III.

BAHAN DAN METODE

A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia dan Biokimia Hasil Pertanian, Laboratorium Pengelolaan Limbah Hasil Pertanian, Laboratoriun Instrumen Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Fakultas Pertanian, dan Laboratorium Biomassa Jurusan Kimia Fakultas Metematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Universitas Lampung. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2009 sampai dengan bulan April 2010.

B. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah biomasa limbah agroindustri berupa bagas tebu yang diperoleh dari PT.Gunung Madu Plantation Lampung Tengah, sedangkan bahan kimia yang akan digunakan berupa asam klorida (HCl), aquades, reagensia Nelson A, reagensia Nelson B, KMnO4, H2SO4, reagensia Arsenomolybdat, larutan Carrez I, larutan Carrez II, alkohol 70%, natriun bisulfit, glukosa anhidrat, dan bahan kimia lain untuk analisis. Alat-alat yang digunakan antara lain oven merek Philip Harris ltd Shenstone England, loyang, pisau, derigen ukuran 5 L, grinder, ayakan 80 mesh, Erlenmeyer, tabung reaksi, shaker suhu ruang merek Lab Shaker Adolf Kuhner AG Schweiz,

corong, autoklaf merk Wiseclave, kertas saring, alumunium foil, timbangan, mikropipet 1000 L merek Thermo Scientific Finnipipette, pipet tetes, pH meter, Spektronik 20 untuk analisis gula pereduksi, Spektrofotometer DR-4000 (Shimanzu, USA) untuk analisis kadar lignin, Spektrofotometer UV-Vis Carry Varian 50 Probe untuk analisis hidroximetilfurfural, dan alat-alat lainnya.

C. Metode Penelitian Perlakuan dalam penelitian ini disusun secara faktorial dalam Rancangan Acak Kelompok Lengkap (RAKL) dengan dua faktor dan tiga ulangan. Faktor pertama adalah konsentrasi asam klorida untuk pembuatan gula pereduksi antara lain, 1%, 3%, 5%, dan 7% (b/v). Sedangkan faktor kedua adalah lama reaksi pada autoklaf yang terdiri dari empat taraf, yaitu 30 menit, 60 menit, 90 menit, dan 120 menit. Data yang diperoleh diuji kesamaan ragamnya dengan uji Barlett. Kemenambahan data diuji dengan uji Tuckey, kemudian data dianalisis lebih lanjut dengan uji perbandingan dan polinomial ortogonal pada taraf nyata 5%.

D.Pelaksanaan Penelitian 1. Persiapan bahan Bagas yang diambil dari industri gula tebu dikeringkan terlebih dahulu pada panas matahari selama tiga hari, selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 70oC sampai kadar air < 10 %, selanjutnya bagas kering dilakukan pengecilan ukuran dengan menggunakan grinder untuk memperoleh ukuran 80 mesh. Bagas yang

telah kering disimpan dan diusahakan kadar air tetap hingga digunakan. Proses persiapan bahan baku bagas dapat dilihat pada Gambar 9.

Ka max 10%

Gambar 9. Proses persiapan biomasa limbah agroindustri 2. Perlakuan dengan hidrolisis asam klorida Bahan baku bagas kering sebanyak 10 gram dan berukuran 80 mesh diberi penambahan larutan asam klorida (HCl) dengan konsentrasi 1% - 7 % (b/v) masing-masing sebanyak 100 mL dengan perbandingan 1:10 (b/v). Selanjutnya sampel diinkubasi pada suhu ruang dengan menggunakan shaker selama 2 jam. Setelah itu dilakukan pemanasan dalam autoklaf pada suhu 121oC. Masingmasing sampel dilakukan pemanasan selama 30 - 120 menit. Lalu dilakukan penyaringan untuk mendapatkan substrat berupa cairan dan padatan. Padatan yang dihasilkan selanjutnya dilakukan analisis kadar lignin, dan cairan yang didapatkan dilakukan analisis gula pereduksi dan hidroximetilfurfural. Kemudian

perlakuan ini dikerjakan sebanyak tiga kali ulangan. Perlakuan hidrolisis dengan menggunakan asam klorida dapat dilihat pada Gambar 10.

Gambar 10. Perlakuan hidrolisis asam

E. Pengamatan Filtrat yang dihasilkan dianalisis kadar gula pereduksi (Nelson Somogyi dalam Sudarmadji et al., 1984), kadar hidroximetilfurfural (HMF) (White, 1979) dalam

SNI 01-3545-2004, dan ampas yang dihasilkan dianalisis kadar lignin dengan metode spektrofotometer (Misson, 2009).

1. Analisis gula pereduksi

Analisis gula pereduksi dilakukan menggunakan metode Nelson Somogyi (Sudarmadji, et al., 1984).

Pembuatan kurva standar Sebanyak 10 mg glukosa anhidrat dilarutkan dalam 100 mL aquades. Larutan glukosa standar tersebut diencerkan sehingga diperoleh larutan glukosa dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 mg/100 mL. Masing-masing 1 mL larutan glukosa standar dimasukkan dalam tabung reaksi dan satu tabung reaksi diisi 1 mL aquades sebagai blanko. Lalu ditambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi 1 mL reagensia Nelson dan semua tabung dipanaskan pada penangas air mendidih selama 20 menit. Semua tabung diambil dan didinginkan bersama-sama hingga suhu 250C. Setelah dingin, ditambahkan 1 mL reagensia arsenomolybdat lalu digojog sampai semua endapan Cu2O yang ada larut kembali. Kemudian ditambahkan 7 mL aquades dan digojog hingga homogen. Kemudian ditera optical density (OD) masing-masing larutan tersebut pada panjang gelombang 540 nm menggunakan Spektronik 20. Kemudian dibuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi glukosa dan OD. Nilai absorbansi dan konsentrasi larutan standar yang didapat diplotkan sebagai kurva standar yang digunakan untuk menentukan konsentrasi gula pereduksi (glukosa) sampel (Sudarmadji et al, 1984).

Penetapan Sampel Filtrat sampel diambil sebanyak 1 mL dimasukkan dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 mL reagensia Nelson dan selanjutnya perlakuan seperti pada penyiapan kurva standar. Dan diukur absorbansinya menggunakan Spektronik 20 pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansi sampel yang didapat diplotkan pada kurva standar untuk menentukan konsentrasi gula pereduksi sampel.

Cara Pembuatan Reagensia Reagensia yang digunakan untuk analisis gula pereduksi adalah reagensia Nelson A, reagensia Nelson B, dan reagensia arsenomolybdat. Reagensia Nelson A. Sebanyak 12,5 g Natrium karbonat anhidrat, 12,5 g garam Rochelle, 10 g Natrium bikarbonat dan 100 g Natrium sulfat anhidrat dimasukkan ke dalam labu ukur 500 mL, ditambah aquades 350 mL. Kemudian ditambah lagi aquades sampai tanda tera. Reagensia Nelson B. Sebanyak 7,5 g CuSO4. 5H2O dimasukkan dalam labu ukur 50 mL ditambah aquades sampai tanda tera, dan ditambah 1 tetes asam sulfat pekat. Reagensia Nelson dibuat dengan cara mencampur 25 bagian Reagensia Nelson A dan 1 bagian Reagensia Nelson B. Pencampuran dikerjakan pada setiap hari akan digunakan untuk pengukuran.

Reagensia Arsenomolybdat Sebanyak 25 g Ammonium molybdat dimasukkan labu ukur 500 mL, ditambahkan 450 mL aquades dan ditambahkan pula 25 mL asam sulfat pekat (larutan pertama). Na2HASO4. 7H2O sebanyak 3 gr dilarutkan ke dalam 25 mL aquades (larutan kedua). Kemudian larutan kedua dicampurkan ke dalam larutan pertama. Lalu dimasukkan kedalam botol berwarna coklat, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Reagensia ini baru dapat digunakan setelah masa inkubasi tersebut, Reagensia ini berwarna kuning (Sudarmadji et al., 1984).

2. Analisis Hidroximethilfurfural (HMF) Analisis HMF dilakukan dengan metode White (1979) dalam SNI 01-3545-2004 Pembuatan Reagensia Reagensia yang digunakan dalam analisis hidroximetilfurfural adalah larutan Carrez I, larutan Carrez II, dan larutan sodium bisulfit. Larutan Carrez I Sebanyak 15 gram potassium ferrocyanide [K4Fe(CN)6.3H2O] dimasukkan ke dalam labu ukur dan dilarutkan dalam aquades sampai 100 mL. Larutan Carrez II Sebanyak 30 gram zinc acetate [Zn (CH3CO2)2.2H2O] dimasukkan ke dalam labu ukur dan dilarutkan dalam aquades sampai 100 mL Larutan Sodium bisulfit (NaHSO3) 0,20%, larutan baru akan digunakan.

Metode Analisis Sampel diambil sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam gelas beker kecil ukuran 50 mL, lalu ditambahkan 25 mL aquades kemudian sampel itambahkan 0,5 mL larutan Carrez I dan dihomogenkan. Setelah itu sampel ditambahkan 0,5 mL larutan carrez II dan dihomogenkan. Lalu sampel diencerkan dengan aquades hingga volume 50 mL dan diteteskan dengan 1 tetes alkohol 70% ke atas larutan dan disaring dengan kertas saring hingga didapat 10 mL filtrat. 5 mL filtrat sampel dimasukkan ke dalam dua tabung reaksi dan ditambahkan 5 mL aquades ke dalam salah satu tabung (sampel) dan ditambahkan 5 mL 0,20 % larutan bisulfit ke dalam tabung yang lain (referensi) lalu kedua larutan sampel dihomogenkan dan absorbansi dibaca pada Spektrofotometer UV-Vis Carry Varian 50 Probe dengan panjang gelombang 284 nm dan 336 nm. HMF (mg/100g ) = (A284 - A336) x 74.87 W Keterangan :

A 284 : nilai absorbansi pada panjang gelombang 284 nm A 336 : nilai absorbansi pada panjang gelombang 336 nm W : berat sampel (g)

3. Analisis lignin Analisis lignin dilakukan dengan menggunakan metode Spektrofotometer (Misson, et al., 2009).

Pelaksanaan Analisis Lignin Residu sampel sebanyak 0,1 g yang dilakukan pretreatment dengan HCl dan bahan baku awal yang telah dikeringkan selama 24 jam, ditambahkan ke dalam campuran potassium permanganat (KMnO4) 20 mL dari 0,02 mol/L dan asam sulfat (H2SO4) 5 mL dari 2,0 mol/L dan dishaker selama 3 menit. Sampel padatan dipisahkan dari campuran menggunakan kertas saring, sementara filtrat diukur menggunakan UV-Spektrofotometer DR 4000 pada panjang gelombang 546 nm. Kadar lignin dapat dihitung dengan rumus dibawah ini: K = a (Ao-Ae) w Ao Lignin (wt%)= 0,15 K Keterangan : K a w Ao Ae : angka Kappa : volume dari KMnO4 yang digunakan pada campuran : berat dari partikel bebas yang digunakan pada sampel : absorbansi awal pada waktu t = 0 (sebelum sampel ditambahkan)
:

absorbansi pada akhir reaksi (sampel)