INFORME DE PRCTICAS BIOTECNOLOGA 2CFGS ANLISIS Y CONTROL DE CALIDAD P-3: EXTRACCIN ADN DE LA CEBOLLA

FECHA: 10/12/12 ALUMNA: ALEXANDRA HUESCA SORIANO

NDICE
NDICE...PG-1 OBJETIVO..............................................................................PG-2 FUNDAMENTO....PG-2 MATERIALES Y REACTIVOSPG-2 a 3 PROCEDIMIENTO..PG-3 a 4 DIAGRAMA BLOQUES..PG-4 IMGENESPG-4 DATOS OBTENIDOS..PG-5 BIBLIOGRAFA.PG-5

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OBJETIVO:
Aprender a: Extraer el ADN de un vegetal, en este caso una cebolla. Purificar y cuantificar el ADN.

FUNDAMENTO:
La ingeniera gentica engloba todo una conjunto de tcnicas cuyo objetivo consiste en modificar la informacin gentica de un organismo de forma dirigida; por ejemplo, introducindole un fragmento de ADN procedente de otro organismo diferente. A los organismos cuyo material gentico ha sido alterado por tcnicas de ingeniera gentica, independientemente de cul haya sido su finalidad de esta alteracin, se les llama organismos modificados genticamente o, de forma abreviada, OMG. Si esta modificacin ha consistido en incorporar en los individuos uno o ms genes que antes no tenan, tambin se les puede denominar organismos transgnicos . Para modificar genticamente un organismo, lo primero que tenemos que hacer es identificar la nueva caracterstica que queremos que ste adquiera. Para obtener ese gen X que le proporcionar la nueva caracterstica a nuestro organismo y conseguir que lo adopte y lo ponga en manifiesto, se deben realizar tres pasos: 1) Obtener el ADN del organismo de origen. 2) Conseguir muchas copias del gen. 3) Transferir el gen al organismo receptor.

Nosotros en esta prctica nos centraremos en el primero de los pasos.

MATERIALES Y REACTIVOS:
EXTRACCION: Agua destilada NaCl Bicarbonato sdico (NaHCO 3) Sodio Dodecylsulfato (SDS) Tubos centrifuga Asa de platino estril Alcohol isoamlico Cebolla Batidora Centrifuga Pipetas diferentes volmenes Espectrofotmetro UV

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CUANTIFICACIN: Tris base ( [tris(hidroximetil)aminometano] ) EDTA (sal disdica) cido clorhdrico (HCl) Sucrosa (sacarosa) Fenol Cloroformo Isopropanol Acetato de sdio 3M (CH 3COONa) Etanol fro 100% Etanol 70% Centrifuga Tubos centrifuga Pipetas varios volmenes Matraces aforados Campana de gases Espectrofotmetro UV

PROCEDIMIENTO:
EXTRACCIN ADN: 1) Preparar el tampn que ayudar a romper la membrana celular: - 120mL de H2O + 1,5g de NaCl + 5g NaHCO 3 + 5mL SDS (10%), mantener en nevera. 2) Preparar la muestra para la extraccin: - Lavar y trocear la cebolla. - Triturar la cebolla con la batidora, le aadimos un pequeo volumen de agua destilada para facilitar el movimiento de las cuchillas de la batidora. - Mezclar 5mL de triturado (liquido y slido) con 10mL de tampn. - Tapar el tubo con parafilm y agitar con el agitador magntico 1 minuto. - Centrifugar a 1000rpm durante 5 minutos, 3) Aislar y extraer el ADN: - Pipeteamos 5mL del lquido clarificado sobrenadante y vertemos los 5mL en un tubo de centrifuga. - Aadir 10mL de alcohol isoamlico, dejando que se deslice lentamente por la pared del tubo. - Centrifugar a 1000rpm durante 1 minuto. - Extraer las hebras de ADN con el asa de siembra estril y suspenderlas en unos 2mL de agua destilada. 4) Determinar la concentracin y la pureza del ADN: - Medir la absorvancia a 260 y 280nm. - Calcular la pureza del ADN (A260/A280).
*(mantener el ADN en nevera durante la preparacin de la cuantificacin). Pgina | 3

CUANTIFICACION ADN: 1) Preparar el tampn TE-sucrosa: - Pesar 0,3025g de [tris(hidroximetil)aminometano] . - Aadir HCl(R=37%) hasta conseguir un pH=8 (unas pocas gotas). - Aadir 0,0725g de EDTA-Na2. - Aadir 62,5g de sacarosa. - Aforar todo a 250mL con agua destilada. 2) Preparacin la purificacin del ADN: - Se prepara una disolucin con 25 partes de fenol, 24 partes de cloroformo y 1 parte de alcohol isoamlico (esto permite la extraccin de las protenas). - Como tenemos 2mL de H2O destilada aadimos 2mL de la disolucin. - Tapar el tubo con parafilm y agitar enrgicamente medio minuto. - Centrifugar a 2000rpm unos 5 minutos. - Eliminar la fase no acuosa del tubo (nos queda mas o menos 1mL). - Suspender el restante en una mezcla de 5 gotas de acetato de sodio 3M (CH3COONa) y el doble del volumen de muestra de etanol 100% (unos 2mL en nuestro caso). - Introducir la muestra 30 minutos en el congelador. - Centrifugar a 1000rpm dos minutos y eliminar el sobrenadante. - Lavar con etanol al 70% para eliminar el resto de protenas. - Centrifugar y eliminar el sobrenadante. - Re-suspender en Te-sucrosa (el volumen de la cubeta del espectrmetro). 3) Leer la absorvancia a 260 y 280nm.

DIAGRAMA DE BLOQUES:
PREPARAR TAMPN CON SDS PREPARACION MUESTRA AISLAR Y EXTRAER EL ADN DETERMINAR CONCENTRACION Y PUREZA DEL ADN

LECTURA ABSORVANCIA

PURIFICAR EL ADN EXTRADO

PREPARAR TAMPN TE-SUCROSA

IMGENES:

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DATOS OBTENIDOS:
DISOLUCIN A A LONGITUD ONDA 260nm 280nm ABSORVANCIA 3,26 3,10

CONCLUSIN:
No podemos saber la pureza del ADN obtenido ya que la lectura de absorvancia es mayor a 1 y esto nos indica que el espectrmetro no funciona bien en modo UV. Aunque la muestra estuviese contaminada de protenas, no dara una lectura tan alta. Con lo cual tampoco podremos cuantificar la cantidad de ADN que hemos obtenido.

BIBLIOGRAFA:
Barrado de Alvaro M., Corts Lagoa C., Gallego Acero M., Gmez GmezMascaraque L. (2011). Biotecnologa. Vida al servicio de la vida. Creaciones Copyright (p.18-21).

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