shock elctrico) o fallo (el ratn no pasa a la cmara adyacente durante los siguientes 10 segundos tras el shock elctrico). El perodo de aprendizaje consiste en realizar esta prueba al mismo ratn 70 veces durante 70 minutos con intervalos de 30-90 segundos. El anlisis de las curvas de aprendizaje nos revela informacin acerca de la adquisicin o prdida de cada respuesta (memoria a corto plazo). La repeticin de la prueba a las 24 horas del primer ensayo nos permite valorar la memoria a largo plazo. Memoria emocional Condicionamiento aversivo al sabor. El modelo de condicionamiento aversivo al sabor fue descubierto en 1955 por Garca et al [55]. Para desarrollar el condicionamiento aversivo al sabor, el animal debe poder reconocer el estmulo condicionado y llegar a enfermar con la exposicin al estmulo no condicionado. Es importante que se desarrolle esta asociacin entre el estmu-

lo condicionado y el no condicionado para que finalmente, cuando se presente el estmulo condicionado slo, el animal lo evite. La prueba consiste en una primera fase de habituacin en la que se deja al animal durante 24 horas sin comida, restriccin que asegura la ingestin posterior de una cantidad adecuada que, a su vez, favorecer la asociacin entre el estmulo condicionado y el no condicionado. Pasadas esas 24 horas, se traslada a cada ratn a la jaula de prueba, en el centro de la cual se coloca un pequeo comedero. Su base puede estar aromatizada con un 1% de vainilla o extracto de almendra y endulzada con 0,25 M de solucin de sacarina. A los ratones se les asigna aleatoriamente uno de estos dos aromas. El cuenco de la comida debe pesarse antes y despus de la fase de condicionamiento (3060 minutos) para asegurar que el animal ha ingerido una cantidad suficiente. Tras la exposicin al estmulo condicionado, se le inyectan a cada ratn 0,15 M de cloruro de litio o agua estril y se le devuelve a su jaula, donde se mantiene 24 horas ms con restriccin de comida hasta someterlo a la prueba de retencin. Dicha prueba consiste en colocar dos dispositivos de comida, uno con el aroma a vainilla y el otro con extracto de almendra para la libre eleccin del animal. Se espera que los ratones condicionados a la vainilla prefieran la almendra y los condicionados a la almendra prefieran la vainilla. Sobresalto potenciado por el miedo. Se trata de una prueba pavloviana de miedo condicionado en la que una respuesta de temor ante un estmulo acstico puede aumentarse cuando ste se presenta junto con otro estmulo aversivo que genera respuestas de miedo [56,57]. El ensayo se suele llevar a cabo durante cuatro das, comenzando con cinco minutos diarios de aclimatacin en la jaula donde se realizar el experimento. El primer da, se miden las respuestas de miedo a travs de un rango de intensos estmulos acsticos que se aplican durante 40 ms a diferentes intensidades (100, 105 y 110 dB). Es importante evaluar al ratn un nmero limitado de veces para evitar que una presentacin frecuente pueda causar habituacin a estos estmulos. El segundo da se aplican esos mismos estmulos, pero en la mitad de los ensayos el estmulo acstico de sobresalto se presenta inmediatamente seguido de un tono de 12 kHz y 70 dB durante 30 segundos (estmulo condicionado), y en la otra mitad slo se suministra el estmulo acstico del primer da. Para calcular la magnitud de la respuesta al estmulo condicionado, la respuesta al estmulo acstico cuando se presenta aisladamente se resta de la respuesta al estmulo acstico cuando se presenta con el estmulo condicionado, se divide el valor resultante por el nmero de respuestas al estmulo acstico cuando se ha presentado solo y finalmente se multiplica por 100. Los valores positivos indican que el tono aumenta la respuesta de sobresalto inicial; en cambio, los valores negativos sugieren una reduccin en la respuesta cuando se presenta el estmulo condicionado. El tercer da se aplica el tono (estmulo condicionado) seguido de un shock elctrico (estmulo no condicionado) y la asociacin entre ambos estmulos se repite diez veces, con un intervalo entre pruebas de 90 a 180 segundos. Transcurridas 24 horas, los animales se evalan del sobresalto potenciado por el miedo bajo las mismas condiciones utilizadas el segundo da, midiendo la potenciacin del sobresalto con la misma frmula utilizada en el precondicionamiento. En los animales que hayan adquirido el sobresalto potenciado por el miedo, el porcentaje de potenciacin debera ser ms alto tras el condicionamiento.

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CONCLUSIONES Los modelos animales de trastornos cognitivos desempean un papel clave en la comprensin de las bases neuroqumicas de la funcin/disfuncin cognitiva. Con su utilizacin podemos profundizar en las bases fisiopatolgicas del deterioro que se produce por el simple hecho de envejecer o el que aparece asociado a diferentes situaciones patolgicas, como la enfermedad de

Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, las demencias vasculares, la angiopata amiloide cerebral, las enfermedades prinicas, la esclerosis lateral amiotrfica, la enfermedad de Huntington, la esquizofrenia y otras enfermedades neurodegenerativas. Adems, los modelos animales nos permiten comprobar la eficacia de nuevos frmacos e identificar posibles dianas teraputicas.

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METHODS TO EVALUATE COGNITIVE DISORDERS IN ANIMAL MODELS Summary. Introduction. The increasing prevalence of cognitive dysfunction and dementia associated, among others, to population aging in developed countries has grown a great interest in the study of the etiopathogenesis of cognitive deficit and the likely pharmacological targets which improve intellectual function or alter the neurodegeneration underlying these symptoms. Development and conclusions. An essential tool for that purpose is the use of animal models of human-related pathologies which clinically develop with cognitive impairment and dementia. In this review we will analyse the animal models of these disorders and, specially, the main tests that, by means of the observational evolution of the experimental animal, allow assessing its cognitive functions and its modification by experimental treatments that are wanted to investigate for its eventual introduction into clinics. [REV NEUROL 2008; 47: 137-45] Key words. Animal models. Attention. Behaviour. Cognitive impairment. Dementia. Memory.

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