IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS EN MUESTRAS BIOLGICAS OBJETIVO: Identificar el carbohidrato o la clase de carbohidratos presentes en una muestra biolgica comparndola con

patrones de carbohidratos. FUNDAMENTO: Los carbohidratos debido a sus funciones qumicas orgnicas que contienen dan reacciones especficas que permiten su identificacin sin importar de qu muestras biolgicas hagan parte constituyente. Entre las diversas pruebas podemos citar la prueba de Molisch para detectar carbohidratos en general, y pruebas especficas como, la formacin de osazonas, las pruebas para azcares reductores, pruebas de Barfoed, fehling, Benedict, Seliwanoff, Bial y pruebas de reconocimiento de polisacridos. Prueba para carbohidratos en general: reaccin de Molisch Los carbohidratos, en presencia de cido sulfrico concentrado, se hidrolizan para dar monosacridos que luego se deshidratan dando furfural y sus derivados. Estos productos se combinan con -naftl para dar un complejo prpura: Formacin de ozasonas para identificacin de azucares Las ozasonas son compuestos formados por la condensacin de Fenilhidrazina con los azucares reductores. Las fenilosazonas tienen unas caractersticas cristalinas que permiten su identificacin. Los azucares reaccionan en caliente con la Fenilhidrazina para dar azcar- fenilhidrazonas que en medio dbilmente cido reaccionan en caliente con ms Fenilhidrazina para producir una osazona. La glucosa, la fructuosa y la manosa forman la misma osazona puesto que la configuracin de los tomos 1 y 2 con la fenilhidrazina se vuelve igual para los tres azucares y la configuracin de los carbonos 3, 4, 5 y 6 desde antes era igual. Pruebas para azucares reductores: Fehling y Benedict Los azucares que poseen grupos aldehdo o cetona, reales o potenciales, presentan propiedades reductoras o sea que son capaces de reducir a algunas sustancias y reactivos. Entre los principales reactivos se encuentran los de Fehling y Benedict. Estos contienen sales cpricas (tartrato citrato) que le dan un color azul al reactivo. En medio alcalino el ion cprico (Cu +2) se transforma en hidrxido cprico [Cu(OH)2]n y este, en presencia de un azcar reductor se transforma en hidrxido cuproso que, a su vez, por accin del calor, se transforma en oxido cuproso (Cu2O). El oxido cuproso es insoluble en agua y produce un precipitado de color rojo aunque a bajas concentraciones el color es amarillento. Las reacciones que se presentan son las siguientes: Prueba de Barfoed para diferenciar monosacridos de disacridos La prueba de Barfoed utiliza bsicamente el mismo procedimiento que los reactivos de Fehling y Benedict pero con un fin distinto. Aqu el cobre esta en una disolucin dbilmente cida, en forma de acetato; por efecto de sustancias reductoras, en caliente, producen iones cuprosos que precipitan en caliente en forma de oxido cuproso. La velocidad de reaccin es mucho ms lenta para los disacridos que para los monosacridos lo cual permite diferenciarlos. La aparicin de un precipitado rojo amarillento indica la presencia de un monosacrido; los disacridos reductores se demoran mas en producir el mismo precipitado.

Reconocimiento de cetosas: reacciones de Seliwanoff Seliwanoff: Las cetosas, en presencia de cido clorhdrico, se deshidratan mas rpidamente que las aldosas produciendo derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un complejo rojo. Se debe evitar un calentamiento prolongado que d origen a falsos positivos. Prueba de Bial para reconocimiento de pentosas Cuando se calientan pentosas con cido clorhdrico concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol, en presencia de iones frricos, para dar un color verde azuloso. El calentamiento prolongado de algunas hexosas producen hidroximetilfurfural que tambin reacciona con orcinol pero el producto coloreado que se forma en este caso es amarillo o marrn. Reconocimiento de polisacridos con yodo El yodo forma complejos coloreados con las cadenas helicoidales de los polisacridos. Para que haya estructura helicoidal se necesita una cadena con, por lo menos ocho unidades monosacridas. Los polisacridos que a todo lo largo de su molcula muestran estructura helicoidal, como la amilosa, dan coloracin azul intensa. Aquellos que son ramificados con hlices interrumpidas, como la amilopectina, producen coloraciones menos intensas. Los altamente ramificados, con segmentos cortos, como el glicgeno, producen color pardo o rojizo. En el caso del almidn se debe obtener un color azul oscuro mientras que con dextrina y glicgeno la coloracin es pardo rojiza. PROCEDIMIENTO: Preparacin de las muestras biolgicas. Miel de abejas. Disuelva 10 g de miel de abejas en agua destilada hasta completar 100 ml, si es necesario, caliente suavemente, con agitacin constante, dentro de un bao de mara. Clara de huevo. Dentro de una probeta mida el volumen de una clara de huevo, agregue 5 veces su volumen en agua y agite bien. Con esta solucin se harn las pruebas para determinar los azcares presentes. Jugos y bebidas: Se deben utilizar jugos transparentes o casi incoloros. NOTA. En todas las pruebas va a utilizar 2 ml de su muestra biolgica, adems de los carbohidratos mencionados en cada caso. Prueba de Molisch. Carbohidratos; Muestra biolgica, glucosa, fructosa, sacarosa y almidn. A 2 ml de carbohidrato y agua cada uno en un tubo de ensayo diferente- se le aaden 5 gotas d el reactivo de Molisch y se agita. Luego, se deja resbalar por las paredes del tubo de ensayo sin agitar- 2 ml de cido sulfrico concentrado. Mire atentamente la interfase entre los dos lquidos, que observa? Prueba de osazonas. Carbohidratos: muestra biolgica, glucosa, fructosa, galactosa y sacarosa. A 1 ml de solucin de fenilhidrazina agregue 2 ml de la solucin de carbohidrato, agite y caliente en un bao de agua hirviendo. Deje enfriar los tubos a temperatura ambiente y observe al microscopio. Compare el resul6tado de la muestra biolgica con los de los otros tubos y los que encuentre en la literatura.

Reaccin de Fehling Carbohidratos: Muestra biolgica, glucosa, fructosa, sacarosa y almidn. En un tubo de ensayo mezcle 2 ml de la solucin de Fehling A con 2 ml de la solucin de Fehling B. y de inmediato agregue 1 ml de la solucin de carbohidrato. Agite e introduzca los tubo en un bao de agua hirviente, durante 15 min. Observe el color producido. Reaccin de Benedict: Agregue 2 ml de la solucin de carbohidrato a 2 ml de reactivo de Benedict. Agite y caliente en un bao de agua hirviente durante cinco minutos. La formacin de un rojo amarillento indica la presencia de un carbohidrato reductor. Prueba de Barfoed. Carbohidratos: Muestra biolgica, glucosa, fructosa, maltosa y lactosa. A 2 ml del reactivo de Barfoed agregue 1 ml de la solucin de carbohidrato y agite. Caliente el tubo en un bao de agua hirviente durante 5 min. Observe el resultado y especialmente las diferencias que se presentan entre glucosa y maltosa, glucosa y lactosa, fuctosa y maltosa, y fructosa y lactosa Prueba de Seliwanoff. Carbohidratos: Muestra biolgica, glucosa, fructosa y sacarosa A 2 ml del reactivo de Seliwanoff agregue 1 ml de la solucin de carbohidrato y caliente en un bao de agua hirviendo. Observe la coloracin y especialmente el tiempo en que aparece. Prueba de Bial. Carbohidratos: Muestra biolgica, Xiliosa, arabinosa, glucosa. A 1 ml de la solucin de carbohidrato agregue 3 del reactivo de Bial. Agite y caliente en un bao de agua hirviendo. Observe la coloracin en algunos de los tubos. Reaccin de lugol. Carbohidratos: Muestra biolgica, glucosa, dextrina, almidn y glucgeno. A 1 ml d la solucin de carbohidrato agregue 2 gotas del reactivo de lugol y agite. Observe las coloraciones producidas. CUESTIONARIO 1. En una tabla coloque en forma horizontal los carbohidratos ensayados y en forma vertical las pruebas realizadas. Indique con +, - ? si los resultados fueron positivos, negativos o dudosos. 2. Indique las reacciones que se llevan a cabo en cada prueba utilizada. 3. Compare los resultados obtenidos con la muestra biolgica y confrntelos con los obtenidos con los diferentes carbohidratos. En esa comparacin deduzca que carbohidratos se encuentran presentes en las muestras biolgicas ensayadas. Sustente sus hallazgos con lo que se reporta en la literatura.