ACTIVIDAD ENZIMTICA LABORATORIO DE BIOQUIMICA UNIVERSIDAD DEL QUINDIO ARMENIA- QUINDO 2013

Autores: GOMEZ, S.A. GUAPACHA, S.E. Resumen

La prctica se realiz con el fin de conocer el funcionamiento de las enzimas catalasa en diferentes tejidos, animal (hgado), vegetal (papa); Y el trabajo de las enzimas amilasa a diferentes condiciones utilizando diferentes reactivos y estratos biolgicos (cido ascrbico al 2 %, Sulfito de sodio al 2%, agua y limn). Tambin se reconoci la funcionalidad de las enzimas catalasa a diferentes temperaturas y el proceso por el cual se desnaturalizan estas enzimas.

Palabras claves: reaccin, enzimas, inhibicin, catalasa, desnaturalizacin, hidrlisis Introduccin Las enzimas son protenas que disminuyen la cantidad de energa que se requiere para llevar a cabo una reaccin; esta actividad cataltica es especfica para realizar su funcin se unen a las molculas por catalizar, o sustratos (S), en un sitio especifico, el sitio activo, para establecer un completo enzima sustrato (ES), el cual se puede disociar en sus molculas originales E y S, o bien generar un producto (P)y la enzima libre. De acuerdo con la reaccin que catalizan, las enzimas se clasifican en transferasas, hidrolasas, isomerasas, etc. Algunas enzimas responden a estmulos reguladores, ya que presentan en su estructura uno o varios sitios de control, denominados sitios alostricos. Estas regiones de la enzima son reconocidas por sustancias con efectos activadores o inhibidores, que son generalmente producto del metabolismo, que ejerce una interaccin no covalente. Existe un grupo de enzimas de control o alostricas que requieren modificaciones covalente en su estructura, como en el caso de la adicin de nuevos grupos funcionales, para ser reguladas. Algunas enzimas necesitan para su funcionamiento una o ms molculas no proteicas, que participan de manera directa en la reaccin qumica durante la catlisis. (Hicks 2003) Las enzimas son catalizadores con varias propiedades notables. En primer lugar, las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas a menudo son extraordinariamente elevadas. Y en segundo lugar, en marcado contraste con los catalizadores inorgnicos. Las enzimas son muy especficas para las reacciones que catalizan, y rara vez forman productos secundarios. Por ltimo, debido a sus estructuras relativamente grandes y complejas, las enzimas pueden regularse. Esto es muy importante en los seres vivos, que deben conservar su energa y materia prima. Por definicin, un catalizador es una

sustancia que aumenta o disminuye la velocidad de una reaccin qumica y que no se altera de forma permanente por la reaccin. (Mckee & Mckee 2003)

Diagrama de flujo Inhibicin enzimtica

Agua

Jugo de Limn

cido ascrbico al 2%

Sulfito de sodio al 2%

Trozo de papa

Trozo de papa

Trozo de papa

Trozo de papa

Beaker 1

Beaker 2

Beaker 3

Beaker 4

Se dejaron los trozos de papa durante 5 minutos en cada una de las sustancias, despus se retiraron los trozos de las sustancias y se tomaron apuntes de los cambios durante 5, 15, 30 minutos, y 1,2 y 24 horas.

Reconocimiento de catalasa Hgado

2 ml de agua oxigenada

(H2O2)

Se observa un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxigeno

Desnaturalizacin de catalasa Hgado

Agua

Hervir hasta que el tejido est cocido.

2 ml de agua oxigenada

(H2O2)

Observar reaccin

Hidrolisis de almidn

Tubo 1: 1 mL de saliva Se hierve durante 10 minutos 1 mL de almidn al 1.5 %

Tubo 2: 1 mL de saliva

Tubo 3: 1 mL de saliva

1 mL de almidn al 1.5 %

1 mL de almidn al 1.5 %

Se incuba a una T de 80C, durante 10 minutos

Se incuba a una T de 37C, durante 10 minutos

Se sumerge a una T de 0C durante 10 minutos

Se les aade una gota de lugol y se observa la reaccin

Resultados Cuadro 1: Inhibicin enzimtica Tiempo Agua 5 minutos La papa continuaba con su color inicial no se vio reaccin alguna La papa continuaba con su color inicial no se vio reaccin Sustancias Limn cido ascrbico al 2% La papa La papa continuaba continuaba con con su color su color inicial no inicial no se se vio reaccin vio reaccin alguna alguna La papa La papa continuaba continuaba con con su color su color inicial no inicial no se se vio reaccin vio reaccin alguna

Sulfito de sodio al 2% La papa comenz a tomar un color caf claro

15 minutos

La papa comenz a presentar entre 3 y5 manchas de color caf claro

30 minutos

1 hora

2 horas

24 horas

alguna La papa presento pequeas manchas oscuras de color caf La papa presento pocas manchas de oscuras de color caf La papa presento muchas manchas oscuras de color caf Trozo de papa oxidado totalmente

alguna La papa presento una pequea mancha oscuras de color caf presento una pequea mancha oscuras de color caf

La papa presento una pequea mancha oscuras de color caf

La papa presento gran cantidad de manchas oscuras de color caf

presento una pequea mancha oscuras de color caf

La papa presento una oxidacin del 70 % del trozo de papa

presento una La papa presento El trozo de papa se pequea muchas manchas puso todo de color mancha oscuras de color caf oscuro oscuras de caf color caf Trozo de papa Trozo de oxidado oxidado totalmente totalmente papa Trozo de papa oxidado totalmente

Reconocimiento de catalasa Cuando se le aadi el perxido de hidrogeno se observa cmo se desprendan burbujas del hgado adems tambin se evidencio que en el momento de la reaccin aumento la temperatura, la razn de esto es que la catalasa descompone el perxido de hidrogeno en agua y oxgeno. Desnaturalizacin de la catalasa Al ser el hgado calentado se observ que los trozos, tomaban una coloracin blanca y cuando se le aadi el perxido de hidrogeno no se observ reaccin alguna, ya que cuando se calent se desnaturalizo la catalasa. Tabla 2: Hidrolisis de almidn Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Discusin En la inhibicin enzimtica se encontr que el limn que tiene contenido de vitamina C y cido ctrico y el cido ascrbico al 2% que es un conservante de alimentos, para Azofeifa (2009) Los antioxidantes incluyen agentes reductores, los cuales pueden remover oxgenos de molculas e incluso de compuestos que actan con mecanismos Continuo en el estado inicial (Blanco) Cambio de color, pequea coloracin azul oscuro Continuo en el estado inicial (Blanco)

alternativos, tales como capturadores o desactivadores de iones; reaccionando con intermediarios en el equilibrio redox o en la catlisis del transporte de electrones el limn y A. ascrbico al 2% fueron los que mayormente se comportaron como antioxidantes durante el desarrollo de la prctica, mientras que el agua reduce la oxidacin pero en un lapso corto de tiempo de 30 minutos y el sulfito de sodio al 2% se comporto como un agente oxidante rpidamente. Segn Guerrero (2009) Inhibidores usados normalmente en frutas procesadas son: cido ntrico y mlico, los cuales son usados en combinaciones para obtener un mayor efector de inhibicin enzimtica, por lo tanto se obtuvo que en el trozo de papa que fue sumergido en el limn que tambin es rico en contenido de cido ctrico demuestra que el cido ctrico acta como inhibidor durante un lapso de tiempo de 2 horas, presentando durante esas dos horas solo una pequea mancha de color caf claro, para Lpez (2006) La vitamina C presenta una configuracin de lactona, en la que los grupos hidroxilos asociados al doble enlace funcionan como agentes con alto potencial reductor, lo que le permite, incluso, participar en la reduccin directa del oxgeno, funcionando as como sustrato donante en las reacciones de las peroxidasas., el cido ascrbico al 2% que es un conservante pero en menor cantidad que el limn, ya que en el tiempo de 2 horas el trozo de papa presentaba muchas manchas de color caf en comparacin con el trozo de papa sumergida en el limn, pero igualmente continuaba con su funcin de antioxidante ya que segn Guerrero (2009) La inmersin en soluciones calientes de acido ascrbico/acido ctrico les permite aumentar el tiempo de vida til a papas pre-peladas por un lapso de 2 semanas, entonces esto nos dio como resultado la conservacin del trozo durante dos horas, y comparando los datos obtenidos entre el limn y el acido ascrbico, el trozo de papa se conserva mas con el limn ya que tiene dos sustancias que actan como antioxidantes favoreciendo as su conservacin. Los tubos 1 y 3 no tuvieron reaccin, o presencia de color azul que es el que indica la reaccin de la enzima amilasa con el almidn, esto pudo haber sido a que el tubo uno inicialmente se hirvi durante 10 minutos y despus se llevo a incubacin acuna temperatura de 80C, y el tubo 3 se incubo a una temperatura de 0C, segn Gariido (2010) al disminuir demasiado la temperatura, los choques entre las molculas disminuyen tambin, por lo que la actividad enzimtica baja hasta el punto en el que no se puede ver en el experimento. Por el contrario, al aumentar la temperatura de incubacin a 70 C, los choques entre las molculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar. Es por ello que se presume que no se observaron cambios en los tubos., por lo tanto en cuanto a este experiment citado, el autor lo realizo a 70 C y el de la prctica de laboratorio fue a 80 C, entonces la desnaturalizacin de la enzima fue mayor. Por lo tanto se compararon los resultados obtenidos en la prctica con los de Garrido, y son similares, ya que en nuestros datos los tubos 1 y 3 que fueron sometidos a cambios de temperatura no reaccionaron con el lugol. En cuanto al tubo 2, que fue en el que presento poca coloracin azul, sometido a incubacin a 37 C durante 10 minutos que es la temperatura ambiente, para Garrido (2010) cada enzima tiene un rango de temperatura optima y, en el caso de la amilasa, al encontrarse esta en el cuerpo humano (que siempre tiene una temperatura de 37 C), se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero si disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores. En el reconocimiento de catalasa de la prctica se pudo observar como la presencia de perxido de hidrogeno sobre el tejido heptico, desencadena una reaccin de la cual se desprende una espuma, liberndose oxgeno y agua, tambin hubo cambio de temperatura, al calentarse la muestra quemando el tejido heptico al haber mayor presencia de perxido de hidrogeno que de la enzima catalasa. La funcin de la catalasa

en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molcula toxica que es el perxido de hidrogeno. La catalasa aumenta la velocidad de descomposicin del perxido de hidrogeno aproximadamente 1000 millones de veces (Devlin, 1999). En la desnaturalizacin de catalasa se evidencio como el calor desnaturaliza la enzima catalasa, al ser expuesto el tejido heptico previamente a una coccin y luego al adicionarle perxido de hidrogeno no se evidencio ninguna reaccin. Segn Bohinsk (1991) La velocidad de las reacciones enzimticas aumenta por lo general con la temperatura, dentro de un intervalo en que la enzima es estable y activa, sin embargo las enzimas se desnaturalizan cuando la elevacin de la temperatura sobrepasa cierta temperatura lmite. Conclusiones Se demostr la presencia de la enzima catalasa en tejidos animales como el hgado y se observ la descomposicin de perxido de hidrogeno en oxgeno y agua. Tambin se comprob como las temperaturas extremas desnaturalizan las enzimas. Se observ el efecto de oxidacin en tejidos vegetales como la papa

Bibliografa

AZOFEIFA, . 2009. Problemas de oxidacin y oscurecimiento de explantes cultivados

in vitro. Agronoma isoamericana. Disponible en: http://www.mag.go.cr/rev_meso/v20n01_153.pdf BOHINSK, C. 1991.Bioqumica. 5a edicin. Mexico. Addison Wesley. Pg 140 DENVLIN, T. 1991.bioqumica. Mxico. Adidison Wesley. Pg . 181 GARRIDO, A. 2010. Actividad enzimtica de la amilasa. Disponible en: http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-amilasa/actividadenzimatica-amilasa.pdf HICKS,J. 2003. Bioqumica. Interamericana de editores S.A. Mxico. Pag 84 LOPEZ, J. 2006. Vitaminas y oxidorreductasas antioxidantes: defensa ante el estrs oxidativo. Cuba. Disponible en: http://bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol25_2_06/ibi10206.pdf MCKEE, T & MCKEE, J. 2003. Bioqumica, la base molecular d la vida. 3a edi. Espaa. Disponible en: http://www.slideshare.net/aLiciaVictoria22/bioquimica-trudy-mckee9503168

ROJANO, B. 2009. Inhibicion de la actividad enzimtica de la polifenol oxidasa extrada del banano (cavendish valery) mediante sistemas bifsicos acuosos con isoespintanol y cido ascrbico. Medelln. Disponible en: http://www.bdigital.unal.edu.co/1820/1/98380674.2009.pdf

Anexos 1. Cul es la funcin de las enzimas en los organismos vivos? La funcin es catalizar las reacciones qumicas que tienen lugar en el cuerpo, necesarias para el procesamiento de alientos, biosntesis, nutricin, producir energa, entre otras. 2. Cul es la parte de la clula donde se sintetizan las enzimas? El lugar donde se sintetizan las enzimas son los ribosomas 3. Investiga las reacciones o mecanismo de inhibicin enzimtica. Segn Bohinski (1991) Inhibicin competitiva: I Es cierta sustancia que se fija de modo reversible a la forma libre de una enzima E y produce un complejo binario EI incapaz de fijarse al S. As, cuando estn presentes E, S e l la primera puede fijarse a S, para formar ES o a I para formar EI; pero E no puede fijar al mismo tiempo a S e I para integrar un complejo ternario EIS. Inhibicin no competitiva: cuando el efecto de I no se contrarresta al incrementar la concentracin de S la inhibicin se llama no competitiva, la accin del inhibidor no competitivo implica la fijacin de I tanto a la E libre como al complejo ES, de modo que en el segundo de los pasos se forma un complejo ternario EIS. Inhibicin acompetitiva: cuando un complejo ternario no productivo EIS se forma como exclusivamente como resultado de la fijacin de I a un complejo ES, en este caso, incrementando la concentracin de S se refuerza realmente el efecto inhibidor, ya que se eleva la concentracin de ES disponible para unirse a I. Inhibicin irreversible: muchos inhibidores se fijan de modo irreversible a E, a ES o a ambos. Y como se reducen la Vmx, en ocasiones se dice quye el inhibidor en no competi-tiva. Es muy frecuente que los inhibidores de este tipo se fijen de modo covalente a E, a ES o a ambos. La naturaleza venenosa del Hg 2+, el Pb2+ y los compuestos de arsnico se basa en este efecto.