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UNIDAD IZTAPALAPA DIVISIN DE CIENCIAS BSICAS E INGENIERA

CALOR DE ADSORCIN Y ESTUDIOS DE ACTIVIDAD CATALTICA DE UNA ENZIMA SULFHIDRLICA SOBRE SiO2 MESOPOROSO CON ALTA REA ESPECFICA.

ASESOR(A): DRA. SILVIA SOLS MENDIOLA

ALUMNO: JUAN CARLOS MARTNEZ HERNNDEZ

LICENCIATURA EN QUMICA

MATRCULA: 200318316

DICIEMBRE 2004

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NDICE Pgina 1. INTRODUCCIN. 1.1. 1.2. Quimisorcin y adsorcin fsica sobre materiales slidos Las enzimas y su inmovilizacin 3 3 3 4 5 5

1.2.1. Enzimas tilicas 1.3. 1.4. El efecto del pH en las enzimas Slice

2. OBJETIVO 2.1. Objetivos particulares

6 6

3. MATERIALES Y MTODOS 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. Reactivos Equipos Datos del slido mesoporoso Determinacin de papana adsorbida y su calor de adsorcin

6 6 7 7 7 8 13 13 13

3.4.1. Adsorcin de la enzima 3.5. Medicin de actividad de la enzima inmovilizada

3.5.1. Preparacin de soluciones 3.5.2. Medicin de la actividad especfica de la papana

4.

CONCLUSIONES

15

5.

PERSPECTIVAS

15

6.

REFERENCIAS

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1. INTRODUCCIN.

1.1. Quimisorcin y adsorcin fsica sobre materiales slidos. La adsorcin sobre slidos porosos se clasifica en adsorcin fsica (fisisorcin) y adsorcin qumica (quimisorcin), la lnea de divisin entre ambas no est siempre muy clara; en la adsorcin fsica, las molculas se mantienen unidas a la superficie del slido por medio de las fuerzas intermoleculares de Van der Waals, relativamente dbiles. En la quimisorcin se produce una reaccin qumica en la superficie del slido, mantenindose as una unin entre la molcula adsorbida y el slido mediante enlaces qumicos relativamente fuertes. Los cambios de entalpa que aparecen en la quimisorcin suelen tener una magnitud considerablemente mayor que los de la adsorcin fsica. Normalmente H para la quimisorcin se encuentra en el intervalo de -40 a 800 KJ/mol, mientras que para la fisisorcin va de -4 a 40 kJ/mol [**1].

1.2. Las enzimas y su inmovilizacin. Una enzima es una sustancia proteica que acta como catalizador de una

reaccin biolgica. Como todos los catalizadores, las enzimas no afectan la constante de equilibrio de una reaccin y no pueden ocasionar un cambio qumico que sea desfavorable. Las enzimas solamente actan para abatir la energa de activacin para una reaccin, con lo que aceleran dicha reaccin. A diferencia de muchos de los catalizadores que los qumicos usan en el laboratorio, los procesos catalizados por enzimas por lo general presentan ciertas ventajas frente a catalizadores no biolgicos; las enzimas en su actividad cataltica muestran una gran especificidad hacia ciertos sustratos. Con frecuencia, una

enzima solo catalizar una reaccin de un nico compuesto, que se llama sustrato de la enzima. Por ejemplo, la enzima amilasa, que se encuentra en el conducto digestivo humano, nada ms cataliza la hidrlisis del almidn para dar glucosa; no ataca la celulosa ni otros polisacridos [**2].

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La catlisis enzimtica est caracterizada por selectividades muy elevadas y bajas temperaturas. La actividad cataltica de las enzimas es muchsimo mayor que en los catalizadores inororgnicos: 1 mol de alcohol hidrogenasa transforma por segundo 720 mol de alcohol en cido actico a 25 C, mientras que a 200 C los catalizadores industriales (platino) transforman entre 0.1 y 1 mol de alcohol por mol de catalizador. A una temperatura de 0 C la catalasa descompone 200,000 mol de H2O2 por mol de enzima por segundo, en tanto que el catalizador inorgnico ms activo (Pt) descompone a 20 C, 10-18 mol de H2O2 por mol de catalizador por segundo [**3]. 1.2.1. Enzimas tilicas y su actividad cataltica En el caso de enzimas tilicas, contienen una cistena en el sito activo; la especificidad hacia ciertos sustratos lo determina el grupo tiol (-SH) de esta cistena. Estas enzimas son muy activas a temperatura ambiente y presin atmosfrica [**4]. Diferentes enzimas tienen especificidades distintas. Algunas como la amilasa, son especficas para un sustrato nico, pero otras actan sobre un conjunto de sustratos. Por ejemplo, la papana, una protena globular de 212 aminocidos, aislada de la papaya, cataliza la hidrlisis de muchas clases de enlaces pptidos. Su capacidad para hidrolizar los enlaces pptidos la vuelven til como ablandador de carne y limpiador de lentes de contacto [**2]. La papana es de gran importancia en las industrias cervecera (para evitar turbidez de la cerveza al congelarla), de carnes (porque degrada protenas de alta masa molecular), textil (para desengomar la seda), de alimentos, diettica, de jugos y farmacutica. La papana es una de las proteasas sulfhidrlicas aislada del ltex de la fruta verde de Carica Papaya. La actividad de la papana puede ser determinada mediante una medicin de la velocidad de digestin de protenas, o por seguimiento de la velocidad de hidrlisis de sustratos semejantes de baja masa molecular. Ambos tipos de sustratos son ampliamente usados. En su estado nativo la papana presenta muy baja actividad; por lo que todos los ensayos sobre su actividad son realizados en presencia de activadores,

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comprendiendo cistena (0.005M). Los ensayos de la actividad proteoltica se basan en la estimacin de la cantidad de productos de digestin de baja masa molecular (solubles en TCA), formado de protenas en la presencia de la enzima; la casena puede servir como sustrato. El procedimiento para el ensayo con casena generalmente sigue el mtodo de Kunitz a pH=8, adaptado para la

papana [**5]. En lo que se refiere a la inmovilizacin de enzimas, la biotecnologa ha experimentado grandes avances en diversas aplicaciones. La inmovilizacin de enzimas permite mejorar la estabilidad y reutilizacin de stas, lo cual disminuye el costo de un proceso de una forma tal que se han visto beneficiadas las industrias farmacutica y de alimentos, as como las de tratamiento de residuos; esta ltima implica que se pueden utilizar enzimas inmovilizadas para combatir ciertos contaminantes ambientales. En general, los mtodos de inmovilizacin como el atrapamiento o la adsorcin hacen que la unin de la enzima con el soporte sea dbil pero a su vez ms fcil [**6], [**7]. 1.3. El efecto del pH en las enzimas. Tomando en cuenta el punto isoelctrico de la enzima y sabiendo que es polielectrnica, entonces la variacin del pH en la solucin tiene un efecto importante sobre la velocidad de adsorcin, ya que al implicar una variacin de la forma inica de la enzima, tiene efectos importantes en las interacciones enzimaadsorbente. En teora, debe de existir un pH ptimo en el cual la cantidad de enzima que se adsorbe debido a sus cargas, es mayor [**6]. 1.4. Slice. Las propiedades del slido adsorbente son de mucho inters, en el caso de la slice, se sabe que se disuelve en agua a pH mayores a 8, aunque algunas calidades de este material son estables a pH 9 10. Se sabe que la slice tiene un rea especfica de varios centenares de metros cuadrados por gramo y su superficie puede contener hasta 8 micromoles de grupos silanol (Si-OH) por

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metro cuadrado. Todos los grupos silanol est protonados entre pH 2 y 3, pero a pH mayores se disocian formando grupos Si-O-, los cuales retienen con fuerza a bases protonadas [**8]. En el presente trabajo se da importancia al calor de reaccin involucrado en la adsorcin de la papana (masa molecular de 23,400 daltons) sobre slice, aunque tambin se presentan estudios de la actividad de la papana.

2. OBJETIVO. - Determinar la actividad cataltica especfica de la papana inmovilizada, a travs del proceso de adsorcin sobre SiO2. 2.1. Objetivos particulares. Estudiar la adsorcin de la papana, utilizando soluciones de papana con diferente pH. -Estudiar el calor de adsorcin de la papana, midiendo el calor de reaccin en un calormetro. -Utilizar el mtodo de Kunitz y realizar una adaptacin del mismo, para medir actividad enzimtica a diferente pH.

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1. Reactivos. -Papana (Sigma: P-4762, Lote 127F8075, EC. 3.4.2.2.2, doblemente cristalizada. -cido actico glacial al 99.7 %, glicina, sales de potasio (KH2PO4, K2HPO4) y Tris (hidroximetil) aminometano. - Slice (SiO2) Sintetizado por el mtodo sol-gel, en el rea de catlisis de la UAM Iztapalapa. -CIS: Solucin de cistena a una concentracin 1.0 M en buffer de fosfatos 0.05M y pH=7 -CAS: Solucin de casena al 1% utilizando agua como solvente -TCA: cido Tricloro Actico al 5% con agua como solvente

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-EDTA: cido etilendiamina 0.02 M en solucin reguladora de fosfatos 0.05 M a pH 7. 3.2. Equipos. -Calormetro SETARAM para determinar calor de reaccin a travs de una seal de cambios de voltaje. -Espectrofotmetro UV-VIS para medir absorbencias y determinar concentracin. 3.3. Datos del slido mesoporoso. El slice (SiO2) que se utiliz, se calcin a 400 C, dando un rea especfica mxima de 788 m2/g, de los cuales 633 m2/g corresponden al rea externa y 155 m2/g al rea de los poros. Los dimetros de poros obtenidos oscilan entre 20 y 10 nm principalmente. Se pueden adsorber 0.3 ml de CO2 gaseoso en una masa de 130 mg de slice, lo cual indica que existen sitios bsicos. Este slido es muy estable en presencia de soluciones reguladoras si la concentracin de stas es 0.05 M y no hay agitacin fuerte durante el contacto. 3.4. Determinacin de papana adsorbida y su calor de adsorcin. Se prepararon soluciones reguladoras de glicina (pH 3, 9 y 10), acetatos (pH 4 y 5), fosfatos (pH 6 y 11), y Tris (pH 7 y 8); todas en volmenes de 100 mL con una concentracin 0.05 M. Se pesaron 1.34 mg de papana y se disolvieron en 3 mL de una solucin reguladora. Se midi la absorbancia de esta solucin y despus se determin su concentracin de papana en el equipo UV-VIS utilizando una celda de cuarzo de 1.0 cm y un coeficiente de extincin de 2.39 mg-1cm-1mL [**9]. Se prepararon por duplicado 3.0 mL de solucin (una se adicion al portamuestra del calormetro y otra a un tubo de ensayo que se mantuvo en bao mara. Las soluciones correspondientes a pH superiores a 6 se filtraron con una membrana especial de nitrato de celulosa, para evitar que la protena que no se disolvi, afectara la lectura de absorbancia.

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3.4.1. Adsorcin de la enzima. El estudio de los porcentajes de enzima adsorbida as como el calor de adsorcin para la misma, se realizaron estando sta en solucin. Se tom la consideracin de que la papana se adsorbe junto con su solvente, ya que ste es el medio de transporte que utiliza la papana.

El estudio de % adsorcin se hace en un bao mara y el estudio de calor de adsorcin en un calormetro. Se utilizaron soluciones reguladoras con diferentes valores de pH, incluyendo el agua; todos los estudios a las condiciones de presin atmosfrica y temperatura a 30 OC.

El mtodo para cada muestra en el calormetro es el siguiente: la SiO2, se trata a 400 C cPgina: 8 [0]on la finalidad de activar la superficie, eliminando grupos OH-, y haya una mejor adsorcin para la enzima. Se deja enfriar al vaco para que no adsorba gases; posteriormente se pesan 0.5 g; esta masa y la solucin respectiva de papana se colocan en el portamuestra del calormetro, el cual tiene dos compartimentos, uno superior que contiene a la solucin y otro inferior que contiene a la slice. Se inicia un programa que tiene como finalidad estabilizar la seal a 30 C, este proceso lleva aproximadamente 100 minutos; despus se abre la llave para dejar caer la solucin (3 mL) hacia la slice, con esto se genera un pico que corresponde al calor de adsorcin y cuya seal es en microvolts. Esta seal dura 100 minutos aproximadamente teniendo un mximo a los 4 minutos. Haciendo una conversin mediante el clculo de reas, se puede obtener el calor de adsorcin en J/g SiO2. La muestra en reaccin se mantiene a 30 C durante 24 horas para que llegue al equilibrio, despus de esto se mide su absorbancia y su pH.

Por otro lado, en un bao mara se repite cada experimento, pero ahora se toman alcuotas de 50 microlitros cada 5 minutos durante 30 minutos y cada 10 minutos durante la siguiente hora; estas alcuotas se diluyen a 1200 microlitros para poder medir su absorbancia y despus se hace el clculo para tener la absorbancia en la

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solucin sobrenadante. La mezcla en reaccin se deja llegar al equilibrio en 24 horas, manteniendo la temperatura a 30 C y midiendo nuevamente su absorbancia despus de este tiempo. En el bao mara se obtiene la absorbancia del sobrenadante en un tiempo de 90 minutos, y con estos valores se puede obtener el porcentaje de papana enlazado al SiO2 durante este tiempo; este paso es necesario ya que se relaciona con el calor de adsorcin obtenido en el calormetro. Se utiliza un coeficiente de extincin de 2.39 L-1g-1cm-1, una longitud de celda de 1 cm y longitud de onda de 280 nm. Al dejar la mezcla durante 24 horas a 30 C se tienen las

concentraciones de equilibrio, lo cual nos sirve para ver que cantidad de enzima se adsorbe en total.

3000

EXO

pH 5
2500

ENDO

Calor ( volts)

2000

1500

1000

500

0 0 10 20 30 40 50 60

tiempo (minutos)

Fig. 1. Seal correspondiente al calor de adsorcin de una solucin de papana sobre 0.5 g de SiO2 ; observada en el calormetro SETARAM.

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% adsorcin papana

100 80 60 40 20 0 2 3 4 5 6 7 8 pH 9 10 11 12

ads90min adsEquil

Fig. 2. Porcentaje de adsorcin a diferentes pH; durante los primeros 90 minutos y en el equilibrio; ambos obtenidos en un bao mara.

Es muy conveniente comenzar con las mismas concentraciones, sin embargo, la disolucin de la papana es muy difcil en soluciones reguladoras con pH

superiores a 6, ya que forma conglomerados y se precipita, por lo que alcanzar una concentracin de 0.33 mg/mL implica perder una cantidad considerable de enzima en forma de precipitados.

12 pH final 10 8 6 4 2 2 3 4 5 6 7 8 pH inicial 9 10 11 12

Exp. teorico

Fig. 3. El pH de la solucin de papana antes y despus de la adsorcin. Se esperaba que no hubiese variacin del pH, sin embargo al terminar la adsorcin

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se toma lectura del pH en la solucin sobrenadante y se observa que a partir de pH 6 hay cambios en el valor experimental. De acuerdo a la Fig. 2, el regulador a pH=5, es el segundo pH (despus de pH 9) en el cual se adsorbe ms papana durante los primeros 90 min.; adems no necesita filtracin en la preparacin de la papana ya que sta se disuelve bien en pH=5. Por consiguiente, en bao mara se realizan estudios de muestras a pH 5 pero con diferentes concentraciones de papana en la solucin inicial.

% papana adsorbida

80 60 40 20 0 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 ads90min adsEquil

concentracion de papaina (mg/mL)

Fig. 4. Adsorcin de papana a pH=5, con diferentes concentraciones de papana.

En el calormetro se obtiene la energa en Joules que corresponde a la curva de adsorcin a 30 C y a un pH especfico. Los valores de % papana adsorbida calculado en las muestras del bao mara durante los primeros 90 minutos, se utilizan para relacionar la masa de papana adsorbida en las muestras del calormetro. Al final se relaciona el calor de adsorcin con la masa de papana adsorbida. Este mismo procedimiento se repite en muestras diferente concentracin de papana. a pH 5 y con

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0.115 0.105 Q (J/g SiO2) 0.095 0.085 0.075 0.065 0.055 2 3 4 5 6 7 pH 8 9 10 11 12

Fig. 5. Energa de adsorcin correspondiente a cada muestra, tomando en cuenta la seal del calormetro durante los primeros 90 minutos. La adsorcin de la solucin enzimtica sobre 0.5 g de SiO2, muestra que solamente a pH =3 hay un valor de calor de adsorcin ms bajo; en los otros pH los valores de adsorcin son muy similares.

0.098 Joule/g solido 0.096 0.094 0.092 0.090 0.088 0.086 0.15 0.088 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.090 0.096

mg papana/mL

Fig. 6. Calor de adsorcin para soluciones a pH=5, con diferente concentracin de papana, adsorbidas en 0.5 g de SiO2. EL tiempo de reaccin considerado es 90 minutos.

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3.5. Medicin de actividad de la enzima inmovilizada

3.5.1. Preparacin de soluciones. -CIS: Se pesan 0.1756 g cistena y se disuelven en 1.0 mL de buffer fosfatos. -CAS: 0.2 g de casena se adicionan a 20 mL de agua desionizada; se lleva a 40 C y se adicionan 2 gotas de NaOH 1.0 M (en caso que la casena no se disuelva, se puede agregar otra gota de NaOH); esta solucin puede guardarse hasta por una semana en refrigeracin a 4 C. -TCA: 3.0 g de TCA se disuelven en 60 mL de agua desionizada. -EDTA: cido etilendiamina 0.02 M en solucin reguladora de fosfatos 0.05 M a pH 7. 3.5.2. Medicin de la actividad especfica de la papana. Tomando como referencia el mtodo de Kunitz, se midieron las actividades de la enzima inmovilizada a diferentes valores de pH; teniendo cuidado de no cambiar el pH durante la reaccin. Se mide la cantidad de papana adsorbida al SiO2, antes de medir la actividad cataltica enzimtica. Posteriormente se preparan a 30 C las soluciones testigo que contienen 0.7 mL de buffer al pH de adsorcin, 0.05 mL CIS, 0.25 mL EDTA, 3.0 mL TCA y 1.0 mL CAS; al mismo tiempo se preparan las muestras de

reaccin que contienen papana inmovilizada en SiO2 (libre de lquido o sobrenadante), 0.7 mL de buffer al pH de adsorcin, 0.05 mL CIS, 0.25 mL EDTA (dejar 5 minutos en reaccin para activar a la papana), 1.0 mL CAS (se deja en reaccin 10 minutos) y 3.0 mL TCA. Despus se separa el sobrenadante y se lleva a centrifugacin para as medir la absorbencia de las soluciones testigo y de las muestras centrifugadas; con estos datos se calcula la actividad cataltica

especfica de la papana adsorbida.

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Actividad especfica

0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 2 4 6 pH 8 10 12

Fig. 7. Actividad especfica a diferente pH, de la papana adsorbida en SiO2 y a 30 C; tomando 10 minutos de reaccin entre sustrato y enzima.

En los pH 3, 4 y 5 la solubilidad de la enzima es muy buena ya que estamos alejados de su punto isoelctrico, sin embargo a pH 3 y 4, la adsorcin no es muy eficiente, debido a que tanto enzima como slice tienen carga positiva en mayor proporcin. A partir de pH 6 comienza la presencia de enzimas con carga cero y que no son fciles de solubilizar. En consecuencia se elige pH 5 para hacer estudios de adsorcin a diferente concentracin de papana. La slice, a pH cercano a 2 y 3, an tiene sus grupos silanol (Si-OH), pero a partir de pH 4 comienza a tener grupos silanol desprotonados que provocan una disminucin de pH hacindose ms evidente a partir de pH 6, ya que una mayor cantidad de protones en el medio acuoso (sobrenadante) ocasiona la disminucin del pH. Por lo tanto no es muy conveniente hacer los estudios de adsorcin a pH altos ya que la conformacin nativa de la enzima podra verse afectada durante la reaccin de adsorcin, porque el pH a veces disminuye en forma drstica como se ve en la Fig. 3.

La Fig. 7 muestra que la papana adsorbida tiene la mayor actividad cataltica en la muestra adsorbida a pH=10; tal vez se debe a que durante la adsorcin el pH

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disminuye hasta un valor de 8 (ver Fig. 3) lo cual probablemente mantiene a la papana ms estable 4. CONCLUSIONES.

La baja actividad es provocada probablemente por alguno de los siguientes factores: a) la enzima se adsorbe al SiO2 a travs de su sitio activo; b) la reaccin es lenta debido a la poca movilidad de la enzima; y c) si el pH es bajo, la casena es poco soluble y no alcanza a interaccionar con la papana adsorbida que tambin es menos en pH bajo. Por lo tanto, se debe cuidar que no vare el pH durante la adsorcin, as como evitar estudios de actividad en pH iguales o menores a 5. 5. PERSPECTIVAS

Respecto a

la Actividad Cataltica Especfica

de la Enzima, es conveniente

realizar otros estudios como los siguientes: -Inhibir a la papana de manera reversible antes de la inmovilizacin. Si la enzima se inhibe antes de la adsorcin, no se pegar al slido utilizando su sitio activo. Se debe tener claro que, antes de medir la actividad cataltica debe quitarse la inhibicin para que el sitio activo de la enzima reaccione con el sustrato. -Dejar ms tiempo de reaccin entre la enzima y el sustrato. La enzima al estar adsorbida tiene poca movilidad por lo que debe esperar que el sustrato llegue hasta ella para poder reaccionar, si se deja ms tiempo de reaccin probablemente se tengan mejores resultados.

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6. REFERENCIAS.

[**1]. FISICOQUMICA, Ira N. Levine, Cuarta edicin, volumen 1, Pg. 393-399, FUNDAMENTALS OF ADSORTION, Athanasios I. Liapis, Editor.

[**2]. Qumica Orgnica, John McMurry, Quinta edicin.

[**3]. CATALIZADORES La piedra filosofal del siglo XX?, Sergio Fuentes Moyado, Gabriela Daz guerrero; SEP; La ciencia desde Mxico.

[**4]. BIOQUMICA; Pea, Arroyo, Gmez, Tapia, Gmez; segunda edicin.

editorial Limusa,

[**5]. Methods in enzymology, Volume XIX, Proteolitic Enzymes; Sydney P Colowick, Nathan O. Kaplan.

[**6]. Inmobilized enzymes: Theory, methods of study and applications; Miguel Arrollo; Ars Pharmaceutica 39:2, 23-39, 1998.

[**7]. Enzyme and Microbial Technology, Volume 35, Issue 1, 6 July 2004, Pages 15-21.

[**8]. Anlisis Qumico Cuantitativo, Daniel C. Harris, 2da. Edicin.

[**9]. Interaction of cisteine proteinase inhibitor chicken cystatin with papain; Peter Lindahl, Eva Alriksson, Hans Jrnvall and Ingemar Bjrk; Biochemistry 1988, 27, 5074 5082.