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FACULDADE DE ENGENHARIA E ARQUITETURA

CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO

Andrieli Angelica Deon Bruna Pazzini Daniela Cristiane Piccini Las Manica

Cintica Enzimtica

Disciplina: Bioqumica de Alimentos Professor (a): Telma Elita Bertolin

Passo Fundo

2 2010

LISTA DE TABELAS
Tabela Tabela 1: 2: Influncia Concentrao do de pH glicose na nos atividade tubos

enzimtica.........................................................7 ...................................................................8 Tabela 3: Valores de absorbncia e clculo de velocidade ..............................................9 Tabela Tabela 4: 5: Valores Valores de de Absorbncia absorbncia e e clculo clculo de de Velocidade velocidade ..........................................10 ............................................10

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Curva padro de glicose.....................................................................................8 Figura 2: Curva da Velocidade em funo da temperatura (C).......................................9 Figura 3: Curva da velocidade em funo do pH............................................................10 Figura 4: Curva da velocidade em funo da concentrao de enzima...........................11

Sumrio 1 INTRODUO..............................................................................................................4 2 DESENVOLVIMENTO ................................................................................................5 2.1 REVISO BIBLIOGRFICA................................................................................5 2.1.1 Enzimas............................................................................................................5 2.1.2 Cintica Enzimtica..........................................................................................5 2.2 MATERIAL E MTODOS.....................................................................................8 2.2.1 Material ............................................................................................................8 2.2.2 Mtodos............................................................................................................8 2.3 RESULTADOS E DISCUSSO.............................................................................9 3 CONCLUSO..............................................................................................................14 REFERNCIAS..............................................................................................................15

1 INTRODUO
As enzimas so protenas slidas biodegradveis altamente especficas com uma estrutura qumica especial, contendo um centro ativo, denominado apoenzima e muitas vezes um grupo no protico, denominado coenzima, que pode ser um on metlico ou uma molcula orgnica. As enzimas podem substituir muitos produtos qumicos nocivos ou at perigosos a sade e permitem uma produo segura e correta, so bastante solveis em gua e lcool diludo, podendo ser inativadas pelo calor ou precipitadas pelo pH, sendo as propriedades mais importantes destes compostos na tecnologia de alimentos. Devido ao seu grande poder de ativao especfica e de converso de substratos em produtos, ambos atuam acelerando ou aumentado a velocidade das reaes qumicas como forma de atividade cataltica de determinadas molculas, o catalisador um composto que acelera uma reao qumica, at torn-la instantnea ou quase instantnea, ao diminuir a energia de ativao. Alm disso, as enzimas apresentam melhor desempenho entre 30 a 70 C e em pH prximo a neutralidade, e so fundamentais para a manuteno e regulamentao de todo o metabolismo dos seres vivos.

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1.1 Enzimas As amilases esto entre as mais importantes enzimas industriais e so de grande importncia na biotecnologia atual. Alm de serem usadas como aditivos em detergentes, elas podem ser empregadas na sacarificao do amido e nas indstrias de alimentos, fermentao, papel e txtil. Com o advento de novas fronteiras biotecnolgicas, o espectro de aplicao das amilases tem se expandido para muitas outras reas, incluindo a clnica, farmacutica, mdica e qumico-analtica. As amilases ocorrem amplamente em animais, plantas e microrganismos. Entretanto, devido s vantagens que oferecem, como menor tempo de produo, as amilases microbianas tm a preferncia do mercado de enzimas. O gnero Bacillus um dos mais importantes e investigados grupos de bactrias produtoras de amilase comercial . Porm, programas para selecionar novas fontes microbianas esto crescendo ao redor do mundo. Entre os vrios parmetros que estimulam a produo de amilases, as condies de crescimento microbiano e os substratos de carbono usados no meio de cultivo tm recebido ateno especial. Fontes de carbono como dextrina, frutose, glicose, lactose, maltose, amido solvel, alm de outras, encarecem sua produo (OLIVEIRA, A O.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE, J. S.; CHAGAS, A F. 2007).

2.1.2 Cintica Enzimtica As reaes qumicas so classificadas em uma base cintica, ou seja, pela ordem de reao, podem apresentar ordem zero primeira,

6 segunda, e terceira dependendo da forma em que a velocidade da reao influenciada pela concentrao de um reagente. Assim todo o estudo da atividade dessa funo de catlise deve estar baseado em medidas quantitativas da velocidade da reao, bem como os fatores mais importantes que influenciam na velocidade de reao enzimtica, uma delas a concentrao de substrato. Segundo Michaelis Menten nos princpios gerais da cintica das reaes qumicas onde podem se aplicar s reaes catalisadas por enzimas, ambos apresentam um aspecto distinto que a saturao. Em uma determinada concentrao baixa de substrato, a velocidade de reao proporcional a concentrao de substrato, caracterizando uma reao de primeira ordem, mas medida que se aumenta a concentrao de substrato velocidade da reao em relao velocidade inicial se reduz e no se torna aproximadamente proporcional concentrao de substrato, ou seja, apresentando uma ordem de reao mista. O complexo enzima-substrato ocorre nos primeiros instantes da reao, onde a teoria de Michaelis Menten de que a concentrao de enzima e um fator dependente na formao do produto se verificam durante a reao. Efeito do pH na atividade enzimtica A maioria das enzimas apresenta um pH em que sua atividade mxima; acima ou abaixo desse pH, a atividade enzimtica se reduz. A inter-relao da atividade enzimtica com o pH para qualquer enzima depende do comportamento cido-bsico da enzima e do substrato, mas tambm de muitos outros fatores que so, em geral, difceis de analisar quantitativamente. A forma do perfil de atividade enzimtica em funo do pH varia usualmente com a concentrao do substrato, uma vez que o K da maioria das enzimas se altera com o pH. Essas curvas sero mais significativas se a enzima for mantida saturada com o substrato em valores de pH testados. Em muitos estudos da atividade enzimtica, o pH mantido constante no timo ou prximo deste ( LEHNINGER ) O pH timo de uma enzima no necessariamente idntico ao pH de seu meio

7 intracelular normal, que pode estar situado na parte ascendente ou descendente de seu perfil de atividade enzimtica em funo do pH. A inter-relao pH-atividade enzimtica pode ser um fator de controle intracelular da atividade da enzima. Efeito da temperatura na atividade enzimtica A velocidade das reaes catalisadas por enzimas aumenta com a temperatura, dentro de uma certa faixa de temperatura na qual a enzima estvel e mantm atividade integral. A velocidade da maioria das reaes enzimticas se duplica aproximadamente para cada elevao de 10C em temperatura. O coeficiente de temperatura varia consideravelmente de uma enzima para outra, dependendo da energia de ativao da reao catalisada, isto , da altura da barreira energtica do estado de transio. As reaes catalisadas por enzimas podem apresentar muitas vezes um timo de temperatura o pico desse grfico de atividade cataltica contra a temperatura surge porque as enzimas, sendo protenas, so desnaturadas pelo calor e se tornam inativas medida que a temperatura elevada alm de um certo ponto. O timo aparente de temperatura resultante de dois processos: (1) o aumento usual na velocidade de reao com a temperatura e (2) o valor crescente de desnaturao trmica da enzima acima da temperatura crtica ( LEHNINGER)

2.2 MATERIAL E MTODOS

2.2.1 Material Soluo de alfa-amilase (Termamyl diluio 1:2000) Soluo padro de amido solvel (1%) Tampes 4, 5 e 7 NaOH 1M

2.2.2 Mtodos Na (tabela 1) esto representadas as seqncias das reaes dos 3 tubos, o banho maria para reao enzima substrato estava a uma temperatura inicial de 60,3 C aps 15 min da reao o banho estava a 59,8 C, ento a partir disso foi retirado 2 ml de cada tubo de reao e colocado em outros 3 tubos novamente numerados, juntamente foi adicionado 1ml de NaOH 1 M, e 1ml de reagente 3,5 dinitrossaliclico, e posteriormente levado a aquecimento de 100 C por 5 min, para o DNS verificar e reagir com o acar redutor em ph alcalino. Obs: Como a enzima bastante forte, fornecendo um resultado de reao bastante concentrado, resultando num complexo de colorao dos 3 tubos com DNS muito intensa, passando de 1 de transmitncia no espectrofotmetro, assim sendo necessrio fazer uma diluio. Portanto transportou-se 1 ml do complexo com DNS, dos 3 tubos, em 3 novos tubos com 9 ml de gua destilada, prosseguindo ento de sua leitura no espectrofotmetro devidamente calibrado. Tabela 1: Influncia do pH na atividade enzimtica

9 Tubo Soluo padro de amido 1 2 3 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 0,5 ml de tampo pH 3,6 pH 5,2 pH 7,0 Soluo de enzima 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Tempo de reao a 60 C 15 min 15 min 15 min Aquecimen to 100 C 5 min 5 min 5 min

2.3 RESULTADOS E DISCUSSO Para a realizao da prtica onde se verificou os fatores como temperatura, pH e concentrao na velocidade de reao enzimtica, da enzima alfa-amilase. Primeiramente foi construda uma curva padro de glicose, que o produto da reao com o amido, onde obtivemos uma curva padro e sua equao da reta onde possibilitounos calcularmos a velocidade de reao e analisar os efeitos que supostamente seriam causados por fatores externos em funo da cintica de reao, envolvendo vrias concentraes de substrato. Na (tabela 2) est representada a curva de glicose construda, onde na (figura 1), mostra a equao da reta obtida para o clculo da velocidade da enzima alfa amilase, nas diversas concentraes. Tabela 2. Concentrao de glicose nos tubos
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Concentrao 0 0,01 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,1 Absorbncia () 0,008 0,056 0,199 0,275 0,358 0,403 0,466 0,521 0,684

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Analisando a (tabela 3), e os valores de velocidade calculados com base na reta de regresso de concentrao de glicose, e os dados de absorbncia, verifica-se que sua atividade foi influenciada pela alterao da temperatura a partir da (figura 2), onde em temperatura ambiente em torno de 25 C a 26 C, sua atividade diminui gradativamente, j em 0 C e a temperatura acima de 50 C a 100 C sua atividade aumentou o que refora, que a enzima alfa-amilase da (Termamyl), bastante termo resistente. Tabela 3: Valores de absorbncia e clculo de velocidade.
Temperatura (C) 0 ambiente 60 100 Absorbncia () 0,154 0,121 0,146 0,152 Velocidade 0,022727272 0,017822105 0,021538141 0,022429989

Absorbncia

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

y = 6,7276x 2+ 0,0011 R= 0,997

0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Concentrao de glicose (mg/mL) Figura 1: Curva padro de glicose.

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0,024 0,023
Velocidade

0,022 0,021 0,02 0,019 0,018 0,017 1 2

Absorbncia

1- 0 C 2- Ambiente 3- 60 C 4- 100 C

Figura 2. Curva da Velocidade em funo da temperatura (C). Em relao ao pH de ao da enzima, juntamente com a (tabela 5), em ph 5 ela apresentou melhor atividade do que em pH 7, j que isso seria improvvel, pois a alfaamilase atua em melhores condies qumicas em pH alcalino, na (figura 3), podemos ver que houve um crescimento gradativo o que pode ser explicado que o valor da absorbncia resultou pouca diferena entre o pH 5 e pH 7.

Tabela 4: Valores de Absorbncia e clculo de Velocidade.

pH 4,0 5,0 7,0 Absorbncia () 0,127 0,171 0,159 Velocidade 0,018713954 0,025254176 0,023470479

12

0,0273215 0,0252572 0,0231929 0,0211286 0,0190643 0,017 0,12 0,13 0,14 0,15 Absorbncia 0,16 0,17 0,18 Velocidade

Figura 3. Curva da velocidade em funo do pH. A (tabela 5) apresenta o que Michaelis Menten j havia demonstrado em suas pesquisas, que a media em que se aumenta a concentrao de enzima maior ser sua cintica, ou seja, vai ter mais enzima, para pouco substrato at que chega um momento em que a velocidade se estabiliza, definindo o trmino de formao do produto. Na (figura 4), esto representados os pontos onde indicam seu aumento gradativo da velocidade com o aumento da concentrao de enzima, mas lembrando que isso tambm influenciado por outras caractersticas fsicas e qumicas no qual j foi analisado nos dados acima. Tabela 5: Valores de absorbncia e clculo de velocidade.
Concentrao 0 0,5 1,0 1,5 2,0 Absorbncia () 0,127 0,119 0,123 0,164 0,164 Velocidade 0,018713954 0,017524823 0,018119388 0,024213686 0,024213686

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0,0255 0,0235 0,0215 0,0195 0,0175 0,0155 0,115 0,125 0,135 0,145 0,155 0,165 0,175 Velocidade

Absorbncia

Figura 4: Curva da velocidade em funo da concentrao de enzima.

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3 CONCLUSO
A aula prtica de enzima alfa amilase no qual definimos a velocidade a partir da concentrao de glicose e absorbncia da reao com DNS, pode ser definida onde os fatores fsicos como a temperatura influenciou diretamente na cintica, observando que como ela bem termo-resistente, a altas temperaturas apresentou melhor velocidade de reao, bem como, os fatores qumicos como a concentrao de enzima e o pH, na qual se definiu que o pH foi alterado, devido prtica ter fornecido que em pH 5 apresentou melhor atividade. Em termos de concentrao que segundo a lei de Michaelis seguiu conforme os preceitos vistos na teoria. Um fator que deve ser levado em conta que o produto da reao teve que ser diludo, o que explica algumas diferenas nos resultados.

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REFERNCIAS
Bobbio, F; P. Introduo a Qumica de Alimentos. 2 ed. So Paulo: Livraria Varela, 1996. Lehninger, A; L. Bioqumica. 2. ed. So Paulo: Editora Edgard Blucher, 1976. OLIVEIRA, A O.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE, J. S.; CHAGAS, A F. Produo de amilase por rizbios, usando farinha de pupunha como substrato. Cincia e Tecnologia de Alimentos. Vol. 27, n. 1, Campinas Jan./Mar. 2007.