INTRODUCCION

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Los colorantes se usan en microscopa siempre que se tengan que visualizar microorganismos, componentes celulares y tisulares en materiales vegetales y animales. Los microorganismos se tienen que fijar y teir con colorantes adecuados para adecuarlos a la tincin microscpica. Son de especial importancia la tincin de Gram, la tincin de esporas y la deteccin de micobacterias. En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus. Estos microorganismos difieren en caractersticas tales como forma de nutricin, estructura, tamao, composicin entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio microscpico el facilita notablemente la observacin; principalmente en las bacterias se facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan tambin la observacin de ciertas estructuras celulares. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante.

MARCO TEORICO: TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS Los microorganismos, a excepcin de los virus, son visibles con el microscopio comn. La observacin puede ser realizada en muestras hmedas sin colorear (examen en fresco) o en preparacin previamente coloreadas. Las tcnicas son mltiples y en un trabajo se eligen aquellas que mejor sirven a un propsito determinado. Las muestras hmedas (examinadas con poca luz: condensador bajo y diafragma semicerrado) dan informaciones sobre movilidad de microorganismos o sirven para detectar elementos formes en una muestra (leucocitos, cilindros, hemates, etc.). Es tambin el mtodo bsico para el estudio parasitoscpico. Para este fin se emplean suspensiones de la muestra en suero fisiolgico u otros diluyentes. Una muestra hmeda puede ser tambin observada en campo oscuro contraste de fases por mtodos en fluorescencia y otros. En estos casos los propsitos son ms avanzados que los de un examen simple a menor aumento en microscopio corriente. Las coloraciones varan en forma extraordinaria, desde aquellas que usan un solo colorante, como el azul de metileno, hasta otras en las que las tcnicas son ms complejas. Ellas varan de acuerdo con los fines del estudio y guardan relacin con la naturaleza y caractersticas biolgicas del germen que se trata de observar. En esta prctica se describen tcnicas bsicas de coloracin, tiles en el estudio morfolgico y estructural de los microorganismos. A travs de ellas, es fcil formarse una idea de los mltiples procedimientos ideados por el hombre para objetivar la fiel imagen de los microorganismos.

Morfologa ultramicroscpica de las bacterias: estructuras internas PARED CELULAR Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales.

Constituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, aminoazcares, azcares y grasas. Estas sustancias (protenas, Hidratos de carbono, grasas) estn enlazadas formando el polmero complejo que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias grampositivas contienen menos aminocidos que las gram-negativas; el contenido graso es

mucho ms elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicacin del mecanismo de la reaccin al gram

MEMBRANA CITOPLSMICA (CITOPLASMTICA O PROTOPLASMTICA) Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplsmica o protoplsmica y est formada por una bicapa de fosfolpido integral y protenas perifricas empotradas. La membrana citoplsmica tiene una significacin funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la clula y la salida de los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la divisin celular el cromosoma se une a la membrana de la clula en el sitio llamado Mesosoma.

Citoplasma El material celular contenido dentro de la membrana citoplsmica puede dividirse en tres partes, regin citoplsmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, regin nuclear o cromatnica, que es rica en DNA, y la parte lquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA, combinado con protenas, forma partculas o corpsculos

macromoleculares, de unos 200 A de dimetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partculas de RNA-protena se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partculas que se encuentran en las clulas animales y vegetales. Estructuras Citoplasmticas Nucleoide (cuerpo cromatnico) Las clulas bacterianas no contienen el ncleo caracterstico de las clulas de las plantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la clula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es nico y circular, doble hlice sin protenas. Como no se trata de un ncleo discreto, se ha sugerido que se d a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatnico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el mtodo de tincin de Feulgen, especfico para el DNA, y por microscopia electrnica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma circundante. Ribosomas Tienen estrecha relacin con la sntesis de protenas (30S y 50S para formar un complejo 70S). Plsmidos Lazos extracromosmicos de ADN, algn cdigo para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores. Endosporas Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad

otros gneros de bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora. TINCIONES Encontramos microorganismos en todas partes, en el suelo, en el agua, en el aire y sobre y dentro de organismos multicelulares incluyendo los humanos. A este grupo de

microorganismos se les llama la flora normal microbiana. Hay algunos microorganismos que permanecen por pocos das o hasta meses en nuestro cuerpo, a este tipo de flora se le llama transitoria. La asociacin entre dos organismos se llama simbiosis y esto ocurre con nuestra flora bacteriana, al igual que con la asociacin de otros organismos. La relacin puede ser beneficiosa o prejudicial. Algunas bacterias beneficiosas para nosotros son el gnero Lactobacillus y Escherichia coli, esta ltima nos provee vitamina K y ciertas vitaminas del complejo B. Las siguientes partes del cuerpo contienen su propia flora microbiana: nariz, boca, conjuntiva, odo externo, estmago, piel, uretra, vagina, intestino delgado e intestino grueso. Si estas bacterias pasan de su lugar natural del cuerpo a otra parte del cuerpo pueden ocasionar enfermedades. Esto ya sera una relacin prejudicial. Podemos obtener bacterias de nuestro ambiente o de diferentes partes de la piel, boca, nariz y garganta. La boca contiene millones de bacterias en cada mililitro de saliva y en distintos organismos puede varios de acuerdo a su rgimen alimentario. Algunas de ellas son bacterias transitorias que llegan aqu con los alimentos Es por eso que las tinciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en

funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:

a. Catinicos: Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina. b. Aninicos: Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tien las clulas, sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina. c. Liposoluble: Se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro Sudn.

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos:

Simples: Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina).

Diferenciales: Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de ZiehlNeelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante.

Selectivas: Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ej.; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.

TIN CI ON ES SE LECTIVAS

Tincin de corpsculos metacromticos: Vamos a observar los corpsculos metacromticos en clulas de Lactobacillus, para lo que se toma una muestra de un yogurt con el asa de siembra y se coloca en un portaobjetos (no es necesario poner agua) y se realiza una tincin con azul de metileno como se ha descrito anteriormente. En esta preparacin se observan dos microorganismos: Lactobacillus, con los corpsculos metacromticos en su interior, y Streptococcus, cuyas clulas forman cadenas en forma de rosario.

Tincin de endosporas: Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie ante situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulacin de metabolitos txicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la clula bacteriana, pudiendo alcanzar un dimetro considerablemente mayor que el de la clula. La clula acaba por lisarse y morir dejando libre a la espora. Las endosporas germinarn cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son

producidas por especies de los gneros Clostridium: y Bacillus: C. tetani (ttanos), C. perfringens (gangrena gaseosa), C. botulinum (botulismo), B. anthracis (ntrax).

TINCIONES DIFERENCIALES

Tincin de Gram: De gran importancia en Microbiologa porque permite hacer diferenciaciones taxonmicas, separando dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el

colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM Descrita en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min. con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 min. Lavar y secar. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los

trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (gram-positivos) no se decoloran, mientras que otros (gram-negativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se

decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1. El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2. La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3. Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carcter de gram-positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms gram-positivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces gram-positivos y otras gram-negativos

Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen): Se basa en que ciertos microorganismos no son desteidos por una mezcla de cido y alcohol si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos cidoalcohol resistente. Una vez realizada la decoloracin con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las clulas sensibles a la decoloracin por cido-alcohol. Son microorganismos cido-alcohol resistentes las micobacterias, por la especfica composicin de su pared celular, y algunos actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos patgenos son cidoalcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra).

PRACTICA DE COLORACIONES

Materiales:
Cristal Violeta Lugol o bicarbonato Alcohol acetona Safranina Azul de metileno Fucsina bsica Alcohol acido al 3% Solucin salina Lamina porta objetos Asa de siembra Cepas Muestra de esputo Baja lengua

Procedimientos Despus de la Fijacin:

Fijar un frotis:

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

Coloracin Azul de Metileno: a) Colorear con azul de metileno lo suficiente para que cubra la muestra. b) Despus de dejar reposar la coloracin por 3 minutos, se procede a lavar la lmina con chorros de agua. c) Se espera a que seque y se observa en el microscopio a un objetivo de 100X. Coloracin Gran: a) Con violeta cristal utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. b) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. c) Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente lugol durante 1minuto ms. d) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. e) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. f) Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. g) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. Resultado: Hallar la diferencia entre bacterias y cocos gran positivos y gram negativos. Coloracin de Ziehl Neelsen: a) Filtre la fucsina fenicada antes de usarla. b) Cubra la superficie del extendido con fucsina. c) Pase la llama del mechero (o torunda empapada en alcohol) por debajo de la lmina, hasta que se produzca la emisin de vapores blanquecinos. Deje de calentar y repita el procedimiento dos veces ms. La emisin de los vapores blanquecinos debe lograrse tres veces en 5 minutos, que es el tiempo adecuado de contacto entre el extendido y el colorante. La fucsina no debe hervir sobre la lmina, si disminuye por evaporacin o derrame, hay que reponerla. d) Elimine la fucsina con agua del tubo a baja presin, de manera que la pelcula no se desprenda. e) Gire la lmina para lavar su cara inferior y as eliminar la fucsina ah depositada. f) Cubra la superficie del extendido con alcohol-cido al 3% efectuando un movimiento de vaivn y espere 2 minutos de modo que el alcohol-cido lo decolore y arrastre suavemente

la fucsina. Esta operacin puede repetirse hasta que sobre el extendido se observe un color rosado. g) Lave la lmina con agua segn se describe en el punto d. h) Cubra el extendido durante 1 minuto con solucin de azul de metileno. i) Lave ambas caras de la lmina con agua. j) Seque las lminas a temperatura ambiente, en posicin vertical, con el extendido hacia el frente.

Reporte de resultados: Negativo (-): No se encuentran BAAR en 100 campos observados (c.o.). o si se encuentran menos de 3 BAAR en 300 campos pticos observados. Nmero exacto: de 1-9 BAAR en 100 campos observados. Positivo (+): Promedio de menos de 1 BAAR por campo, en 100 campos observados. Lo que es lo mismo, de 10 a 99 BAAR en 100 campos Positivo (++): Promedio de entre 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados. Positivo (+++): Promedio de ms de 10 BAAR por campo, en 20 campos observados.