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Bioqumica y Biologa Molecular

CIDOS NUCLEICOS
1. Composicin de los cidos nucleicos 2. Estructura de los nuclesidos y nucletidos 3. Estructura del ADN y de los ARNs

1. Composicin de los cidos nucleicos Los cidos nucleicos son polinucletidos, es decir, polmeros resultantes de la unin mediante enlace fosfodister de un nmero variable de unidades monomricas bsicas, denominadas nucletidos. Un nucletido est formado por tres componentes. Una pentosa, un compuesto heterocclico nitrogenado (base nitrogenada) que junto con la pentosa forma un nuclesido, y una molcula de cido fosfrico. Los nucletidos tienen papeles muy variados dentro del metabolismo celular. Son la moneda energtica en el metabolismo (ej: ATP), son mensajeros qumicos secundarios en la respuesta celular a los estmulos inducidos por hormonas o agentes externos (ej.: AMPc), constituyen una serie de importantes cofactores enzimticos y, por supuesto, son los constituyentes de los cidos nucleicos: ribonucleicos (ARN) y desoxiribonucleicos (ADN).

Pentosas La ribosa o -D-ribofuranosa es la pentosa caracterstica de los ARN (cidos ribonucleicos) y la desoxirribosa o 2`-desoxi- -D-ribofuranosa la de los cidos desoxirribonucleicos (ADN) (Figura 1).

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HOCH2 O

OH

HOCH2 O

OH

Figura 1. Pentosas componentes de los cidos nucleicos.

OH ribose

OH

OH

(no O)

deoxyribose

Bases nitrogenadas pricas y pirimidnicas En la Figura 2 se representan las estructuras y los nombres de los compuestos nitrogenados aislados en la hidrlisis de los cidos nucleicos. Tres de ellos derivan de la pirimidina y son la citosina, uracilo y timina, y los otros dos derivan de la purina y son la adenina y la guanina. Cuando estos compuestos se disuelven en agua originan una disolucin de carcter bsico, por lo que se conocen con el nombre de bases nitrogenadas .

Fig.2 Estructura de las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos. Bases pricas y pirimidnicas

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Los tomos de los anillos de estas cinco bases se numeran de la misma manera que los anillos de pirimidina y purina. Esta numeracin es importante y se har referencia a ella ms adelante. Tanto el ADN como el ARN contienen adenina, guanina y citosina, si bien el uracilo slo est presente en el ARN, mientras que la timina lo est nicamente en el ADN. Es importante destacar el carcter aromtico de las bases nitrogenadas, que hace que los cidos nucleicos absorban en el UV a unos 260 nm. Son estructuras casi planas y tienen la peculiaridad de que pueden presentar diferentes formas tautmeras. Por ejemplo, la citosina puede estar en forma lactmica (normal) y entonces se empareja con la guanina, pero puede tambin adoptar forma lactmica y entonces es ms estable su unin a la adenina, lo que facilita las mutaciones espontneas y por tanto la evolucin. Adems de estas cinco bases mayoritarias los cidos nucleicos pueden contener pequeas proporciones de otras bases, normalmente derivados metilados o hidroximetilados de las bases principales.

2. Estructura de los nuclesidos y nucletidos Nuclesidos Los nuclesidos son los compuestos resultantes de la unin de las pentosas y de una base nitrogenada. Estos compuestos se unen con prdida de una molcula de agua, a travs del tomo de carbono 1' del azcar y el tomo de nitrgeno 1 de la base pirimidnica o el tomo de nitrgeno 9 de la base prica, como se indica en la Figura 3. Obsrvese que el enlace N-glucosdico es siempre .

H 2N N HOCH2
Figura 3. Estructura de nuclesidos. dos

N N N HOCH2 O N

H 2N N N

OH

Adenosina

OH

Desoxiadenosina OH H

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Los nombres de los nuclesidos indican su estructura. As, si el nuclesido est formado por una ribosa y una base prica, se nombra cambiando la terminacin -ina de la base por -osina (por ejemplo, de la guanina y la ribosa obtenemos la guanosina), mientras que si se trata de una base pirimidnica la terminacin cambia a -idina (de timina y ribosa obtenemos el nuclesido timidina). Por su parte, si el nuclesido se forma con desoxirribosa, delante del nombre obtenido habr que colocar el prefijo desoxi- (de adenina y desoxirribosa se obtiene el nuclesido desoxiadenosina). La Tabla 1 recoge el nombre de todas las combinaciones posibles (si bien la timidina y la desoxiuridina no existen en los cidos nucleicos naturales).

Tabla 1. Nomenclatura de los nuclesidos.

Bases pricas A G Bases pirimidinicas C U T Citosina Uracilo Timina Adenina Guanina

Nuclesido Adenosina Guanosina Citidina Uridina (Timidina)

Desoxinuclesido Desoxiadenosina Desoxiguanosina Desoxicitidina (Desoxiuridina) Desoxitimidina

Nucletidos Los nucletidos son steres fosfricos de los nuclesidos. Todos los nucletidos naturales poseen el grupo fosfato unido al tomo de carbono 5' de la pentosa. En la Figura 4 se indica cmo se une el cido fosfrico con dos nuclesidos diferentes para formar los correspondientes nucletidos, en una reaccin que tambin implica prdida de una molcula de agua.

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NH2 N O O
-

O O CH 2 O

P O-

Figura 4. Estructura nucletido. de un

OH deoxyctyidine monophosphate (dCMP)

Los nucletidos se denominan combinando el nombre del nuclesido del que proceden con la palabra monofosfato. As, el ster fosfrico de adenosina se denomina 5'-monofosfato de adenosina (Tabla 2).

Tabla 2. Nomenclatura de los nucletidos monofosfato.

Bases pricas A G Bases pirimidinicas C U T Citosina Uracilo Timina Adenina Guanina

Nucletido Monofosfato de adenosina Monofosfato de guanosina Monofosfato de citidina Monofosfato de uridina

Desoxinuclesido Monofosfato desoxiadenosina Monofosfato desoxiguanosina Monofosfato desoxicitidina de de

de

Monofosfato desoxitimidina

de

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Por otro lado, los ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos corrientes aparecen en las clulas no solamente en forma monofosfato, sino que tambin pueden aparecer en forma de 5'-difosfatos (con dos molculas de fosfrico) o bien 5'-trifosfatos (con tres molculas). As los derivados de la adenosina, seran: AMP : 5'-monofosfato de adenosina ADP : 5'-difosfato de adenosina ATP : 5'-trifosfato de adenosina. Los nucletidos trifosfato (NTPs) desempean diversas funciones en las clulas. As, el ATP, es un transportador de fosfato y de pirofosfato en numerosas reacciones enzimticas en las que se requiere aporte energtico (aunque tambin pueden realizar esta funcin el GTP, el UTP y el CTP). Por otro lado, algunos NTPs, pueden actuar como transportadores de restos de azcares (energetizados) en la biosntesis de polisacridos. Por supuesto, la funcin principal de los NTPs, es la de actuar como precursores en la biosntesis enzimtica de los cidos nucleicos.

3. Estructura del ADN y de los ARNs El cido desoxirribonucleico (ADN) est constituido por cadenas de desoxirribonucletidos y el cido ribonucleico (ARN) por cadenas de ribonucletidos (ambas monofosfato). Kas uniones entre nucletidos se realizan mediante enlaces fosfodister (Figura 5).

NH2 N N

O P O C H2 N ON O - NH2 N O OH N O P O CH2 N ON O- NH2 N O OH N

Figura 5. Enlace fosfodister nucletidos. entre

O P O C H2 N ON OO OH

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Entre el ADN y el ARN, existen tres diferencias claras: el azcar integrante del ARN es la ribosa el ARN contiene uracilo en lugar de timina el ARN est formado por una nica cadena

Adems, existen tres tipos diferentes de ARN, cada uno de los cuales desempea una funcin diferente, el mensajero (ARNm), el transferente (ARNr) y el ribosmico (ARNr). Podemos distinguir varios niveles estructurales en los cidos nucleicos. La estructura primaria o secuencia indica el orden en que se encuentran los nucletidos. La ordenacin regular y estable que adopten los nucletidos puede denominarse estructura secundaria, la ms conocida es la estructura de la doble hlice del ADN, descubierta por Watson and Crick en 1953.

Estructura primaria. Secuenciacin de cidos nucleicos Una vez definido si el cido nucleico es un ADN o un ARN, la secuencia de nucletidos o estructura primaria solo vara segn las bases. Por eso un cido nucleico puede representarse por la secuencia de bases, cada base representa al nucletido que la porta. En 1977 se desarrollaron dos mtodos para la secuenciacin de DNA, que nos permiten secuenciar fragmentos de entre 200 y 400 pb: Mtodo de Maxan y Gilbert...............................Hidrlisis qumica parcial Mtodo de Sanger, Niklen y Coulson................Sntesis parcial

Para el desarrollo de ambos casos es necesario proceder segn una serie de pasos comunes. Secuenciacin de cidos nucleicos etapas comunes a ambos mtodos -Desnaturalizacin para separar las hebras del DNA -Marcaje del extremo del DNA de forma que pueda visualizarse. Normalmente se marca el extremo 5 usando 32P, un radioistopo que emite partculas beta.

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- Reducir el DNA a cuatro sets de fragmentos marcados. -Despus se hace una electroforesis de acrilamida de alta concentracin que permite separar fragmentos de cidos nucleicos que se diferencian tan slo en un nucletido. El gel de secuenciacin es un gel de poliacrilamida muy largo y muy fino que se corre a unos 70C para evitar hibridaciones. En el Mtodo de Maxan y Gilbert esto se consigue dividiendo la muestra de DNA monocatenario y marcado en cuatro partes. Cada una de estas porciones de muestra se trata con procedimientos qumicos que permiten la rotura de la cadena por un tipo de base, eliminando dicha base. Esto genera una serie de fragmentos que pueden separarse por electroforesis, solo se visualizarn aquellos que contienen el extremo 5`marcado. Las cuatro porciones de fragmentos que han sido hidrolizadas para la identificacin de cada una de las cuatro bases que componen el DNA se someten a electroforesis en 4 calles de un gel de secuenciacin. El mtodo de Sanger (Figura 6) consiste en hacer la sntesis de la cadena complementaria en presencia de la DNA polimerasa e introduciendo un nucletido malo de forma que la polinucleasa termina y no contina la sntesis de la cadena complementaria. Como nucletido defectuoso suele usarse el dideoxinucletido. El dideoxinucletido no posee el grupo 3`hidroxilo por lo que no puede enlazarse con el siguiente nucletido y la sntesis se detiene. La polimerasa necesita un primer, que se marca con radioactividad o fluorescencia; en la sntesis se utilizan pequeas cantidades del nucletido defectuoso con lo que la sntesis se ir parando en diferentes puntos. El resultado, si utilizamos la citosina defectuosa dideoxycitosina, ser la obtencin de fragmentos de diferente longitud y marcados, terminados en citosina. Despus de separar los fragmentos en un gel de acrilamida capaz de diferenciar fragmentos cuyo peso molecular se diferencie en una sola base, podemos obtener la secuencia complementaria a la cadena que se desea secuenciar. Al igual que en el mtodo de Maxam-Gilbert tendremos cuatro porciones en cada una de las cuales utilizaremos un nucletido malo, y cada porcin de fragmentos de oligonucletidos se correr en una calle diferente. El gel se lee desde abajo, donde estarn los fragmentos ms pequeos y por lo tanto ms prximos al extremo 5`, hacia arriba; la secuencia leda directamente del gel ser la complementaria de la cadena que queremos secuenciar.

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Figura 6. Secuenciacin de cidos nucleicos. Mtodo de Sanger.

Secuenciacin automtica. La secuenciacin de DNA est realmente automatizada usando una variante del mtodo de Sanger, en la que los dideoxinucletidos estn marcados con una cola fluorescente de distinto color. Los cuatro ddNTP se aaden en el mismo tubo y los fragmentos resultantes se separan por tamao en una electroforesis capilar (un refinamiento de la electroforesis en gel que es ms rpida). Todos los fragmentos de un determinado tamao migran por el capilar como un solo pico y el color asociado a cada fragmento se detecta usando un lser. La informacin se pasa directamente a un ordenador que determina la secuencia. Esta tecnologa permite secuenciar miles de nucletidos en pocas horas. El proyecto genoma humano que acaba de ser completado (Febrero 2001) por la empresa Celera es el ms ambicioso de los proyectos de secuenciacin que ha secuenciado 35000 genes y unos 3000 millones de pares de bases con esta tecnologa.

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Estructura secundaria de los cidos nucleicos Los diagramas de rayos X realizados a principios de los 50 por Rosalind Franklin y Wilkins, indican que las molculas de ADN son largas cadenas helicoidales con dos periodicidades a lo largo de su eje. Su anlisis qumico pone de manifiesto diversos aspectos. La composicin en bases nitrogenadas es la misma para todas las clulas de una especie. En los ADN, la proporcin molar de adenina es siempre igual a la de timina, y anlogamente la proporcin molar de citosina es equimolar con la de guanina. Por lo tanto el nmero total de bases pricas es igual al de bases pirimidnicas (Regla de Chargaff). Basndose en estos datos, J. Watson y F. Crick propusieron un modelo estructural para el ADN. La principal caracterstica de este modelo es que una molcula de ADN consta de dos cadenas helicoidales de polinucletidos, que a su vez se hallan enrolladas alrededor de un mismo eje, formando una doble hlice destrgira de cadenas antiparalelas, como muestra la Figura 7. Las unidades de desoxirribosa y los grupos fosfato, que forman el esqueleto de las cadenas polinucleotdicas, constituyen la parte externa de su estructura, mientras que las bases (parte hidrfoba) se sitan de forma perpendicular al esqueleto carbonado y se encuentran situadas en su interior.

Figura 7. Estructura del DNA. Doble hlice y disposicin espacial de los componentes moleculares del DNA. 101

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Las dos cadenas, que forman la doble hlice, estn unidas entre s por puentes de hidrgeno, entre bases especficas de cada cadena. As, la guanina de una cadena est siempre unida a la citosina de la otra (a travs de tres puentes de hidrgeno), y la adenina a la de timina (por dos puentes de hidrgeno), como se muestra en la Figura 8. Esto explicara el que molculas de ADN con mayor % G+C son ms difciles de separar en hebras. Debido a la gran longitud de la molcula de ADN, existen numerosos enlaces por puente de hidrgeno entre las dos cadenas, y aunque este enlace es dbil, hacen que en conjunto el ADN sea una molcula muy estable. La disposicin de parte hidrfoba hacia el interior y los fosfatos y ribosas hidrfilos hacia el exterior tambin contribuye a estabilizar la estructura. Las dos cadenas son antiparalelas. Una en el sentido 5` 3`y la otra en el sentido 3` 5`.

Figura 8. Enlaces entre las bases del ADN. Puentes de hidrgeno T-A y G-C.

Las medidas de la doble hlice son muy concretas y pueden estudiarse por difraccin de rayos X. La distancia entre las cadenas es constante e igual a 1.9 nm.

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Hay 10.5 nucletidos por vuelta y el paso de rosca son 3.4 nm. Se aprecia un surco mayor y uno menor. Este modelo explica bien los procesos de replicacin y transcripcin, y se ha comprobado experimentalmente su validez, la estructura de Watson and Crick del DNA se conoce tambin con el nombre de B-DNA y es la estructura ms estable, pero tambin se han caracterizado otras variantes. Algunas secuencias del ADN adoptan ciertas estructuras inusuales como los palndromes o regiones o simetra rotacional .

Figura 9. Modelos del ADN. Diferentes conformaciones espaciales.

Por su parte, las molculas de ARN son monocatenarias y con un nivel de estructura inferior al ADN. Qumicamente se caracterizan por una menor estabilidad que el ADN debido al hidroxilo reactivo del C-2 , capaz de esterificar un hidroxilo de la molcula prxima de fosfato y producir la ruptura de la cadena. La menor estabilidad se justifica en base a la funcin del ARN, que es una copia de la informacin contenida en las molculas de ADN, de menor tamao y mayor movilidad y tiene vida limitada dependiendo del requerimiento de su presencia. Las

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estructuras ms definidas corresponden a los ARN transferentes y los ARN ribosmicos. Los ARNt pueden representarse esquemticamente en forma de hoja de trbol (Figura 10). Comenzando por el extremo 5, los ARNt comparten las siguientes caractersticas: Un grupo fosfato 5 terminal. Un brazo de 7 pares de bases que incluye el nucletido 5 terminal y que contiene emparejamientos de bases que no son del tipo Watson-Crick, como G-U. Esta estructura se conoce como brazo aceptor o brazo del aminocido. Una horquilla de 3 4 bases apareadas que acaba en un lazo de cadena sencilla que contiene frecuentemente la base modificada dihidrouridina (D). La estructura completa recibe el nombre de brazo D. Una horquilla de 5 bases apareadas con un lazo que contiene el anticodn, el triplete de bases que es complementario al codn del ARNm. Esta estructura recibe el nombre de brazo anticodn. Una horquilla de 5 bases apareadas en un lazo monocatenario que contiene por lo general una secuencia T-pseuouridina-C. La estructura se denomina brazo T. Todos los ARNt acaban en la secuencia CCA con un grupo 3-OH libre.

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Figura 10. Estructura secundaria de los ARNt.

Los ARNr son las molculas de nucleicos que constituyen la estructura de los ribosomas. Todos los ribosomas contienen dos subunidades (Figura 11). Por razones histricas, los ribosomas intactos y las subunidades se designan por unos nmeros que describen la velocidad a la que sedimentan cuando se centrifugan. El ribosoma intacto de E. coli (y de todos los procariotas) se llama ribosoma 70S, siendo S una medida de la velocidad de sedimentacin, y las dos subunidades que lo componen, que son distintas en tamao y composicin, se denominan 30S y 50S. En procariotas, una subunidad 30S est formada por una molcula de ARNr 16S y por 21 protenas diferentes. Por su parte, una subunidad 50S contiene dos molculas de ARNr, de diferentes velocidades de sedimentacin (5S y 23S) y 32 protenas diferentes.

Figura 11. Estructura secundaria de los ARNr.

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