COLEGIO DE ESTUDIOS CIENTFICOS Y TECNOLGICOS DEL ESTADO DE MICHOACN PLANTEL PURUNDIRO

MANUAL DE APUNTES MDULO V

Asiste en el desarrollo de procesos biolgicos utilizando tcnicas de biologa molecular

Submdulo 1
Apoya el desarrollo de procesos biolgicos utilizando tcnicas de anlisis de cidos nucleicos

Elabor: Q.F.B. Ma. del Carmen Serrato Gonzlez

Noviembre/2012
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Submdulo 1. Apoya el desarrollo de procesos biolgicos utilizando tcnicas de anlisis de cidos nucleicos. 1. Introduccin: Sin duda alguna, los cidos nucleicos son las sustancias fundamentales de los seres vivos, y se cree que aparecieron hace unos 3,000 millones de aos, cuando surgieron en la tierra las formas de vida ms elementales. Los cidos nucleicos son biomolculas orgnicas de elevado peso molecular compuestas siempre por C, H, O, N, P. Son molculas fibrilares (alargadas) gigantes no ramificadas, que desempean funciones biolgicas de trascendental importancia en todos los seres vivos; contienen informacin gentica, es decir, la informacin que permite a los organismos disponer de lo necesario para desarrollar sus ciclos biolgicos, desde su nacimiento a su muerte, adems de contar el mensaje gentico, tambin poseen las instrucciones precisas para su lectura. Los cidos nucleicos son vitales para el funcionamiento de la clula, y por lo tanto para la vida. 1.2 Desarrollo histrico La investigacin bioqumica del DNA empez con Friedrich Miescher (Fig.1) que realiz los primeros estudios qumicos sistemticos del ncleo celular. En 1868, Miescher aisl una sustancia que contena fsforo, a la que le denomino nuclena (hoy sabemos que esta sustancia es la nucleoprotena), a partir de ncleos de clulas de pus (leucocitos) obtenidas de vendajes quirrgicos. Encontr que en la nuclena estaba formada por una parte acdica, que conocemos actualmente como DNA, y una parte bsica, de protena. Ms tarde, Miescher encontr una sustancia acdica similar en la cabeza de las clulas del esperma de salmn. A pesar de que purific parcialmente la nuclena y estudio sus propiedades, estructura covalente (primaria) del DNA (tal como se muestra en la figura 14) no se conoci con total seguridad hasta finales de la dcada de 1940.

Fig. 1 Johan Friedrich Miescher (1844-1895) Bilogo y mdico suizo.

Los estudios de Miescher tuvieron un papel muy importante en la biologa molecular, que abri las puertas a numerosas pruebas y experimentos que realizaron varias personalidades diferentes, aunque en su poca el trmino nuclena era muy poco conocido y l nunca lo propuso como el ADN que conocemos hoy. Este descubrimiento, que se public por primera vez en 1871, al principio no pareci relevante, hasta que el bioqumico alemn Albrecht Kossel (Fig. 2) hizo sus primeras investigaciones en su estructura qumica. Establece las bases de la estructura del ADN, al estudiar las nuclenas (nucleoprotenas) mostrando que consistan en una porcin proteica y otra no proteica (cidos nucleicos). Este trabajo dio acceso a Kossel al Nobel en 1910. Posteriormente, describe sus componentes, distinguiendo entre adenina, citosina, guanina, timina y uracilo. Kossel estableci las bases que condujeron a esclarecer la estructura del ADN.

El trabajo fue continuado por su discpulo, el bioqumico ruso-americano Phoebus Levene (Fig. 3) quien comprob en 1900 que la nuclena se encontraba en todos los tipos de clulas animales analizadas. Ms adelante, en 1909, comprob las evidencias de Kossel, obteniendo que los cidos nucleicos estaban compuestos de cido fosfrico, una pentosa, y las
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Fig. 2 Albrecht Kossel (1853-1927) Bioqumico alemn

bases nitrogenadas. La pentosa aislada de la nuclena de levadura comprob que era ribosa. Tuvo que esperar hasta 1929 para identificar que la pentosa aislada del timo de los animales era desoxirribosa. Esta diferencia le hizo proponer que la nuclena de los animales era el nucleato de desoxirribosa (hoy en da llamado cido desoxirribonucleico o ADN), mientras que los vegetales contenan el nucleato de ribosa (cido ribonucleico o ARN). Levene tuvo mucho peso en la qumica de los cidos nucleicos, a pesar de que pronto se demostrara que era incorrecta su propuesta de que los cromosomas vegetales eran de RNA y los animales de DNA En 1944, y basndose en el experimento del microbilogo Griffith (1928) el cual marc el inicio de la investigacin hacia el descubrimiento del ADN como material gentico, Avery y colaboradores demuestran experimentalmente: son los cidos nucleicos los portadores de la informacin hereditaria y reside en stos cidos en forma de secuenciacin de las bases nitrogenadas (experimentos con bacterias virulentas y no virulentas de la neumona en ratones). A partir de todos estos estudios anteriores junto al estudio de difraccin de rayos X sobre fibras de ADN, en 1953 Watson y Crick, descubrieron la estructura del ADN y formularon la hiptesis sobre su mecanismo de autoduplicacin. Recibieron el premio nobel de medicina en 1962, por su descubrimiento.
Fig. 3 Phoebus Aaron Theodore Levene (1869-1940) Bioqumico ruso americano

Sin dudas se puede considerar al descubrimiento de la estructura de la molcula del ADN (cido desoxirribonucleico) como el hallazgo cientfico ms importante del siglo XX. Es como si se hubiera terminado de leer un libro sobre la vida lleno de incgnitas y el ADN fuera la clave para escribir otro en que dichas incgnitas son reveladas.
Fig. 4 James Watson y Francis Crick

1.3 Composicin de los cidos nucleicos. Los cidos nucleicos son las macromolculas en las cuales se almacena y procesa toda la informacin gentica de los sistemas biolgicos. En las clulas de los organismos existen dos tipos de cidos nucleicos: el cido desoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonucleico (ARN). Todos los organismos actuales utilizan al ADN como macromolcula informativa, aunque existen muchos virus, como el de la polio y el de la gripa, que usan ARN. Los dos tipos de cidos nucleicos estn formados por subunidades estructurales o monmeros, denominados nucletidos (Fig. 5), cada uno de los cuales resulta de la combinacin de un grupo fosfato, un azcar de 5 carbonos (pentosa) y una base nitrogenada. Las molculas estn unidas por enlaces covalentes como se muestra en la Fig. 5. A la unin de una pentosa con una base nitrogenada se le llama nuclesido. Esta unin se hace mediante un enlace -glucosdico (Fig. 6).

Fig. 5 Representacin de un nucletido

Fig. 6 Representacin de un nuclesido

1.3.1 Formacin de un nucletido. Enseguida se muestra el ensamblado de un nucletido: a) cido fosfrico (H3PO4), que en la cadena de cido nucleico une dos pentosas a travs de una unin fosfodiester. Esta unin se hace entre el C-3de la pentosa, con el C-5de la segunda. Su frmula es:

Fig. 7 Molcula de cido fosfrico

b) El azcar, es una pentosa que puede ser D-ribosa en el ARN o la D-2-desoxirribosa en el ADN. La diferencia entre ambas molculas de azcar es que la ribosa ha perdido el OH (oxidrilo u hidroxilo) del C 2 y ha sido reemplazado por un H (hidrgeno). En el dibujo se destacaron los carbonos 3 y 5 que son los carbonos a los que se unen las bases en el ADN o en el ARN

Fig. 8 Molculas de azcares presentes en el ARN y ADN

c) Las bases nitrogenadas que se encuentran en los cidos nucleicos son anillos heterocclicos compuestos adems de carbono e hidrgeno por nitrgeno. Son de dos tipos fundamentales: Purinas: Adenina (A) y Guanina (G), las cuales estn formadas por dos anillos hetrocclicos Pirimidinas: Timina (T), Citosina (C) y Uracilo (U), formadas por un solo anillo. 4

Fig. 6 Bases purnicas y pirimidnicas principales de los cidos nucleicos. Algunos de los nombres comunes de estos compuestos reflejan las circunstancias de su descubrimiento. La guanina, por ejemplo, se aisl por primera vez del guano (estircol de aves) y la timina se aisl por primera vez de tejido del timo.

Ahora bien, existen diferencias entre un nucletido del ADN y el del ARN como se observa en la siguiente tabla:
CIDO NUCLEICO ADN ARN GRUPO FOSFATO PO4PO4AZCAR (pentosa) Ribosa Desoxirribosa
BASES NITROGENADAS

A, C, G, T. A, C, G, U

Los Nucleotidos que forman el ADN: - Bases Nitrogenadas: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Timina (T) - Pentosa: Desoxirribosa - Fosfato

Fig. 9 Nucletidos del ADN

Los Nucleotidos que forman el ARN: - Bases Nitrogenadas: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U) - Pentosa: Ribosa - Fosfato

Fig. 10 Nucletido del ARN

1.3.2 Otras funciones de los nucletidos Adems de las funciones que les corresponde como subunidades de los cidos nucleicos, los nucletidos tambin desempean otras funciones en la clula: actan como transportadores de energa, componentes de cofactores enzimticos y mensajeros qumicos.
.Los nucletidos transportan energa qumica a las clulas Los nucletidos se encuentran en un estado estable cuando poseen un solo grupo fosfato. Cada grupo de fosfato adicional que posea un nucletido se encuentra en un estado ms inestable y el enlace del fsforo y fosfato tiende, cuando se rompe por hidrlisis, a liberar la energa que lo une al nucletido. Las clulas poseen enzimas cuya funcin es precisamente hidrolizar nucletidos para extraer el potencial energtico almacenado en sus enlaces. Por tal razn un nucletido de trifosfato es la fuente ms utilizada de energa en la clula. De ellos, el ATP (un nucletido de adenina con tres grupos de fosfato ricos en energa), es el eje central en las reacciones celulares para la transferencia de la energa demandada. El UTP (uracilo + tres fosfatos) y GTP (guanina y tres fosfatos) tambin complacen las demandas de energa de la clula en reacciones con azcares y cambios de estructuras proteicas, respectivamente

Como se mencion anteriormente el principal portador de energa, en casi todos los procesos biolgicos, es una molcula llamada adenosn trifosfato o ATP (Fig. 11).

Fig. 11 Molcula de ATP (adenosn trifosfato)

La nica diferencia entre el ATP y el AMP (adenosn monofosfato) es la unin de dos grupos fosfato adicionales. Aunque esta diferencia en la frmula puede parecer pequea, es la clave del funcionamiento del ATP en los seres vivos. Los enlaces que unen los tres grupos fosfato son relativamente dbiles, y pueden romperse con cierta facilidad por hidrlisis. Los productos de la reaccin ms comn son el ADP -adenosn di fosfato- un grupo fosfato y energa. Esta energa al desprenderse, puede ser utilizada para producir otras reacciones qumicas.

Fig. 12 Nucletidos que transfieren energa

La hidrlisis del ATP. Con la adicin de una molcula de agua al ATP, un grupo fosfato se separa de la molcula. Los productos de la reaccin son el ADP, un grupo fosfato libre y energa. Alrededor de unas 7 Kcaloras de energa se liberan por cada mol de ATP hidrolizado. La reaccin puede ocurrir en sentido contrario si se aportan las 7 Kcaloras por mol necesarias. 1.4 Polinucletidos Los nucletidos pueden unirse entre s, mediante enlaces covalentes, para formar polmeros, es decir los cidos nucleicos, el ADN y el ARN. El ADN es una molcula sumamente compleja que contiene toda la informacin gentica del individuo y regula el control metablico de todas las clulas. Es un cido nucleico presente en el ncleo, en las mitocondrias y en los cloroplastos de todas las clulas eucariotas. Se dispone de manera lineal, aunque en las procariotas tiene forma circular y est disperso en el citoplasma. El ARN es un cido nuclico formado por una cadena de ribonucletidos. Est presente tanto en las clulas procariotas como en las eucariotas, y es el nico material gentico de ciertos virus (virus ARN). El ARN celular es lineal y de hebra sencilla, pero en el genoma de algunos virus es de doble hebra.
Los nucletidos sucesivos de los cidos nucleicos estn unidos por enlaces fosfodister

Tanto el ADN como el ARN, los sucesivos nucletidos estn unidos entre s por covalencia mediante puentes construidos por grupos fosfato. El grupo 5'-hidroxilo del nucletido siguiente por un enlace fosfodister (Fig. 13). De este modo, el esqueleto covalente de los cidos nucleicos est constituido por grupos alternantes de fosfato y de pentosa, mientras que las bases caractersticas aparecen como grupos laterales unidos al esqueleto a intervalos regulares. Los esqueletos del ADN y del ARN son muy polares, ya que los grupos fosfato son cidos y estn cargados negativamente al pH de la clula, stas cargas negativas estn generalmente neutralizadas por interacciones inicas con cargas positivas de protenas, iones metlicos o poliaminas. Por otra parte, las bases purinas y pirimidnicas, que son relativamente insolubles en el agua, son hidrofbicas. Se observa que las cadenas de ADN y de ARN tienen una polaridad o direccin especifica, ya que todos los enlaces fosfodister internucleotdicos tienen la misma orientacin a lo largo de la cadena. Debido a esta polaridad, cada cadena lineal de cido nucleico tiene un extremo 5' terminal y un extremo 3' terminal.
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Los enlaces internucleotdicos presentes en el ADN y el ARN pueden ser escindidos qumicamente por hidrlisis, y tambin pueden ser hidrolizados enzimticamente por accin de las nucleasa. Algunas nucleasas pueden hidrolizar enlaces entre dos nucletidos adyacentes situados en el interior de las cadenas del ADN o del ARN; estas nucleasas se denominan endonucleasas. Otra clase de nucleasas, las exonucleasas, solo pueden hidrolizar el enlace nucleotdico terminal; algunas actan en el extremo 4' y otras en el extremo 3'. Las desoxirribonucleasas, especificas para la hidrlisis de algunos enlaces internucleotdicos de los ADNs, y las ribonucleasas especificas para los ARNs, se encuentran en todas las clulas. Son secretadas por el pncreas en el tracto intestinal, en donde participan en la hidrlisis de los cidos.

Fig.14: Sntesis de un polinucletido. Formacin del enlace Fosfodister por unin covalente de 2 nucletidos vecinos.

Fig. 15 Enlace fosfodister del esqueleto covalente del DNA y el RNA

Los grupos funcionales ms importantes de las purinas y pirimidinas son los grupos carbonilo y los tomos de nitrgeno del anillo y los grupos amino exocclicos. La formacin de enlaces de hidrogeno, en los que participan el grupo amino y carbonilo, constituye el segundo tipo principal de interaccin entre las bases en las molculas de cidos nucleicos. Los enlaces de hidrogeno entre las bases permiten la asociacin complementaria de dos (y en ocasiones de tres a cuatro) cadenas de cido nucleico. Resumen 1. Algunos conceptos bsicos Un nucletido est formado por una base nitrogenada (purina o pirimidina), un azcar pentosa y uno o ms grupos fosfato. Los cidos nucleicos son polmeros de nucletidos unidos por enlaces fosfodister entre el grupo hidroxilo en 5de una pentosa y el grupo hidroxilo en 3de la siguiente. Existen dos tipos de cidos nucleicos: RNA y DNA. Los nucletidos del RNA contienen ribosa y las bases pirimidnicas comunes son uracilo y citosina. En el DNA los nucletidos contienen 2desoxirribosa y las bases pirimidnicas timina y citosina. Las purinas principales son, tanto en el DNA como en RNA, la adenina y guanina.

1.5 Estructura de los cidos nucleicos Desentraar la estructura del ADN result esencial para comprender procesos celulares, y para desarrollar tcnicas de biologa molecular y de ingeniera gentica, que contribuyeron al avance de la biotecnologa moderna. Actualmente, mediante estas tcnicas que emplea la biotecnologa moderna, es posible transferir ADN de un organismo a otro y conferirle as nuevas caractersticas, disear nuevos frmacos o mejorar cultivos, entre otras aplicaciones. El descubrimiento de la estructura del DNA por parte de James Watson y Francis Crick en el ao de1953 fue un momento culminante en la historia de la ciencia, del que surgieron disciplinas completamente nuevas y que repercuti en el curso de otras muchas que ya estaban establecidas. Nuestro conocimientos actuales acerca de cmo se almacena y utiliza la informacin gentica de una clula se basan en investigaciones que han sido posibles gracias a este descubrimiento, las cuales ya fueron descritas (apartado 1.2). Como en el caso de la estructura de las protenas, en ocasiones resulta de utilidad describir la estructura de los cidos nucleicos en trminos de niveles de complejidad jerarquizados (estructuras primaria, secundaria, terciaria). La estructura primaria de un acido nucleico est definida por su estructura covalente y su secuencia de nucletidos. Cualquier estructura regular y estable adoptada por algunos o por todos nucletidos de un cido nucleico puede ser considerada como estructura secundaria. En general, se considera estructura terciaria el plegamiento complejo de los grandes cromosomas en el nucleoide bacteriano o en la cromatina eucaritica.
El DNA almacena informacin gentica

Miescher y otros sospechaban que la nuclena (el acido nucleico) estaba asociada de algn modo con la herencia celular, pero la primera prueba directa de que el DNA era el depositario de la informacin gentica llego en 1944 con Oswald T. Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty, quienes hallaron que el DNA extrado de una cepa Streptococcus pneumoniae, conocida tambin como neumococo, poda transformar genticamente una cepa no virulenta de este mismo organismo, convirtindola en una forma virulenta (fig. 12). Avery y sus colaboradores concluyeron que el DNA extrado de la cepa virulenta transportaba el mensaje gentico hereditario de la virulencia. No todos aceptaron estas conclusiones, pues impurezas de naturaleza
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proteica presentes en el DNA podan haber sido el verdadero transportador de la informacin gentica. Esta posibilidad quedo pronto descartada, al observarse que el tratamiento de DNA con enzimas proteolticos no destrua la actividad transformadora, mientras que el tratamiento con desoxirribonucleasas (enzimas que hidrolizan el DNA) s lo haca.

Fig.16 El experimento de Avery-MacLeod-McCarty. (a) Cuando se inyecta a ratones, la cepa capsulada de neumococo es letal (b) Mientras que la cepa no capsulada es inocua (c) Al igual que las clulas muertas por el calor de la cepa capsulada. (d) Investigaciones anteriores a cargo de bacterilogo Frederick Griffith haban mostrado que bacterias virulentas muertas por el calor (inofensivas para los ratones) aadidas a una cepa viva no virulenta transformaban permanentemente esta ltima, convirtindola en una cepa encapsulada, virulenta y letal. (e) Avery y colaboradores extranjeros el DNA de neumococos virulentos muertos por calor, eliminando la protena en la medida de lo posible, y aadieron este DNA a bacterias no virulentas. El DNA penetro en las bacterias no virulentas, que resultaron transformadas permanentemente en una cepa virulenta.

Las molculas de DNA tienen diferente composicin de bases

Un elemento de gran importancia de la estructura del DNA fue el trabajo de Erwin Chargaff y colaboradores a finales de la dcada de 1940. Encontraron que las cantidades de las cuatro bases de los nucletido del DNA variaban segn el organismo y que las cantidades relativas de ciertas bases estaban muy relacionadas. Estos datos, acumulados a partir de los DNA de un gran nmero de especies diferentes, permitieron a Chargaff concluir que:
La composicin de bases del DNA normalmente vara de una especie a otra.

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Las muestras de DNA aisladas a partir de tejidos diferentes de la misma especie tienen la misma composicin de bases. La composicin de la bases del DNA de una determinada especie no vara con la edad del organismo, ni con su estado nutricional, ni con las variaciones ambientales. En todos los DNA celulares, independientemente de la especie, el numero de residuos de adenina es igual al de residuos de timina (es decir, A=T) y el numero de residuos de guanina es igual al nmero de residuos de citosina (G=C). a partir de estas relaciones se deduce que la suma de residuos de purina es igual a la suma de los residuos de pirimidina; es decir, A + G = T + C.

Estas relaciones cuantitativas, denominadas en ocasiones reglas de Chargaff, fueron confirmadas posteriormente por muchos investigadores. Fueron esenciales para la deduccin de la estructura tridimensional del DNA y dieron pistas de cmo esta codificada la informacin gentica en el DNA y se transmite de una generacin a la siguiente. El DNA es una doble hlice Rosalind Franklin y Maurice Wilkins utilizaron un poderoso mtodo analtico, la difraccin de rayos X. para analizar fibras de DNA, a principios de la dcada de 1950 demostraron que el DNA produce un diagrama de difraccin de rayos X caracterstico. El anlisis de los diagramas permiti deducir que las molculas de DNA son helicoidales, con dos periodicidades a lo largo del eje longitudinal, una primaria de 3,4 y otra secundaria de 34 . El problema consista, pues, en la construccin de un modelo tridimensional de la molcula Fig. 18 Maurice Wilkins Fig.17 Rosalind franklin de DNA que pudiera explicar no solo los datos de difraccin 1920-1958 de los rayos X sino tambin las equivalencias especificas entre las bases, A = T y G = C, descubiertas por Chargaff, junto con otras propiedades qumicas del DNA. En 1953, Watson y Crick postularon un modelo tridimensional para la estructura del DNA que tena en cuenta todos los datos disponibles. Consiste en dos cadenas helicoidales enrolladas alrededor del mismo eje, formando una doble hlice dextrgira. Los esqueletos hidroflicos formados por la desoxirribosa y los grupos fosfato alternados estn en el exterior de la doble hlice, en contacto con el agua circundante.

Las dos hebras de la doble hlice son antiparalelas, es decir, estn orientadas en direccin opuesta. Las dos hlices se mantienen unidas entre s por puentes de hidrgeno que se establecen entre las bases nitrogenadas, las cuales se aparean de forma complementaria, tal como ocurre con la llave que abre una cerradura. Es decir, debido a la estructura qumica de las molculas, la adenina slo puede aparearse con la timina mediante dos puentes de hidrgeno, y la citosina con la guanina con tres puentes de hidrgeno (Fig. 20). A diferencia de los enlaces covalentes, los puentes de hidrgeno son relativamente dbiles, hecho que es muy importante para las funciones que realiza esta macromolcula esencial.

Fig.19 James Watson y Francis Crick con su modelo de ADN

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Fig. 20 Los nucletidos se unen por puentes de hidrgeno (parte sombreadas)

Fig.21 Complementariedad de las hebras del DNA de doble hlice. Las cadenas antiparalelas complementarias del DNA siguen las reglas de apareamiento propuestas por Watson y Crick. Las dos cadenas antiparalelas apareadas tienen diferente composicin. Obsrvese las equivalencias de bases: A = T y G = C en el dplex.

El esclarecimiento de la base qumica de la herencia sugiri la forma en que la molcula de ADN se replica, ya que cada base especifica a su complementaria (que slo es una), debido a los puentes de hidrgeno que pueden formarse entre ellas. La estructura de doble hlice tambin sugiri que el orden o secuencia en el que se encuentran las bases en el ADN debe dirigir un mensaje codificado que la maquinaria celular debe traducir a un lenguaje distinto, el de las protenas, que en ltima instancia estn organizadas por los genes. Replicacin del DNA El proceso de replicacin de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idntica). De esta manera de una molcula de ADN nica, se obtienen dos o ms "clones" de la primera. Esta duplicacin del material gentico se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la sntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hlice contiene una de las
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cadenas del ADN original. Gracias a la complementacin entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idnticamente, lo que permite que la informacin gentica se transmita de una clula madre a las clulas hijas y es la base de la herencia del material gentico. La molcula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrgeno entre las bases complementarias liberndose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria aadiendo nucletidos que se encuentran dispersos en el ncleo. De esta forma, cada nueva molcula es idntica a la molcula de ADN inicial. Al final de la rplica quedan formadas dos dobles hlices, cada una de ellas con una de las hebras originales (molde) y una hebra recin sintetizada (hija). En la figura 22 se muestra un esquema del proceso. La replicacin empieza en puntos determinados: los orgenes de replicacin. Las protenas iniciadoras reconocen secuencias de nucletidos especficas en esos puntos y facilitan la fijacin de otras protenas que permitirn la separacin de las dos hebras de ADN formndose una horquilla de replicacin. Un gran nmero de enzimas y protenas intervienen en el mecanismo molecular de la replicacin, formando el llamado complejo de replicacin o replisoma. Estas protenas y enzimas son homlogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias.

Fig. 22 La replicacin del DNA segn Watson y Crick. Las hebras preexistentes o parentales se separan y cada una de ellas sirve de modelo para la biosntesis de una hebra complementaria hija. La ADN polimerasa aade los nucletidos complementarios a los de la cadena original.

Las dimensiones de la hlice, independientemente de la especie, son las siguientes: dimetro 20 Angstrom y la longitud del paso 34 Angstrom el cual est constituido por 10 residuos de nucletidos. El tamao de la molcula de ADN de doble hlice se expresa en miles de bases o kb. La longitud de 1kb es entonces 0.34 micras.
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Una molcula de ADN de un milmetro de longitud estar formada de 3 mil kb o sea tres millones de bases. As pues la molcula de ADN es un largo filamento de 20 Angstrom de dimetro cuya longitud depende del nmero de kb, el cual a su vez depende de la especie. El rango de tamao va desde 2 micras (5 kb) en el virus SV40, hasta casi un metro (3 x 106 kb) en cromosomas humanos. El genoma de E. coli, no tiene extremos, o sea forma un crculo, y el permetro tiene una longitud de 1.4 mm (4000kb). El genoma de los animales superiores no forma crculos, es una estructura lineal abierta.

Fig. 23 Estructura de la doble hlice

La unidad funcional ms sencilla en una molcula de ADN es un gen (Fig. 24) y no hay que olvidar que las caractersticas tanto visibles como fisiolgicas de los seres vivos dependen de la estructura y de la expresin precisa de los genes. Los genes estn localizados en los cromosomas y la totalidad de los genes que caracterizan a un organismo se denomina genoma.
Fig 24 Diagrama esquemtico de un telmero de un gen corto, dentro de la estructura en doble hlice del ADN que, al comprimirse, va formando un cromosoma (derecha). Se trata de un gen eucariota (el procariota carece de intrones). Las protenas se codifican slo en los exones.

En los cromosomas estas molculas de ADN se arreglan en estructuras ms compactas en las que la doble hlice se enrolla sobre s misma. En el caso de las bacterias, la molcula de ADN de ms de un milmetro de longitud se arregla dentro de la bacteria que slo tiene una longitud de una micra (o sea es una longitud mil veces menor).

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La estructura de Watson y Crick se conoce tambin como forma B de DNA o DNA B. la forma B es la estructura ms estable que puede adoptar un DNA de secuencia al azar en condiciones fisiolgicas y es el punto de referencia estndar en los estudios sobre las propiedades del DNA. Las formas A y Z del DNA son dos variantes estructurales que han sido caracterizadas a fondo en estructuras cristalinas. Estas tres conformaciones del DNA se muestran en la figura 19. La forma A predomina en disoluciones relativamente pobres en agua. El DNA esta todava estructurado en una doble hlice dextrgira, pero la hlice es ms gruesa y el nmero de pares de base por vueltas es de 11, en lugar de los 10,5 del DNA B. El plano de los pares de bases de la forma A tiene una inclinacin de unos 20 con respecto al eje de la hlice. Estos cambios estructurales hacen que el surco ancho sea ms profundo y el surco estrecho ms superficial. Los reactivos utilizados para promover la cristalizacin de DNA tienden a deshidratarlo y por eso muchos DNA cortos cristalizan en forma A. Estructuras en doble hlice El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos slo se han observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La estructura de Watson y Crick se conoce tambin como forma B de DNA o DNA B. la forma B es la estructura ms estable que puede adoptar un DNA de secuencia al azar en condiciones fisiolgicas y es el punto de referencia estndar en los estudios sobre las propiedades del DNA. Las formas A y Z del DNA son dos variantes estructurales que han sido caracterizadas a fondo en estructuras cristalinas. Estas tres conformaciones del DNA se muestran en la figura 19. La forma A predomina en disoluciones relativamente pobres en agua. El DNA est todava estructurado en una doble hlice dextrgira, pero la hlice es ms gruesa y el nmero de pares de base por vueltas es de 11, en lugar de los 10,5 del DNA B. La conformacin que adopta el ADN depende de su secuencia, la cantidad y direccin de superenrollamiento que presenta, la presencia de modificaciones qumicas en las bases y las condiciones de la solucin, tales como la concentracin de iones de metales y poliaminas. De las Fig. 25 De izquierda a derecha, las estructuras de tres conformaciones, la forma "B" es la ms comn en ADN, A, B y Z las condiciones existentes en las clulas. Las dos dobles hlices alternativas del ADN difieren en su geometra y dimensiones. La forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, ms amplia que la "B", con una hendidura menor superficial y ms amplia, y una hendidura mayor ms estrecha y profunda. La forma "A" ocurre en condiciones no fisiolgicas en formas deshidratadas de ADN, mientras que en la clula puede producirse en apareamientos hbridos de hebras ADN-ARN, adems de en complejos enzima-ADN. Los segmentos de ADN en los que las bases han sido modificadas por metilacin pueden sufrir cambios conformacionales mayores y adoptar la forma "Z". En este caso, las hebras giran alrededor del eje de la hlice en una espiral que gira a mano izquierda, lo opuesto a la forma "B" ms frecuente. Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por protenas especficas que se unen a ADN-Z y posiblemente estn implicadas en la regulacin de la transcripcin.

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El ARN es un filamento de una sola cadena, no forma doble hlice. La presencia de un oxgeno en la posicin 2' de la ribosa impide que se forme la doble cadena de la manera en que se forma en el ADN. El filamento de ARN se puede enrollar sobre s mismo mediante la formacin de pares de bases en algunas secciones de la molcula. Todas las molculas de ARN comparten la estructura de la Figura 26; sin embargo, hay variaciones que dependen de la longitud de cadena, la secuencia de bases, las modificaciones qumicas operadas posteriormente sobre la molcula y el plegamiento o estructura tridimensional que adopta la cadena lineal. Todos los ARN se sintetizan en el ncleo, pues su sntesis requiere ADN como molde, aunque muchos de ellos son transportados luego al citoplasma. Existen varios tipos de ARN cada uno con funcin distinta. Los que forman parte de las subunidades de los ribosomas se les denomina ARN ribosomal (rARN), los ARN que tienen la funcin de transportar los aminocidos activados, desde el citosol hasta el lugar de sntesis de protenas en los ribosomas; se les conoce por ARN de transferencia (tARN) y los ARN que son portadores de la informacin gentica y la transportan del genoma (molcula de ADN en el cromosoma) a los ribosomas son llamados ARN mensajero (mARN). El tamao de las molculas de ARN es mucho menor que las del ADN. En el caso de E. coli va de menos de 100 nucletidos en los tARN hasta casi 4000 (4kb) en rARN. Flujo. El apareamiento de bases es tambin el mecanismo para enviar la informacin gentica desde el ncleo hasta los ribosomas y dirigir la sntesis de protenas. En este caso una porcin de una de las cadenas del ADN sirve de patrn para la sntesis de ARN y la secuencia de bases en el ARN es complementaria a la que se presenta en la porcin de la cadena que se est copiando. Al ARN que se sintetiza en esta forma se le denomina ARN mensajero o mARN. La sntesis del ARN es catalizada por la ARN polimerasa, que al igual que la ADN polimerasa es una enzima patrn-dependiente. El mARN se une, en el citoplasma, a las dos subunidades ribosomales, constituyendo el ribosoma activo, que es la estructura celular responsable de la sntesis de protenas. Es en este organelo donde el mARN especifica la secuencia en que deben de insertarse los aminocidos en la sntesis de polipptidos. sta es la forma en que la informacin contenida en los cromosomas se traduce en la especificacin de la estructura primaria de las protenas. Como ya se mencion, la estructura primaria determina la estructura tridimensional de la protena, la que a su vez determina su funcionalidad.

Fig. 27 Mecanismo de replicacin, transcripcin y transduccin

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Al proceso de copiado de la informacin gentica contenida en el ADN cromosomal durante la sntesis del mARN se le llama transcripcin. Al proceso de lectura, en el ribosoma, de la informacin transportada por mARN, durante la sntesis de protena, se le conoce como traduccin. RESUMEN 2
Hay muchos datos a favor de que DNA contiene la informacin gentica. En concreto, el experimento de Avery-MacLeod-McCarty revel que el DNA aislado de una cepa bacteriana puede incorporarse y transformar las clulas de otra cepa, confirindoles algunas de las caractersticas heredables de la cepa donante. Como resultado de la sntesis de muchos datos publicados, Watson y Crick propusieron que el DNA nativo consiste en dos cadenas antiparalelas dispuestas en forma de doble hlice dextrgira. Los pares de bases complementarios A=T y GC se forman mediante puentes de hidrgeno dentro de la hlice. Los pares de bases estn apilados perpendicularmente al eje mayor de la doble hlice, separados por 3,4 y con 10,5 pares de bases por vuelta. El DNA puede adoptar diferentes formas estructurales. Dos variantes de la forma de Watson y Crick, o DNA B, son el A y el Z. algunos cambios dependientes de secuencias provocan la curvatura de la molcula de DNA. El RNA mensajero transfiere la informacin gentica del DNA a los ribosomas para la sntesis proteica. El RNA de transferencia y el RNA ribosmico tambin estn implicados en la sntesis proteica. El RNA puede ser estructuralmente complejo; las cadenas sencillas de RNA pueden formar horquillas, regiones de doble cadena y bucles complejos.

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2. EXTRACCIN DE ACIDOS NUCLEICOS 2.1 Introduccin La Biologa Molecular es la disciplina cientfica que tiene como objetivo el estudio de los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular. Dentro del Proyecto Genoma Humano puede encontrarse la siguiente definicin sobre la Biologa Molecular: El estudio de la estructura, funcin y composicin de las molculas biolgicamente importantes. Esta rea est relacionada con otros campos de la Biologa y la Qumica, particularmente Ingeniera gentica y Bioqumica. La biologa molecular concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la clula, lo que incluye muchsimas relaciones, entre ellas las del ADN con el ARN, la sntesis de protenas, el metabolismo, y el cmo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un correcto funcionamiento de la clula. La extraccin y purificacin de cidos nucleicos es el paso ms importante en estudios de biologa molecular y de las tcnicas de ADN recombinante. El objetivo de la extraccin de cidos nucleicos es obtenerlos purificados de varias fuentes con el propsito de conducir a un anlisis ms especfico. Con el propsito de obtener cidos nucleicos ms puros y libres de contaminantes, se deben utilizar mtodos de extraccin especficos. Actualmente es muy importante el conocimiento del ADN pues permite explicar el genoma humano, ste favorece directamente el esclarecimiento de crmenes, violaciones, nios robados y recuperados, as como establecer el diagnstico molecular de enfermedades como cirrosis, artritis reumatoide, sndrome hepatorrenal, por mencionar algunos. Al mismo tiempo nos permite entender temas como mutacin, clonacin y transgnicos. 2.1 Modificacin de cidos nucleicos Todas las molculas del ADN son similares en trminos de sus caractersticas bioqumicas y fsicas. Por lo tanto, as como las protenas, las tcnicas de ADN no son altamente dependientes sobre el gen particular que es estudiado. Sin embargo, el ADN genmico es una molcula extremadamente grande. Por ejemplo, el genoma humano contiene aproximadamente 2 x 10 9 pares de bases (pb) El tamao de un gene para una protena del 50kDa puede ser tan pequeo como 2000pb (o 2 KB). Por lo tanto, puede ser absolutamente difcil identificar y caracterizar genes especficos de un organismo El estudio de genes especficos implica el manipular de los cidos nucleicos. Es posible romper el ADN en fragmentos ms pequeos, identificar los fragmentos del inters y amplificar estos fragmentos para poderlos analizar. Las enzimas se utilizan para realizar estas manipulaciones del ADN y del ARN. Las enzimas de modificacin del ADN incluyen: polimerasas, ligasas y nucleasas. Las polimerasas sintetizan los cidos nucleicos en una manera de molde. Las ligasas ensamblan fragmentos de ADN. Las nucleasas unen enlace del fosfodiester y los nucletidos.

Una amplia gama de especificidades es exhibida por las nucleasas. Las exonucleases quitan los nucletidos uno a la vez el extremo de 5' 3'. Adems, algunas exonucleases exhiben especificidades del substrato en trminos de las preferencias por la doble hlice (ds) o de la hlice simple (ss) del ADN o ARN Las endonucleasas unen los enlaces fosfodiester en medio de un oligonucletido y produce fragmentos. Las exonucleasas y endonucleasas tienen aplicaciones dirigidas primariamente en la
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remocin de tipos de cidos nucleicos no deseados o de remover las proyecciones de la hlice simple de una doble. 2.2 Aislamiento de cidos Nucleicos Tres tipos importantes de tcnicas, o combinaciones de ellas, se emplean en el aislamiento de cidos nucleicos: Solubilidad diferenciada. Mtodos de la absorcin. Centrifugacin del gradiente de densidad. La opcin del mtodo depender del tipo de ADN que sea aislado y del uso. Una meta importante del aislamiento del cido nucleico es la remocin de protenas. La mayora de los protocolos de aislamiento del cido nucleico implican un paso de lisis de la clula, tratamientos enzimticos, solubilidad diferenciada (por ejemplo, extraccin o absorcin del fenol a una ayuda slida), y precipitacin. 2.3 Conceptos bsicos En pocas palabras, la extraccin de cidos nucleicos se refiere a la extraccin de cido desoxirribonucleico (ADN) o cido ribonucleico (ARN) de las clulas o virus en el que normalmente se encuentran. Existen tres pasos fundamentales en la extraccin de un cido nucleico (ADN o ARN): 1) Homogeneizacin de la muestra: Permite la disgregacin de la estructura tisular y celular para facilitar la salida de los cidos nucleicos. Dentro de los mtodos para la homogenizacin podemos mencionar los fsicos como la sonicacin, hervido, congelacin-descongelacin, choque osmtico, etc; los qumicos como la utilizacin de detergentes (SDS) y tambin los enzimticos como la lisozima, la proteinasa K, etc. El agregado de quelantes de magnesio, como el EDTA, a las soluciones de extraccin contribuye tambin a la reduccin de la integridad de las membranas. 2) Separacin y Purificacin: Permite la eliminacin progresiva de protenas y otros contaminantes celulares y la obtencin de un material gentico cada vez ms limpio. Dentro de las metodologas utilizadas las ms comunes son la extraccin con mezclas de fenol-cloroformo y la separacin cromatogrfica. En el caso del fenol-cloroformo, el fenol es un solvente orgnico que se utiliza para la desnaturalizacin y solubilizacin de las protenas y componentes celulares y el cloroformo permite la separacin de las fases durante la centrifugacin, adems de tambin ser desnaturalizante. En particular, la extraccin con fenol se utiliza extensamente para el aislamiento del ADN geonmico de alto peso molecular. La separacin de protenas se puede lograr tambin mezclando la muestra con un volumen igual de fenol que se ha saturado previamente con Tris buffer de pH 8 que contenga EDTA y NaCl. El fenol debe ser fenol del grado de la biologa molecular y debe almacenarse a -20 hasta la preparacin de la solucin saturada. La solucin saturada se almacena a 4. El fenol se oxida fcilmente, se amarillenta, y los productos de la oxidacin pueden romper el ADN. El fenol oxidado debe ser desechado.
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Dependiendo del uso, las dos fases son mezcladas totalmente en el vrtex, o mezclado suavemente (ej., ADN de alto peso molecular). Las fases se separan por centrifugacin y la fase acuosa en la parte superior, la cul contiene los cidos nucleicos, se conserva. Las protenas sern a menudo visibles como material floculento en la parte superior de la fase fenlica. Las dos fases necesitan ser separadas cuidadosamente en esa etapa los cidos nucleicos y las protenas tienden a estar en el interfaz. Si se deja demasiada capa acuosa conducir a la prdida indebida de material y la aspiracin prxima a la interfaz puede incluir a la protena. La fase acuosa se puede reextraer con el fenol para quitar ms protena. Cuando lo que se utiliza es una separacin cromatogrfica generalmente se recurre a columnas preempaquetadas ya sea de afinidad o de intercambio inico previa unin del cido nucleico a resinas o matrices de slice. Estas son lavadas varias veces para eliminar contaminantes y posteriormente se procede a la elucin del cido nucleico.

Fig. 28 Vrtex

3) Precipitacin: Permite la obtencin del cido nucleico listo para ser almacenado o diluido a la concentracin deseada para su utilizacin. Este paso se realiza mediante el agregado de 1 volumen de isopropanol o 2 a 3 volmenes de etanol. 2.4 Tcnicas de extraccin del ADN El primer paso en la purificacin del ADN consiste en homogeneizar las clulas y distar los ncleos de los cuales se extrae el ADN. El medio de extraccin de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los ncleos y liberar el ADN, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solucin. El detergente inhibe tambin cualquier actividad de la enzima nucleasa en la preparacin. El objetivo de los pasos de purificacin es separar el ADN de materiales contaminantes, como ARN y protenas. La desproteinizacin se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de protenas que suprime la solubilidad de las protenas en la preparacin y las precipita. Puesto que el fenol y la solucin salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensin para separar las bases, permaneciendo el ADN (y el ARN) en la solucin dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado concentrado en la interfase. La fase acuosa se retira del tubo y se somete a ciclos repetidos de agitacin con fenol y centrifugacin hasta agotar toda la protena de la solucin. Aadiendo etanol fro. El etanol fro forma una capa arriba de la solucin acuosa del ADN, el cual, se enrolla sobre una varilla de vidrio conforme sale de la solucin. En la interfase el ARN sale de la solucin salina. En contraste, el ARN sale de la solucin como precipitados que se asienta en el fondo del vaso. Luego de este primer paso de purificacin, se disuelve el ARN y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa. Enseguida se quita la proteasa por desproteinizacin con fenol y se vuelve a precipitar el ADN. La presencia de ADN se puede confirmar mediante electroforesis en un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio, u otro colorante fluorescente que reacciona con el ADN, y el control bajo luz UV.
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2.5 Tcnicas de extraccin de ARN El RNA es el cido nucleico ms abundante en la clula, y puede purificarse fcilmente. Una clula tpica contiene 10 veces ms RNA que DNA. El azcar presente en el RNA es la ribosa, que posee un grupo hidroxilo (OH) libre en la posicin 2'. Este grupo participa en la formacin de un intermediario en el mecanismo de hidrlisis y determina que el RNA sea qumicamente inestable, y se hidrolice fcilmente en una solucin acuosa alcalina. En la mayor parte de los casos, el RNA es un polmero monocatenario (ssRNA), pero las secuencias nucleotdicas de estas molculas poseen, en mayor o menor medida, regiones complementarias que determinan tramos de apareamientos intracatenarios (estructura secundaria en forma de dsRNA). Las RNAsas utilizan el mismo mecanismo que se observa en la catlisis alcalina, pero la mayora de estas enzimas atacan exclusiva- o preferentemente la ssRNA. Cuando se desea clonar un determinado gen para luego analizar su expresin resulta de mucha importancia la obtencin de preparaciones de RNA limpias y que contengan molculas intactas. El RNA proveniente de cualquier clula puede ser copiado a molculas de DNA de doble hebra y estas luego pueden ser clonadas en un vector resultando en la produccin de bibliotecas de cDNA especficas del tipo celular en cuestin. Para que estos clones sean tiles en el anlisis resulta crtico que se cuente con RNAs ntegros y completos como material de partida. La mayor dificultad para la obtencin de dichas preparaciones es que la mayora de las RNAsas, que degradan nuestras molculas de inters, son enzimas muy estables y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequea cantidad de las mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparacin puede constituir un verdadero problema. 2.5.1 Aislamiento de ARN La mayora de los protocolos del aislamiento del ARN tambin implican extracciones del fenol y son similares a los aislamientos del ADN. Sin embargo, hay algunas diferencias y consideraciones especiales. Las precauciones contra actividad del ARNse deben ser tomadas. El ARNse es una enzima extremadamente estable y activa. Siempre se deben usar guantes y el quipo estril debe ser utilizado siempre que sea posible evitar la introduccin del ARNse exgeno a la muestra. La cristalera necesita tratado con el DEPC-agua y esterilizado para hacer inactivo cualquier ARNse. Los buffer se deben preparar del DEPC-agua o de los inhibidores del ARNse incluidos.

No Consideracin 1 Inhibidores ARNsa 2 Extraccin en sales de guanidina 3 Extracciones con fenol a pH 5-6 4 Tratamiento con ARNasa y AADNsa libre 5 Precipitacin con Lic. 6 Columna oligo

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La lisis celular y la solubilidad del ARN se llevan a cabo en las sales del guanidina (especialmente en tiocianato de guanidina). La guanidina es un agente chaotrpico fuerte e inhibir ARNasas. El efecto desnaturalizante fuerte de esta sal tambin promover una mejor extraccin del fenol. La extraccin del fenol es igual que el aislamiento de ADN excepto que el fenol se satura con un buffer de pH5-6 El pH ms bajo dar lugar a un poco de ADN que se reparte en la fase orgnica. 2.5.2 Precipitacin de ARN con LiCl El LiCl se ha utilizado para precipitar selectivamente el ARN. ARNs grandes (rARN, el mARN) son insolubles en alta fuerza inica, mientras que ARNs pequeo (tARN y el rARN 5S) y el ADN siguen siendo solubles. Despus del fenol o de la extraccin del guanidine, un volumen igual de LiCl de 8 M se le agrega. La muestra se mezcla vigorosamente y se incuba en -20. El precipitado es recogido por la centrifugacin y reprecipitado si es necesario 2.6 Cuantificacin de cidos nucleicos. 2.6.1 Por espectrofotometra. Una vez realizada la extraccin de ADN y ARN de una muestra problema, se requiere conocer la cantidad y la calidad del cido nucleico obtenido. Esto se determina mediante espectrofotometra. La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro (Fig. 29) es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo.

Fig. 29 Espectrofotmetro

La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida. Naturaleza de la radiacin electromagntica La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define: a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m. b) Frecuencia (n): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su frmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

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c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h x n = h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energa y viceversa. d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos gamma de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las ms interesantes para nosotros son: Regin Ultravioleta: l = 10-380 nm Regin Visible: l = 380-780 nm Regin Infrarroja: l = 780-30.000 nm En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula puede ser dispersada o absorbida. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia. Gracias a esto podemos cuantificar a distintas sustancias entre otras al ADN.

Fig. 30 Espectro electromagntico

Fig. 30 Espectro electromagntico.

La espectrofotometra es una tcnica que permite medir la concentracin de las sustancias utilizando la luz. Esto se debe a que cada molcula de cada sustancia absorbe la luz a diferentes longitudes de onda, dependiendo de cmo y de que las sustancia esta constituida qumicamente. Las muestras de ADN se miden a una longitud de onda entre 260-280nm en el espectrofotmetro. El aparato funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiacin luminosa de longitud de onda conocida y se mide la energa luminosa transmitida con una clula fotoelctrica situada detrs de la muestra; los distintos elementos estn conectados a los sistemas elctricos o mecnicos adecuados para controlar la intensidad luminosa y la longitud de onda y para convertir en variaciones de tensin la energa recibida en la clula fotoelctrica. Las variaciones de tensin se miden en un contador o se registran en un ordenador para su posterior anlisis. Cada molcula absorbe la energa radiante a una longitud de onda especfica, a partir de la cual es posible extrapolar la concentracin de un soluto en una solucin. La espectrofotometra UV/Visible nos permite confirmar que contamos con cantidad suficiente de cidos nucleicos (ADN/ARN) de calidad adecuada antes de llevar a cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real.
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2.6.2 Por colorimetra Las tcnicas colorimtricas se basan en la medida de la absorcin de radiacin en la zona visible por sustancias coloreadas. En algunas ocasiones, la muestra que deseamos determinar no posee color por s misma; en tal caso, es preciso llevar a cabo un desarrollo de color empleando reactivos que den lugar a sustancias coloreadas con la muestra que interesa estudiar. La colorimetra y fotocolorimetra no son en realidad tcnicas distintas y la diferencia estriba en el tipo de instrumental empleado, de forma que se denomina colormetro a aquellos aparatos en los que la longitud de onda con la que vamos a trabajar se selecciona por medio de filtros pticos; en los fotocolormetros o espectrofotmetros la longitud de onda se selecciona mediante dispositivos mono-cromadores.

Fig. 31 Componentes bsicos de fotmetros y espectrofotmetros de UV-VIS e IR.

Los colormetros (Fig. 32) miden valores triestmulos ms directamente que los espectrofotmetros y funcionan basndose en filtros de color. Por eso, los colormetros no proporcionar datos de reflectancia espectral. Sin embargo, muchas veces son preferibles a los espectrofotmetros debido a que son comparativamente ms baratos de fabricar y fciles de transportar.

Fig. 32 Colormetro

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2.6.3 Mediante tcnicas de electroforesis con gel de agarosa La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propsitos analticos, pero puede ser una tcnica preparativa para purificar molculas parcialmente antes de aplicar espectrometra de masas, PCR, clonacin o secuenciacin de ADN. La electroforesis en gel se utiliza ms ampliamente en la separacin de cidos nucleicos de diferente peso molecular.
Fig. 32 Gel de electroforesis

Las molculas RNA o DNA pequeas, de unos pocos cientos de nucletidos o menos, por lo general se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamina. Las molculas de mayor tamao tienen problemas para desplazarse a travs de la cerrada trama de la poliacrilamina y en general se fraccionan en gel de agarosa que tiene mayor porosidad. La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas. El gel con agarosa en baja concentracin (0.34) se emplea para separar fragmentos de DNA de mayor tamao. La electroforesis se basa en la migracin de las molculas con carga neta de una muestra, cuando es sometida a un campo elctrico, hacia el polo opuesto de su carga. El mtodo no es tan sencillo: primero hay que saber con qu tipo de molculas estamos trabajando y de acuerdo a esto se elige el procedimiento y los materiales necesarios. Hay dos fuerzas que determinan la velocidad con que una molcula migrar: la fuerza elctrica y la de rozamiento. La Fig. 33 Esquema de preparacin de un gel primera es la responsable de que la molcula en cuestin sea de electroforesis horizontal, tpicamente atrada hacia uno de los electrodos. Por esto es que cuanto empleado con agarosa para correr cidos mayor sea el cociente carga/masa de la molcula mayor ser nucleicos. La placa que se observa se la aceleracin con que se mueva. La fuerza de rozamiento introduce a continuacin en una cubeta rellena de tampn de electroforesis y tiene una accin opuesta: a mayor rozamiento, menor conectada a los electrodos. velocidad de migracin. Esta fuerza tiene que ver con el tamao y forma de la molcula que migra, y con las caractersticas del medio en que se mueve. Enseguida se explicar la electroforesis para separar molculas de DNA doble cadena. La carga neta de estas molculas est dada por los grupos fosfatos: como hay un fosfato cargado negativamente por cada nucletido y la masa de los cuatro desoxirribonuclotidos es similar, podemos afirmar que el cociente carga/masa ser independiente de la secuencia y la longitud de la doble cadena de DNA (todas las molculas de DNA migrarn entonces hacia el nodo). Esto quiere decir que no nos tendremos que preocupar por la fuerza elctrica, ya que las diferencias en la migracin estarn dadas exclusivamente por la fuerza de rozamiento. Como las molculas migran en el mismo medio y todas tienen la misma forma, la velocidad de migracin tendr que ver nicamente con el tamao de las molculas (la longitud de la doble cadena, medida en pares de bases). Claro que cuando se corren plsmidos, por ejemplo, no podemos afirmar lo mismo: al tener distintas formas no ocurrir lo explicado anteriormente. Lo mismo pasara con RNA o DNA
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simple cadena que formen apareamientos internos: en esos casos hay que desnaturalizar antes de correr, de modo que resulten cadenas lineales. Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de migracin adecuado, de modo que la separacin sea eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente fuerza de rozamiento para que las molculas de distinto tamao se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste en una red compuesta por un polmero orgnico (en este caso usamos agarosa, derivado de un polisacrido de un alga) y que aumenta considerablemente la friccin, impidiendo a la vez la difusin de las molculas a travs del medio acuoso en todas las direcciones. Al colocar las muestras de DNA a travs de este gel y someterlo a un campo elctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas segn su tamao. La rapidez con que migren las molculas puede ser regulada por la concentracin de agarosa disuelta en buffer que usemos: a mayor concentracin, mayor compactacin de la red y por tanto menor velocidad de migracin. La concentracin que elijamos depender de lo que se quiera separar en cada corrida. Una vez separados los DNAs de distintos tamaos, es posible conocer el peso de cada uno ya que el logaritmo del peso molecular es inversamente proporcional a la distancia recorrida desde el lugar de siembra. Es por eso que en cada corrida se hace necesario correr adems de las muestras una mezcla de DNAs de pesos conocidos para trazar un grfico de proporcionalidad. Estas mezclas se consiguen comercialmente y son conocidas como markers. 2.7 Anlisis de DNA por medio de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2.7.1 Fundamento La PCR es una tcnica para la sntesis "in vitro" de secuencias especficas de ADN. Es una forma simple y muy rpida de multiplicar el ADN presente en diferentes muestras biolgica, obtenindose millones de copias de una determinada secuencia de ADN. En poco tiempo esta tcnica ha conseguido ser ampliamente utilizada no slo en el campo de la gentica molecular, sino en otras muchas ciencias. Las siglas PCR significan "Polimerase Chain Reaction", Reaccin en Cadena de la Polimerasa. Desarrollado en 1983 por Kary Mullis , PCR es actualmente una tcnica comn e indispensable a menudo utilizado en los laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una variedad de aplicaciones. Estos incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, basado en el ADN filogenia, o el anlisis funcional de genes; el diagnstico de enfermedades hereditarias, la identificacin de huellas genticas (utilizados en las ciencias forenses y pruebas de paternidad ), y la deteccin y el diagnstico de enfermedades infecciosas. En 1993, Mullis recibi el Premio Nobel de Qumica junto con Michael Smith por su trabajo en PCR y desde entonces la PCR ha revolucionado todos los campos que estudian y manipulan los cidos nucleicos. Mullis se bas en la replicacin del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin doble cadena se usan los denominados cebadores (primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de DNA que se desea amplificar.

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2.7.2 Descripcin del proceso Partiendo de este principio, la reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas: 1 Desnaturalizacin del ADN doble cadena 2 Hibridacin de los cebadores a la zona 3especfica de cada una de las hebras 3 Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa En la primera etapa (desnaturalizacin) la doble hlice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas temperaturas (93-97C). La renaturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya. En el segundo paso (hibridacin) los cebadores (fragmentos cortos de ADN) que contienen secuencias complementarias a la regin de destino, se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65C). En la tercera etapa (elongacin) se produce la sntesis de una cadena sencilla (producindose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar grficamente en la Figura 34.

Figura 34: Pasos bsicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999)

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El proceso se lleva a cabo en un termociclador (fig.35). Un aparato que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.

Fig. 35: Termociclador de ADN

Como se muestra en las figuras 36a y 36b, observamos que una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8...Si los ciclos se producen un nmero "n" de veces y suponiendo que el nmero de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificacin se realiza en forma de progresin geomtrica.

Figura 36a: Amplificacin exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001)

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Figura 36b: Amplificacin exponencial del PCR (de M.E. Gilles-Gonzlez 1997)

Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la tercera etapa son de dos tipos: "producto corto" y "producto largo". El producto corto tiene una longitud perfectamente definida por los extremos 5de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se desea amplificar. Es el fragmento que se almacena de manera exponencial durante la reaccin. El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN originales de la muestra y cuyos extremos 3no estn definidos. Sin embargo, es importante aclarar que al final de la PCR, la cantidad de producto corto sintetizado es muy superior en comparacin con el producto largo, por lo que generalmente para posteriores estudios a partir del producto de la PCR, se desestima. (Fig. 37)

Figura 37: Detalle de los cuatro primeros pasos de la PCR (de Andy Vierstracte 2001)

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La deteccin del producto de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente mediante corrido electrofortico (fig. 38). Dependiendo del tamao de la amplificacin y de la resolucin que deseemos usaremos diferentes geles (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia, radiactividad (radiografa).

Figura 38: Preparacin del corrido electrofortico

En la actualidad se desarrollan mtodos para poder cuantificar el producto de la PCR, visualizando in situ sobre tejidos (Cao, Y. y cols, 2000). Lo que hace prever un crecimiento, si cabe mayor, del uso de la tcnica de la PCR. Recomendaciones para optimizar la reaccin de amplificacin Muestra de ADN Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en la reaccin: Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos ms pequeos de lo que queremos amplificar. Origen de la muestra y proceso de extraccin: la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentracin de iones de Mg. en la disolucin. Tampoco debe haber determinados factores sanguneos, fenol, detergentes... que inhibiran la actividad de la polimerasa. Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificacin de ADN genmico de copia nica se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng. El mnimo oscila entre 10-100 ng. y el mximo entre 400-500 ng.

Diseo de los cebadores Para la eleccin de los primers, existen una serie de normas que nos pueden ayudar, aunque hay que indicar tambin que existen programas de ordenador que nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).

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 DNA Polimerasa Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicacin del ADN, siguiendo el mismo mtodo de sntesis. Se pueden clasificar en:

Termolbiles: T ptima de 37-42C. Se desnaturalizan con el calor.

Termoestables: T ptima de 74 C. Resiste durante 40-50a 96C.

Inicialmente se us el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki y cols., 1985) la cual posee actividad 3-> 5 exonuclesica que le proporciona la capacidad de cambiar el nucletido que ha sido errneamente incorporado. La importancia de esta actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicacin del ADN original. Sin embargo, se trata de una enzima termolbil por lo que no soporta los ciclos y temperaturas utilizados en una PCR. Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa (Estivil, 1991). Es una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la tcnica de la PCR, ya que ha permitido su automatizacin (desarrollo del termociclador). Sales: Es de gran importancia la concentracin de dos cationes que son aadidos en forma de sales. Cloruro potsico (KCl). Influye en la desnaturalizacin del ADN. Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura de hibridacin del DNA. La concentracin de este ion resulta fundamental para la optimizacin de la reaccin.

Contaminacin en la PCR La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una tcnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequea) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la tcnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989). Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al mximo: Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR Uso de instrumental exclusivo para la PCR Utilizacin de reactivos y tubos estriles Uso de guantes por el manipulador Realizacin de controles de blanco (se aade agua en lugar de ADN, no debe existir amplificacin).

Hoy en da, la PCR es una tcnica indispensable en los laboratorios de investigacin mdica y biolgica de todo el mundo. Permite a investigadores y personal mdico producir millones de copias de una sola muestra de ADN o ARN para usarlas en secuenciacin del genoma, anlisis de genes, diagnstico de enfermedades hereditarias, pruebas de paternidad, identificacin forense, y deteccin de enfermedades infecciosas. Gracias al trabajo de Reginald Beer y su equipo de cientficos e ingenieros del Laboratorio Nacional estadounidense de Lawrence Livermore, ahora es posible en menos de tres minutos

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realizar una amplificacin de cidos nucleicos (ADN y ARN) mediante la reaccin en cadena de la polimerasa. El mtodo estndar actual de PCR, descrito anteriormente, suele necesitar cerca de una hora para realizar el trabajo, lo cual es un gran adelanto respecto a las tcnicas anteriores que tardaban das. Sin embargo, la PCR para un consultorio mdico, y sobre todo para un centro de atencin mdica de urgencia debera ser an ms rpida, del orden de unos pocos minutos. El equipo de Beer ha demostrado la eficacia de su veloz dispositivo de PCR mediante la amplificacin de ADN genmico de una bacteria Enterobacter y de una porcin de ADN del SARS. En el primer caso, se comprob la capacidad del dispositivo para amplificar con rapidez un segmento grande de ADN. En el segundo caso, se mostr la utilidad del dispositivo en el manejo de un virus que es una amenaza severa para la salud pblica. El dispositivo logra 30 ciclos de amplificacin de PCR del ADN objetivo en tan slo dos minutos y 18 segundos.
Fig 37: Reg Beer (derecha) y Gary Johnson

PCR en el diagnstico de las enfermedades PCR permite el diagnstico precoz de las enfermedades malignas tales como leucemia y linfomas, que es actualmente el de mayor desarrollado en la investigacin del cncer y ya se est utilizando de forma rutinaria. Los ensayos de PCR se puede realizar directamente en muestras de ADN genmico para detectar la translocacin especficos de clulas malignas en una sensibilidad que es al menos 10.000 veces ms alta que la de otros mtodos. PCR tambin permite la identificacin de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento tales como micobacterias, bacterias anaerobias, o virus de cultivo de tejidos de ensayos y modelos animales. La base para aplicaciones de la PCR de diagnstico en microbiologa es la deteccin de agentes infecciosos y la discriminacin de no patognica de las cepas patgenas en virtud de genes especficos. La gentica ha sido revolucionada en los ltimos aos por las tcnicas de biologa molecular, haciendo posible dilucidar complejas funciones fisiolgicas a nivel del gen. En especial y luego del descubrimiento de la PCR, la cual ha permitido el estudio y la medicin de la variabilidad gentica a nivel molecular; as podemos citar la utilizacin de los marcadores moleculares del tipo microsatlite, los cuales debido a sus particulares propiedades intrnsecas, se han convertido en los marcadores de eleccin para estudios tantos de gentica bsica como de la mejora animal. Desde los anlisis de gentica poblacional, seguidos de las creaciones de los ms sofisticados mapas genticos hasta la deteccin de genes importantes, han sido las principales incursiones realizadas por los genetistas a partir de la informacin aportada por estos marcadores. La medicin del polimorfismo del ADN, mediante estos marcadores genticos en organismos con genomas complejos, ha hecho posible adems mapeos, manipulacin y clonacin de genes asociados con caracteres biolgicos de inters. En este artculo se plasman algunas de las utilidades prcticas de la identificacin y anlisis del polimorfismo del ADN, especialmente lo referido al estudio mediante los marcadores del tipo de microsatlite.
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2.8 Por Microsatlite. SSR (Simple Sequence Repeat) o STR (Short Tandem Repeat) por sus siglas en ingls, denominados microsatlites en castellano, son secuencias de ADN en las que un fragmento (cuyo tamao va desde dos hasta seis pares de bases) se repite de manera consecutiva. La variacin en el nmero de repeticiones crea diferentes alelos. Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del DNA. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutacin, lo que los hace muy polimrficos. A pesar de esto, la variabilidad que presentan til para su uso como marcadores moleculares, es respecto al nmero de repeticiones, no de la secuencia repetida. Son utilizados como marcadores moleculares en una gran variedad de aplicaciones en el campo de la gentica como parentescos y estudios de poblaciones. Constitucin Un microsatlite esta tpicamente conformado por un motivo repetitivo, en el cual se encuentra contenido la secuencia repetida, y dos regiones flanqueantes, las cuales se encuentran a ambos lados del motivo repetitivo. Sin embargo en algunos casos, pueden haber dos motivos repetitivos o ms dentro de un microsatlite. Para que un microsatlite sea considerado til como marcador molecular, toda la variacin de la secuencia o polimorfismo debe hallarse dentro del motivo repetitivo, y por el contrario, las regiones flanqueantes deben estar altamente conservadas al punto de no presentar ninguna variacin de secuencia. Partiendo de esta hiptesis se disean primers o iniciadores (tambin llamados cebadores) es decir, fragmentos de ADN que tienen la misma secuencia que los extremos de las regiones flanquentes para poder amplificar (o producir un alto nmero de copias) un microsatlite a travs de una PCR. Los fragmentos as producidos son separados de acuerdo a su longitud en pares de base a travs de una electroforesis en gel de agarosa. Partiendo de la hiptesis de que en un microsatlite slo vara el nmero de repeticiones dentro del motivo repetitivo; fragmentos que tienen el mismo tamao, as determinado por la Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), tienen la misma secuencia, de manera que todos los fragmentos de un mismo tamao representaran un alelo. Estos alelos se herederan de manera codominante, es decir, que en cada locus un individuo podra presentar uno o ms alelos, dependiendo del nmero de juegos de cromosomas que posea. Por ejemplo, los humanos somos diploides, es decir, poseemos dos juegos completos de cromosomas y por lo tanto para un locus microsatlite podemos presentar un alelo (si ambos progenitores nos transmitieron alelos de la misma secuencia y tamao) o dos alelos (si cada progenitor nos hered un alelo de tamao diferente). Se ha probado que los microsatlites son verstiles marcadores moleculares, particularmente para los anlisis poblacionales, pero no por ello se encuentran ausentes de limitaciones. Los microsatlites desarrollados para unas especies particulares pueden con frecuencia ser aplicadas a especies emparentadas, pero el porcentaje de loci que se amplifican satisfactoriamente puede disminuir cuando aumenta la distancia gentica. Aplicaciones Dado que los microsatlites estn ms o menos distribuidos a lo largo de todo el genoma de los eucariotas, aunque con baja frecuencia en las regiones codificantes y, quizs tambin en los telmeros, y a sus particulares ventajas en cuanto a nivel de polimorfismo, bajo costo y codominancia, el uso de los microsatlites ha tenido un gran impacto en el estudio de la gentica de animales, plantas y seres humanos desde su descubrimiento en 1989.
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EJEMPLO: Descripcin: Realizar la identificacin gentica y el control de filiacin mediante tcnicas moleculares en aves de presa o rapaces mediante el anlisis de marcadores de ADN de tipo microsatlite o STR y de tipo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). A partir de unas gotas de sangre o plumas se obtiene la huella gentica, que es caracterstica del animal y casi irrepetible en la poblacin a la que pertenece. Comparada con la de sus padres/hijos se puede contrastar la ascendencia/descendencia y llevar a cabo los denominados controles de filiacin.

Fig. 39: Contraste del perfil gentico de un hijo frente al de dos posibles padres

Se procede al aislamiento del ADN y la posterior amplificacin enzimtica mediante la tcnica de PCR. El anlisis de estos fragmentos amplificados da lugar a lo que se denomina huella de ADN o huella gentica, que es similar a un cdigo de barras y es caracterstica de cada animal. Debido al polimorfismo de los marcadores, existe un gran nmero de combinaciones posibles de alelos, lo que hace muy difcil que dos individuos tengan la misma huella gentica y, por lo tanto, es posible su diferenciacin. Se trata de un mtodo de identificacin 'universal' muy potente, vlido durante toda la vida del animal e infalsificable, por lo que en caso de prdida, disputa o robo, hara posible la identificacin de forma inequvoca. El anlisis gentico de paternidad, pedigr gentico o control de filiacin en rapaces, como en otras especies de animales, est basado en la contrastacin de la huella gentica de un animal con la de sus ascendentes o progenitores. Para cada marcador, de los 2 alelos que presenta un individuo, uno lo ha heredado de la madre, Fig. 40: Metodologa utilizada para la (cuya veracidad en muchos casos no se cuestiona) y el identificacin gentica otro del padre biolgico o verdadero. En el caso de los AFLPs, cada banda existente en la huella gentica de un individuo, debe estar presente en uno de sus dos progenitores. Si se realiza este anlisis para un conjunto de 8-10 marcadores, la potencia de exclusin de paternidad es muy elevada, prxima al 100%. Si el presunto padre es rechazado como padre biolgico el resultado es categrico y absoluto. El anlisis de microsatlites es una tcnica sencilla, rpida y de bajo coste que se puede realizar a partir de cualquier muestra que contenga clulas nucleadas.
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Pruebas de paternidad El principio de las pruebas de paternidad utilizando marcadores moleculares consiste en la comparacin del genotipo y/o fenotipo de la descendencia con el de sus progenitores. Como principio mendeliano, uno de los alelos que presenta un individuo proviene del padre y el otro de la madre. En dicho anlisis, al igual que la identificacin individual, la identificacin de l(os) testigo (s), tanto a nivel fenotpico como genotpico debe ser perfectamente conocida y concordante con la informacin obtenida en los anlisis realizados al individuo. El elevado polimorfismo que presentan los SSRs y la posibilidad de poder detectar ambos alelos los hace muy tiles para identificaciones individuales en humanos, ya que resulta muy poco probable que dos individuos elegidos al azar, si son analizados para una serie de marcadores, compartan todos sus alelos. Para seleccionar los marcadores a utilizar, estos deberan reunir las caractersticas descritas anteriormente y presentar adems: alta variabilidad, herencia estable (baja tasa de mutacin), elevada reproductividad y precisin, la no presencia de alelos nulos, ser un procedimiento fcil, rpido, econmico, potencialmente automatizable, que la informacin del genotipo pueda ser transferida rpidamente, que la fuente de ADN no est limitada nicamente a muestras sanguneas frescas ni a grandes cantidades de ADN y por ltimo, presente una segregacin independiente con otros marcadores al ser combinados en la prueba. Tradicionalmente, las pruebas de paternidad se han venido realizando principalmente a travs de la tipificacin sangunea, incluyendo tanto pruebas serolgicas como grupos sanguneos (hemotipados); as como, anlisis electroforticos del polimorfismo de protenas y enzimas sanguneas (alozimas). Actualmente, esas pruebas han sido sustituidas por el uso de microsatlites. La combinacin de estos sistemas proporciona un 97% de probabilidad de detectar o asignar un padre o una madre correctos y cerca del 100% de probabilidad para un cruzamiento entre individuos El desarrollo de las metodologas de anlisis de DNA, y especialmente la utilizacin de la tcnica PCR para la tipificacin de microsatlites, est modificando radicalmente el campo de la identificacin individual no solo en humanos sino tambin en animales domsticos. Es por esta razn y dado el gran nmero de SSRs informados para distintas especies, que la Sociedad Internacional de Gentica Animal (ISAG) y la Food and Agriculture Organization (FAO) han seleccionado y estandarizado diferentes microsatlites en las distintas especies de animales domsticas (bovinos, equinos, porcinos, caninos, ovinos, caprinos) con el fin de ser empleados para estudios de identificacin y para trabajos sobre diversidad gentica de razas domsticas. Cartografa gentica Otra aplicacin, de los microsatlites es la construccin de mapas de ligamiento ms completos y detallados; as como la identificacin de genes de inters (QTLs). Todos los marcadores pueden ser utilizados para realizar mapas de ligamiento; sin embargo, se requiere, que los alelos se segreguen independientemente y que adems puedan ser monitoreados a travs del pedigr. La descendencia puede ser informativa si los progenitores son doble heterocigotos en los loci analizados. Los loci situados en cromosomas distintos podran recombinarse libremente durante la gametognesis parental hasta un 50% (segregacin independiente); mientras que, si se encuentran en el mismo cromosoma recombinaran con una frecuencia que oscila entre 0 a 50% dependiendo de la distancia en centimorgans (cM) presente entre ellos. As, un mapa gentico bien surtido de marcadores se convierte en una herramienta muy til para identificar genes responsables de caracteres de inters. Se trata de buscar asociacin entre varios alelos, en cualquiera de los marcadores, segregando en poblaciones que presentan el carcter de inters, para identificar regiones del genoma donde es ms probable que se encuentre el gen responsable de ese carcter.
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SABAS QUE ?
En 1973 los investigadores Stanley Cohen y Herbert Boyer producen el primer organismo recombinando partes de su ADN en lo que se considera el comienzo de la ingeniera gentica. En 1997 se clona el primer mamfero, la Oveja Dolly. El 7 de marzo de 2010 fue publicado en lnea y rectificado el 25 de marzo del mismo ao en la revista Nature, una de las revistas cientficas ms prestigiosas del mundo, una investigacin del cinvestav Irapuato en colaboracin con cientficos de Estados Unidos y Francia en la cual hallaron una protena llamada argonauta 9 con la que se podra llegar a inducir la clonacin natural de las plantas, esto tendra un fuerte impacto en la industria de semillas, y algunos dicen que podra revolucionar la produccin agrcola internacional. Un organismo genticamente modificado (abreviado OMG, OGM o GMO, este ltimo del ingls Genetically Modified Organism) es aquel cuyo material gentico es manipulado en laboratorios donde ha sido diseado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna caracterstica especfica. Comnmente se los denomina transgnicos y son creados artificialmente en laboratorios por ingenieros genticos. Microorganismos transgnicos: como se reproducen con rapidez y son fciles de desarrollar, las bacterias transgnicas producen hoy infinidad de sustancias importantes y tiles para la salud y la industria. En el pasado, las formas humanas de protenas como insulina, hormona del crecimiento y factor de coagulacin, que sirven para tratar graves enfermedades y alteraciones en las personas, eran muy raras y costosas. Pero ahora, las bacterias transformadas con genes para protenas humanas producen estos importantes compuestos de una manera muy econmica y en gran abundancia. Las personas que tienen diabetes insulino-dependiente son tratadas con insulina humana pura producida por genes humanos introducidos en bacterias. En el futuro, los organismos transgnicos podran producir sustancias dirigidas a combatir el cncer. Se conoce como transgnesis al proceso de transferir genes en un organismo. La transgnesis se usa actualmente para hacer plantas y animales transgnicos. Existen distintos mtodos de transgnesis como la utilizacin de pistolas de genes o el uso de bacterias o virus como vectores para transferir los genes. Las nucleasas son enzimas que cortan las hebras de ADN mediante la catlisis de la hidrlisis de los enlaces fosfodister. Las nucleasas que hidrolizan nucletidos a partir de los extremos de las hebras de ADN se denominan exonucleasas, mientras que las endonucleasas cortan en el interior de las hebras. Las nucleasas que se utilizan con mayor frecuencia en biologa molecular son las enzimas de restriccin, endonucleasas que cortan el ADN por determinadas secuencias especficas. En biotecnologa, estas nucleasas especficas de la secuencias de ADN se utilizan en ingeniera gentica para clonar fragmentos de ADN y en la tcnica de huella gentica. Muchos mutgenos se posicionan entre dos pares de bases adyacentes, por lo que se denominan agentes intercalantes. La mayora de los agentes intercalantes son molculas aromticas y planas, como el bromuro de etidio, la daunomicina, la doxorubicina y la talidomida. Para que un agente
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intercalante pueda integrarse entre dos pares de bases, stas deben separarse, distorsionando las hebras de ADN y abriendo la doble hlice. Esto inhibe la transcripcin y la replicacin del ADN, causando toxicidad y mutaciones. Por ello, los agentes intercalantes del ADN son a menudo carcingenos: el benzopireno, las acridinas, la aflatoxina y el bromuro de etidio son ejemplos bien conocidos. Sin embargo, debido a su capacidad para inhibir la replicacin y la transcripcin del ADN, estas toxinas tambin se utilizan en quimioterapia para inhibir el rpido crecimiento de las clulas cancerosas. En 1978 el descubrimiento de las enzimas de restriccin mereci tambin el otorgamiento del mismo premio a Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith ya que su descubrimiento condujo al desarrollo de la tecnologa conocida como del ADN recombinante que culmin con una nueva rama del saber conocida como Biotecnologa. As, la primera aplicacin prctica de las enzimas endonucleasas de restriccin fue la manipulacin de la bacteria E.coli para producir insulina. Las enzimas de restriccin son como tijeras que permiten cortar el ADN en sitios especficos, de esta forma se puede remover un segmento de ADN e insertar en su lugar otro y a la vez ese segmento de ADN puede ser incorporado en otro ADN diferente. Mediante esta tecnologa fue y es posible el clonado de un gen de inters, determinar las funciones de los genes, producir protenas en organismos unicelulares o en clulas cultivadas in-vitro y decenas de aplicaciones ms, entre ellas, la obtencin de ratones knock out. Qu es un ratn knockout o ratn KO y con qu fin se obtuvieron? Un alelo o aleloide (del griego: , alllon: uno a otro, unos a otras) es cada una de las formas alternativas que puede tener un gen que se diferencian en su secuencia y que se puede manifestar en modificaciones concretas de la funcin de ese gen. Al ser la mayora de los mamferos diploides estos poseen dos cromosomas, uno de ellos procedente del padre y el otro de la madre. Cada par de alelos se ubica en igual locus o lugar del cromosoma. Por alelo debe entenderse el valor de dominio que se otorga a un gen cuando rivaliza contra otro gen por la ocupacin de posicin final en los cromosomas durante la separacin que se produce durante la meiosis celular. De ese valor de dominacin del alelo procreador resultar la trasmisin, idntica o distinta, de la copia o serie de copias del gen procreado. De acuerdo con esa potencia, un alelo puede ser dominante y expresarse en consecuencia en el hijo solamente con una de las copias procreadoras, por lo tanto si el padre o la madre lo poseen el cromosoma del hijo lo expresar siempre; o bien puede ser un alelo recesivo, por lo tanto se necesitarn dos copias del mismo gen, dos alelos, para que se exprese en el cromosoma procreado, esto es, deber ser provisto al momento de la procreacin por ambos progenitores. Un locus (del latn locus, lugar; el plural en espaol es locus, pero por influencia anglosajona se suele usar incorrectamente loci) es una posicin fija en un cromosoma, como la posicin de un gen o de un marcador (marcador gentico).

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