Está en la página 1de 10

VII.

-Captulo 2
Mtodos para el estudio de la expresin de genes
Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G. 1 Introduccin La capacidad de secuenciar genomas completos desarrollada en la ltima dcada ha impulsado a la investigacin cientfica en la direccin de definir la funcin de cada uno de los genes identificados. Para contribuir con ese objetivo se han diseado tcnicas que permiten estudiar la expresin gnica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo, posibilitando la identificacin inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas con una actividad asociada. Los procedimientos para esta evaluacin han progresado desde los mtodos desarrollados para el anlisis de genes nicos especficos (como el Northern slot y dot blotting, la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de proteccin de nucleasas) hacia otros enfocados en la identificacin de mltiples transcriptos que difieren en su representacin entre las diversas muestras experimentales (como la hibridacin substractiva, el display diferencial, el ADNc-AFLP , la secuenciacin de etiquetas expresadas o EST, el anlisis serial de la expresin de genes o SAGE y la hibridacin de microarreglos). La organizacin de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los datos de expresin y de homologa proporciona un marco bsico para conducir nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada producto gnico. 2 Hibridacin substractiva Los mtodos de hibridacin substractiva fueron creados a principios de la dcada que comenz en 1980 con el propsito de construir bibliotecas de ADNc para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propsito de identificar genes regulados positiva o negativamente en

una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de funcin relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de tcnicas comunes de biologa molecular que no requieren equipos especializados de deteccin y anlisis. El procedimiento general consiste en la hibridacin de ADNc provenientes de una muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra control (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman molculas de ARNm/ADNc hbridas, mientras que las secuencias de ADNc que estn presentes nicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las molculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatografa en hidroxilapatita. Los ADNc expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca. Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades de ARNm y ii) la tendencia a una menor eficiencia en la identificacin de transcriptos poco abundantes. La hibridacin substractiva es aplicable slo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de expresin. Adems no genera una medida cuantitativa y aunque es eficiente en la identificacin de genes que estn completamente ausentes en el driver no revela fcilmente a aquellos que estn presentes en ambas muestras en distinta proporcin. A fin de mejorar el protocolo original se realizaron modificaciones que incluyen la produccin de ADNc con marcas de biotina u oligo(dT)30-ltex de manera de refinar la separacin de las molculas de cadena simple y doble. Tambin se incorpor la amplificacin de ADNc selectos por PCR para disminuir la cantidad inicial de mARN requerido y aumentar la eficiencia de clonado de los transcriptos seleccionados. En la actualidad se utiliza ms comnmente un protocolo ingenioso conocido como hibridacin substractiva de supresin (SSH) que fue diseado para favorecer la deteccin de

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

229

transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalizacin en la representacin de los transcriptos diferenciales basada en la inhibicin de la amplificacin de aquellos que son ms abundantes, eliminando tambin la necesidad de separar molculas de cadena doble y simple (Fig.1).

3 Display diferencial y RAP-PCR Las tcnicas conocidas en general como huellas digitales genticas de ARN (ARN fingerprinting) incluyen al display diferencial (DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR cebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos mtodos estn basados en una amplificacin por PCR de subgrupos al azar de transcriptos a partir de dos o ms muestras. La primera etapa de ambos procedimientos es comn y consiste en generar ADNc haciendo una transcripcin reversa de una fraccin de las molculas de ARNm de una muestra. En el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripcin reversa a un poliT anclado con una o ms bases adicionales al extremo 3 del ARN mensajero (por ejemplo (T)12AC). Estos oligonucletidos se fijan al ARN mensajero a travs de la unin de las bases adicionales, impidiendo que el poliT resbale sobre distintas zonas del poli A. El nico grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las molculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adyacente al poliA. En contraste, la RAP-PCR utiliza oligonucletidos de secuencia arbitraria para la transcripcin reversa. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias com-

Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridizacin substractiva de supresin (SSH). El ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formacin de los productos de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. El enriquecimiento en las molculas e se logra durante la amplificacin por PCR ya que: i) a y c pueden unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificacin de b est suprimida debido a la complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador que promueven la formacin de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de unin a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrn de transcriptos presentes esencialmente en el tester y ausentes en el driver y adems su representacin estar normalizada ya que los fragmentos diferenciales abundantes tendrn mayores posibilidades de formar molculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenko et al. 1996.

230

PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

plementarias permitiendo formar una hebra en los distintos tratamientos experimentade ADNc desde este sitio. En este caso el les representan potenciales transcriptos de subgrupo de ARNms que sufre transcripcin ARNm de expresin diferencial. Tpicamenreversa estar integrado por aquellas mol- te, las bandas son evaluadas slo si amplificulas que presenten la secuencia complemen- can en forma consistente en reacciones de taria a la del cebador orientada en el senti- PCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2). do adecuado. La fase final del display diferencial consisLuego de haberse realizado la sntesis de te en la identificacin de la secuencia del la primer hebra del ADNc, se amplifican seg- transcripto representado por el producto de mentos de los transcriptos usando pares ml- PCR y la confirmacin de que este realmente tiples de cebadores de PCR. Tanto para el se expresa en forma contrastante. Estas etadisplay diferencial como para la RAP-PCR, el pas se logran localizando fsicamente y cebador superior es un oligonucletido arbi- escindiendo la seccin del gel de trario de 10 pares de bases. El cebador infe- poliacrilamida que contiene al producto de rior es el mismo oligonucletido poliT anclado (para el caso del display diferencial) o el decmero arbitrario (para el caso de RAP-PCR) que se usaron alternativamente para hacer la transcripcin reversa. Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucletidos arbitrarios y 12 oligonucletidos anclados) representan estadsticamente a todos los ARNm originalmente presentes en la muestra. Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporacin de un nucletido radiactivo o de una molcula que pueda ser detectada a travs de su interaccin con un anticuerpo conjugado a un sistema de deteccin (por ejemplo digoxigenina). Tambin puede usarse un cebador unido a un fluorforo u optarse por no marcar los fragmentos amplificados y usar luego una tincin con nitrato de plata para revelar los geles. La visualizacin de los productos de PCR se logra Figura 2: Representacin grfica del mtodo de display diferencial. luego de la electroforesis en geles de Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando poliacrilamida seguida de la apropia- como cebador un oligonucletido poliT de secuencia 5T(T)nTXY da generacin y deteccin de imge- 3 (donde 10 n 12) que se fija en forma estable al extremo 3de transcriptos a travs de la unin de las bases adicionales de nes, que son evaluadas comparando los secuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra del la intensidad relativa de las bandas ADNc, sta se usa como molde para una reaccin de PCR que producidas a partir de diferentes utiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decmero de secuencia arbitraria. Distintas combinaciones de poliTs y decmeros muestras experimentales. Los fragmentos que estn presen- generan numerosos perfiles de amplificacin a partir de diversas subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrn de bandas de las tes en una muestra y ausentes en la muestras experimentales se compara en busca de diferencias de otra o aquellos que estn presentes tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las con diferentes intensidades relativas bandas.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

231

inters. En la mayora de los casos debe realizarse un alineamiento de las imgenes de los fragmentos de amplificacin con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tincin con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la recuperacin de la banda es mucho ms eficiente. Los productos de PCR son purificados del gel y reamplificados. Se han utilizado varias estrategias para confirmar la expresin diferencial de los transcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para someterlos a anlisis de Northern inverso y el clonado y secuenciacin de los productos para disear cebadores especficos que permitan realizar PCR semicuantitativas. Independientemente de cul sea la tctica usada para confirmar la expresin diferencial, las secuencias de los fragmentos de los genes expresados diferencialmente se requieren siempre para comenzar a entender la funcin del gen. El aislamiento de la secuencia completa de los genes involucrados puede lograrse usando los clones diferenciales en estudios de bibliotecas de ADNc o realizando experimentos de 5RACE. Dos ventajas importantes de los mtodos de fingerprinting de ARN con respecto a los de hibridizacin substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales mltiples en forma simultnea y la de identificar genes que estn regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las otras. Sin embargo, los mtodos de fingerprinting de ARN comparten con el SSH la limitacin de que no son cuantitativos. Adems suelen aparecer numerosos falsos positivos, es decir, fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son artefactos de PCR. Otro problema es que estas tcnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genticamente idnticos (por ejemplo, isolneas). Cuando se comparan los perfiles de ARNm de individuos diferentes genticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una amplificacin diferencial debida a una variacin en la secuencia de los transcriptos ms que a

diferencias en su representacin. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias de anlisis de segregantes en grupo (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN. Finalmente, la investigacin de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de ltima generacin y una inversin extensiva de tiempo y trabajo para detectar y confirmar la expresin diferencial de cada uno de los genes individuales. 4 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP) La tecnologa de AFLP , generalmente utilizada para producir huellas genticas de ADN genmico, puede ser aplicada tambin a preparaciones de ADNc de doble hebra para obtener un perfil del transcriptoma. Los patrones obtenidos por esta tcnica son una herramienta confiable y eficiente para la identificacin de los ARNm expresados diferencialmente. La tcnica de ADNc-AFLP detecta fragmentos de restriccin de ADN por medio de amplificacin por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) generacin de ADNc, ii) restriccin del ADNc con dos endonucleasas especficas, preferiblemente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligacin de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos de restriccin, iv) amplificacin de un subgrupo de los fragmentos de restriccin usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3 v) electroforesis de los fragmentos de restriccin amplificados en geles de poliacrilamida, vi) visualizacin de las huellas digitales genticas mediante el uso de autorradiografas, fosfoimgenes y otros mtodos (Fig. 3, ver pg.7). Las mayores ventaja del uso de la tecnologa de ADNc-AFLP son: i) no se requiere informacin previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fraccin muy grande de todos los genes expresados, iii) es una tcnica muy sensible que permite la deteccin de transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son extrados fcilmente de los geles

232

PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

y las secuencias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos. 5 Etiquetas de secuencia expresadas (Expressed sequence tags, EST) Los avances tecnolgicos que facilitan la secuenciacin masiva condujeron a principios de los aos 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reaccin de secuenciacin que abarca 300-500 pb del clon. Las diferencias en la expresin de genes pueden ser identificadas considerando el nmero de veces en que aparece representada una secuencia en particular. Sin embargo, las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas ltimas pueden ser comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y estn completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no normalizadas. La posibilidad de detectar diferencias en la expresin de genes a travs de la comparacin de la abundancia de secuencias en las bases de datos de EST se incrementa con el crecimiento de estas bases. La combinacin de la informacin generada por los EST (nivel y localizacin espacio/ temporal de la expresin gnica) y la de los proyectos de secuenciacin de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de expresin y homologa estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la posible funcin de los genes identificados. Por supuesto, esto constituye una instancia inicial en la identificacin de la funcin de cada gen. Para determinar su actividad precisa deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresin por ingeniera gentica y a modificar estructuralmente la molcula de manera de

alterar la actividad de los diferentes dominios de la protena que codifica. 6 Anlisis serial de la expresin de genes El anlisis serial de la expresin de genes (SAGE) consiste esencialmente en una versin acelerada de la secuenciacin de EST. Est basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequvocamente a un transcripto, siempre y cuando est ubicada en una posicin definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste tpicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del ltimo sitio de reconocimiento de una endonucleasa especfica en el transcripto blanco. Mltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una reaccin de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, ver pg.7). Como cada etiqueta SAGE representa un nico transcripto de ARNm, es posible obtener una visin general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresin de genes entre muestras experimentales pueden entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE especficas en diferentes bibliotecas. Los genes o las secuencias EST representados por las etiquetas SAGE son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posicin adecuada. Una limitacin del SAGE es la identificacin de los genes representados por las secuencias de etiquetas. Este proceso est en primer lugar restringido a secuencias que estn accesibles en las bases de datos. Sin embargo, esta limitacin se tornar menos problemtica a medida que se generen ms secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y funcin. Otra limitacin potencial es la identificacin errnea de las etiquetas. Esto puede resultar de errores de secuenciacin y de la identificacin fallida de la regin que corresponde al SAGE en la base de datos de secuencia. Adems, ciertos transcriptos pueden estar ausentes en la muestra, dependiendo de cul sea la enzima especfica usada para generar la biblioteca de SAGE. Otros ARNm por el contrario

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

233

pueden estar representados por mltiples etiquetas SAGE a causa de la existencia de polimorfismos en un slo nucletido o el procesamiento alternativo de los transcriptos. Se espera que muchos de esos problemas afecten a una porcin relativamente pequea de los genes representados, pero no deberan ser dejados de lado en la interpretacin de los resultados. Por otra parte, dos ventajas importantes del SAGE sobre la hibridacin substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y acumulativos. Si se genera la suficiente cantidad de informacin de secuencia se obtienen perfiles exactos de la expresin de los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una clula o tejido. Existe una base de datos pblica de expresin gnica que ha sido creada para el almacenamiento y anlisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuar creciendo a medida que se contribuya con ms informacin. Otra caracterstica de los datos de SAGE es que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de bibliotecas de ADNc normalizadas o substradas. Los EST brindan informacin de secuencia mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos. Finalmente, a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciacin de ltima generacin, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciacin EST. 7 Hibridacin de microarreglos o micromatrices La evaluacin de la expresin de genes usando la tecnologa de micromatrices ha demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones. Los tres tipos generales de micromatrices incluyen: i) chips de oligonucletidos, construdos realizando la reaccin de sntesis de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio, ii) arreglos de oligonucletidos, construdos depositando oligonucletidos sobre placas de vidrio o membranas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por PCR a partir de una biblioteca sobre placas

de vidrio o membranas de nylon. Uno de los aspectos ms importantes de la experimentacin con micromatrices es la seleccin de los fragmentos de ADN que contendr. An cuando el nmero de genes representado suele ser grande (3000 a 10000), pueden faltar algunos que sean importantes para una cuestin experimental particular. La seleccin de la biblioteca ms adecuada para una aplicacin en particular y la eleccin de los clones son factores crticos que determinan el xito de estos experimentos. En algunas situaciones, puede ser ms efectivo enfocar los experimentos en un grupo pequeo de genes seleccionados por criterios ms especficos como, por ejemplo, perfiles de distribucin de tejidos, clasificacin funcional o cambio de expresin conocidos. Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar secuencias especficas usando tcnicas estndar de biologa molecular. Despus de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados para generar el arreglo de ADNc junto con los controles apropiados. Tpicamente, el largo de los insertos ser mayor a 500 bases, pero esto depende de los clones seleccionados. Los productos de PCR son purificados y luego depositados (o impresos) en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de nylon. Los instrumentos usados para la produccin de micromatrices han mejorado en los ltimos aos. Las opciones varan desde la construccin de un arreglo por raspado hasta la compra del sistema completo. Independientemente de cul sea el origen de los clones, es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que est siendo ubicada sobre la matriz para asegurar una interpretacin exacta de los datos resultantes. Por la tanto, puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una porcin de los fragmentos organizados (Fig. 5, ver pg.8). El ARNm que representa las muestras experimentales se prepara para la hibridacin con las micromatrices de ADNc por transcripcin reversa y marcado con nucletidos fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o radiactivos ([ 33 P] dCTP). Las molculas

234

PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

Figura 3: Generacin de una huella digital de ARN por la tcnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero se transcribe en forma reversa utilizando un poliT como cebador. Las hebras de ADNc se digieren con dos enzimas de restriccin, una de corte raro y otra de corte frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a ambos extremos y se preamplifican por PCR los fragmentos utilizando cebadores que reconocen la secuencia de los adaptadores. Los fragmentos que contienen adaptadores diferentes en los extremos son amplificados preferentemente a causa de que en general tienen un tamao intermedio. Luego se realiza una segunda amplificacin utilizando cebadores anclados con una o dos bases adicionales en el extremo 3que amplifican una subpoblacin de fragmentos. El cebador correspondiente al adaptador para la enzima de corte raro est marcado radiactivamente. La combinacin de diferentes cebadores anclados genera perfiles provenientes de distintos subgrupos de ARNms.

Figura 4: Procedimiento general para la obtencin de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero es transcripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima de restriccin ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la mayora de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algn sector de su secuencia. Los extremos 3de las molculas son recuperados por unin a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales que se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuacin son digeridas con una segunda enzima de restriccin (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero corta al transcripto unos 20 pares de base ms abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan, se ligan y amplifican con dos oligonucletidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatmeros y se clonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. 1995.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

235

Figura 5: Expresin de genes controlada a travs del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados por PCR se imprimen sobre un soporte slido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluorforos y se hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisin de cada fluorforo. La intensidad de la seal de hibridizacin ser proporcional al contenido de cada molcula particular de ARN en la muestra. Los patrones de emisin de ambas muestras son comparados para detectar expresin diferencial.

236

PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.

fluorescentes generalmente se usan para marcar sondas con las que se hibridarn placas de vidrio, mientras que las radiactivas se incorporan a sondas que se usarn sobre membranas de nylon. Los fluorforos Cye3 y Cye5 presentan diferentes espectros de emisin, por lo tanto dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada uno de ellos, hibridadas juntas en una reaccin nica competitiva y luego evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. Por el contrario, las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones seriales y pueden ser detectadas usando un sistema de fosfoimgenes. Independientemente del diseo experimental, el anlisis de micromatrices se basa en la premisa de que la intensidad de la seal de hibridacin resultante para una secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm que corresponde a esa secuencia en la muestra original. La expresin relativa de cada secuencia representada en el microarreglo es evaluada comparando las seales de intensidad de hibridacin generadas por las diferentes muestras experimentales. Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es crtico realizar un procesamiento apropiado de los mismos. El anlisis de la informacin obtenida puede ser dividido en tres componentes: i) identificacin y cuantificacin de las intensidades de hibridacin; ii) visualizacin de los datos; iii) tcnicas de agrupamiento. El primer componente incluye la identificacin exacta de los puntos de la imagen, la normalizacin segn el fondo, la cuantificacin de las intensidades de hibridacin y la salida de los datos en una forma utilizable. La visualizacin de los datos incluye su clasificacin y presentacin en una forma lgica y su organizacin en diferentes formatos para apuntar a la resolucin de cuestiones mltiples. Finalmente, los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de genes con patrones de expresin similar a travs de distintas muestras experimentales. En base a la presuncin de que la expresin de los genes con funciones relacionadas estn regulada en forma coordinada, el agrupamiento de datos de microarreglos se convierte en un mtodo poderoso para asignar

posibles clasificaciones funcionales a genes nuevos. 8 Conclusin Los mtodos descriptos en este captulo son tecnologas eficaces que expanden los estudios de expresin desde los genes nicos hasta el nivel genmico. Ninguno de estos procedimientos per se es ptimo para todas las aplicaciones y la mejor estrategia para situaciones especficas puede ser crear combinaciones de varios de ellos. El continuo refinamiento de las tcnicas genmicas y de la bioinformtica relacionada proporcionar a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresin de la informacin hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre el control gentico de los procesos fisiolgicos. 9 Lecuras Recomendadas
ADAMS, M. D.; J. M. KELLEY, J. D. GOCAYNE, M. DUBNICK, M. H. POLY-MEROPOULOS, H. XIAO, C. R. MERRIL, A. WU, B. OLDE, R. F. MORENO. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed se-quence tags and human genome project. Science (Wash DC) 252:16511666. DAVIS, M. M.; D. I. COHEN, E. A. NIELSEN, M. STEINMETZ, W. E. PAUL, L. HOOD. 1984. Cell-typespecific ADNc probes and the murine 1 region: the localization and orientation of Ad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:21942198. DIATCHENKO, L.; Y.-F. C. LAU, A. P. CAMPBELL, A. CHENCHIK, F. MOQA-DAM, B. HUANG, S. LUKYANOV, K. PUKYANOV, N. GURSKAYA, E. D. SVERDLOV, P. D. SIEBERT. 1996. Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific ADNc probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:60256030. GURSKAYA, N. G.; L. DIATCHENKO, A. CHENCHIK, P. D. SIEBERT, G. L. KHASPEKOV, K. A. LUKYANOV, L. L. VAGNER, O. D. ERMOLAEVA, S. A. LUKYANOV, E. D. SVERDLOV. 1996. Equalizing ADNc subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem. 240:9097. LIANG, P.; A. B. PARDEE. 1992. Differential display of eukaryotic messenger ARN by means of the polymerase chain reaction. Science (Wash DC) 257:967971. MOODY D. E. 2001. Genomics techniques: an overview of methods for the study of gene expression. J. Anim. Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

237

OKUBO, K.; N. HORI, R. MATOBA, T. NIYAMA, A. FUKUSHIMA, Y. KOJIMA, K. MATSUBARA. 1992. Large scale ADNc sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression. Nat. Genet. 2:173 179. SARGENT, T. D.; I. B. DAWID. 1983. Differential Gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Science (Wash DC) 222: 135-139. SCHENA, M.; D. SHALON, R. W. DAVIS, P. O. BROWN. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (Wash DC) 270:467470. VELCULESCU, V. E.; L. ZHANG, B. VOGELSTEIN, K. W. KINZLER. 1995. Serial analysis of gene expression. Science (Wash DC)270:484487. WELSH, J.; K. CHADA, S. S. DALAL, R. CHENG, D. RALPH, M. McCLELLAND. 1992. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of ARN. Nucl. Acids Res. 20:49654970.

238

PESSINO, Silvina C.; MARTELOTTO, Luciano G.