UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS Departamento de Biologa Celular y Gentica

(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

Curso: BIOTECNOLOGA VEGETAL Cdigo: B02046

TECNOLOGAS PARA GENERAR VARIABILIDAD GENTICA in

vitro

Prof. Indira Aurora Roel Barahona

Laboratorio de Recursos Genticos y Biotecnologa (S14) Semestre 2011-II

GENERACIN DE VARIABILIDAD GENTICA

Rescate de embriones

Variacin somaclonal

Hibridacin somtica

ESTRATEGIAS

In vitro
Transforma gentica Induccin de mutaciones Obtencin de haploides

CMO SE LOGRA?
ESTRATEGIAS METODOS APLICACIONES

Rescate de embriones

Cultivo in vitro de embriones cigticos en los primeros estadios postfertilizacin Cultivo de vulos Cultivo de anteras o polen Cultivo nodrizas de polen

Elimina barreras postcigticas por incompatibilidad entre las cruzas hbridas

Obtencin de haploides

Regeneracin de plantas haploides con posibilidad de diploidizar stas para obtener lneas homocigticas

B A R R E R A S

PRECIGTICAS

MTODOS DE POLINIZACIN in vitro

Polinizacin estigmtica Polinizacin placental Polinizacin de vulos Cortado del estilo Injerto de estilo Mezcla de polen mentor pollination

POSTCIGTICAS

MTODOS DE RESCATE

Rescate de embriones Discos de ovarios Cultivo de vulos

Factores externos:
Medio de cultivo: 2 fases en el desarrollo embrionario.

Osmolaridad: Sacarosa. <sacarosa > crec.

Reguladores de crecimiento: ruptura de la dormicin. Temperatura: 25 a 30C

RESCATE DE EMBRIONES
Los hbridos (embriones producto de la fertilizacin del ovulo de una especie con el grano de polen de otra especie) no se desarrollan debido a la falta de nutriente, por lo que es necesario rescatarlos de la flor y cultivarlos in vitro en un medio. Rescate de material de propagacin con semillas de baja viabilidad. Disminucin de perodo de latencia de semillas debida a inhibidores del desarrollo del embrin. Permite acortar el perodo desde la siembra a la floracin, se utiliza particularmente en frutales. Tendr ms aplicacin cuando avancen los programas de hibridacin de rboles.

RESCATE DE EMBRIONES
CRUZAMIENTOS INTERESPECFICOS: BRSICAS, LICOPERSICUM, HELIANTUS, ORYZA, MEDICAGO

CRUZAMIENTOS ESPECFICOS: UVA DE MESA

Programa Mejoramiento Gentico de Vides

JUSTIFICACION Evitar la dependencia del material gentico extranjero (Patentes). Seleccionar variedades con las caractersticas ms apropiadas para sus condiciones. Desarrollo de variedades para mercado Ampliar el perodo de produccin Identificar al pas con su propio producto en los mercados externos que generen fortalezas de marketing

Fuente: NICOLE HEWSTONE - INIA-CRI La Platina (2002)

Objetivos Generales
Obtener variedades que presenten las siguientes caractersticas: Sin semilla Sabor moscatel Larga vida de postcosecha Produccin temprana o tarda.

Planteamiento de Trabajo
Cruzamientos: Padres: 20 variedades
y 6 selecciones Rescate de embriones in vitro Aclimatacin de plantas y seleccin en campo Uso de marcadores moleculares para seleccin e identificacin de algunos genes

27 CLONES SELECCIONADOS MADURACION TEMPRANA

Seleccin Padres
H1P9 H8P24 Ruby-Perlette Flame-Perlette

H5P26

Ruby-Red

Brix (%) 18,7 16,6 18,0 18-16 16,7 18

Maduracin
21/12 Vicua 18/01 Platina 27/12 Vicua 29/01 Platina 13/01 Vicua 28/01 Platina

Temporada Caractersticas Evaluacin 1991/92 Ss, GA3, racimo denso,russet, odio(S) 1995/96 60%s, moscatel,17-18 mm , odio (S) 1995/96 Ss, GA3 crec y unif., 17mm, moscatel cida

H1P9 H8P24

H5P26

MADURACION TEMPRANA
Seleccin Padres
H15P18 Ruby-Superior

Brix (%) 16 17
17,4 22 22 18

Maduracin
24/3/00 02/02/01 01/02/00 02/02/01 22/02/00

H15P28 Ruby-superior H16P13 Red-Dawn

Temporada Caractersticas Evaluacin 1998/99 Ss, 20mm,racimo denso poco pincel,russet,excel calidad organolptica 1996/97 Ss,flame,GA3,19mm(17) calidad post-cosecha 1998/99 Ss, GA3 crec y unif., 1722 mm, similar Sultanina H16P13

H1P9

H15P18
H15P28

MADURACION MEDIA
Seleccin Padres
H18P5 Flame-Blush

H13P36 Ruby-Blush

Brix (%) 15,5 16,4 17

Maduracin
16/02/00 02/02/01 29/01/99 15/02/99

H16P29 Red-Dawn

19 20

16/02/00 02/02/01

H18P5

Temporada Caractersticas Evaluacin 1998/99 Ss,17mm,baya cropiel gruesa 1996/97 Ss, 18 mm, GA3 aumenta calibre, grosor raquis y desgrane 1998/99 Ss, 23,5x15,5 mm buen sabor, cscara gruesa H13P36 H16P29

Bsqueda de polimorfismos asociados a apirenia mediante RAPD-BSA

Primera etapa: Identificacin de bandas
candidatasprobando diferentes partidores de RAPD- Tesis de Grado de Nilo Meja G05 G07 G10 G11 ASAS G48 G45 G47

PRODUCCIN DE DOBLES HAPLOIDES

DESDE LA FORMACIN DE EMBRIONES HAPLOIDES A PARTIR DEL CULTIVO IN VITRO DE MICROSPORAS DE Datura y Nicotiana SE HAN LOGRADO OBTENER EN UN GRAN NMERO DE CULTIVOS COMO ARROZ, TRIGO, CEBADA, NABO, ESPRRAGO, BERENJENA, PIMIENTO, REMOLACHA, GIRASOL Y MELN.

ESTRATEGIAS

METODOS

APLICACIONES

Obtencin de variantes genticas

Variacin somaclonal Variacin gametoclonal Seleccin in vitro

Rapidez, muestreo de grandes poblaciones de individuos en espacios reducidos, un mayor control de los agentes selectivos

Hibridizacin somtica

Por induccin qumica (PEG, Ca++, DMSO) Por induccin fsica (pH, temperatura, etc.) Electrofusin (en campo elctrico)

Eliminacin de barreras precigticas al permitir la hibridizacin interespecfica, intergenrica y entre taxa superiores

OBTENCIN DE VARIANTES GENTICOS

Larkin y Scowcroft (1981): cambios

transmitidos a la progenie Primeros casos: caa azcar y papa Fuente adicional de variabilidad Programas de mejoramiento

CAUSAS DE VARIACIN SOMACLONAL

alteraciones en cariotipo mutaciones puntuales recombinacin somtica e ICH rearreglos gnicos somticos elementos gnicos transponibles cambios en DNA de organelas amplificacin y metilacin de DNA=EPIGENETICA

VENTAJAS DE VARIACIN SOMACLONAL

Relativamente poco costoso Rpida en producir nuevos tipos de variantes no detectadas en programas de fitomejoramiento por mutagnesis Exitosa para eliminar defectos Tasas de mutacin relativamente altas Permite un proceso doble de seleccin in vitro e in vivo Produce lneas clonales derivadas de una clula por lo que no se generan mosaicos genticos. Las nuevas variantes no son acompaadas por otras mutaciones indeseables como s ocurre por efecto de agentes mutgenos.

 Tcnica de cultivo in vitro y patrn de

desarollo
Genotipo Nivel de ploida Explanto Va de regeneracin

Factores relacionados con la aparicin de variacin somaclonal

Componentes del medio de cultivo Condiciones ambientales de cultivo

Deficiencia de oxgeno

Edad del cultivo

OBTENCIN DE VARIANTES GENTICOS

VARIACIN
VARIACIN
GAMETOCLONAL

SOMACLONAL

Plantas regeneradas de cultivo -

de clulas gamticas (masculinas o femeninas). Puntos importantes: Mutaciones recesivas y dominantes que se expresan directamente de plantas haploides-> identificacin de nuevas variantes Gametos homocigotos y son controlados por genes recesivos. Mutacin despus de duplicacin-> heterocigozidad > 7 10%

CULTIVO DE ANTERAS DE ARROZ

 Recesividad : caractersticas deseables, Bsqueda de genotipos raros y distincin de mutaciones. Acortar el tiempo necesario para la obtencin de variedades . 90% -> uniformes y estables

Estrategia para la produccin comercial de variantes somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz.

SELECCIN in vitro
Es posible muestrear miles de clulas variantes o transformadas en un tiempo y espacio limitados, mientras que en campo se requeriran meses. Es posible controlar con precisin las presiones de seleccin como: factores de estrs ambiental, microorganismos patgenos, fitotoxinas, etc. El crecimiento bajo las condiciones de seleccin es indicio de auxotrofia, tolerancia o resistencia a dicho factor.

SELECCIN in vitro Para resistencia y tolerancia Seleccin directa en un solo paso Seleccin en varios pasos

Seleccin in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas concentraciones de aluminio

Mediante seleccin in vitro se pudo obtener resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas y tolerancia a estreses ambientales

Los resultados del mejoramiento mediante variacin somaclonal son difciles de preveer. Se han obtenido rboles tolerantes a metales pesados y a bajas temperaturas

Niveles de deteccin de la variacin somaclonal

Marcadores Morfolgicos
A nivel fisiolgico Cariotipo

Marcadores Bioqumicos Marcadores Moleculares

RAPD MICROSATELITES AFLP

MUTAGNESIS in vitro Mejoramiento Gentico de Ajo

Ajo: mejoramiento por seleccin clonal
Objetivo: Inducir variabilidad gentica en clones comerciales Planteamiento de Trabajo: - Induccin de mutaciones con agentes fsicos y qumicos - Aumento de la ploida con colchicina - Uso de variabilidad somaclonal

EMS (ETIL METANO SULFONATO) Colchicina Control

Evaluacin explantes: races- tallo verdadero hojas Evaluacin de dosis de Reguladores de crecimiento: 2,4-D

RAPD Isozimas Cariotipo

EMS Colchicina Control

Incremento de callos en cultivo

Evaluacin medios de cultivo: MS - B5 Evaluacin de reguladores de crecimiento: 2iP kinetina- BAP

RAPD

 Meristemas tratados con EMS

RAPD DE AJOS TRATADOS CON EMS

Callos tratados con EMS

0,3 1,9 0,3 0,7 1,1 2,8 RI 1,5 1,9 2,4 RI

Plantas tetraploides

4n=42

Figura 3: Obtencin de variantes somaclonales de pasto llorn, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias A) Formacin de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfognesis. C) Estudio histolgico de los mismos callos mostrando clulas embriognicas y D) embriones somticos. E) En el mismo callo se observaron embriones bipolares y tambin F) organognesis. G) Plntula completa en el momento de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron frtiles (I). J) Cromosomas en el pice radical de la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando variacin, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas

ESTRATEGIAS

METODOS

APLICACIONES

Obtencin de variantes genticas

Variacin somaclonal Variacin gametoclonal Seleccin in vitro

Rapidez, muestreo de grandes poblaciones de individuos en espacios reducidos, un mayor control de los agentes selectivos

Hibridizacin somtica

Por induccin qumica (PEG, Ca++, DMSO) Por induccin fsica (pH, temperatura, etc.) Electrofusin (en campo elctrico)

Eliminacin de barreras precigticas al permitir la hibridizacin interespecfica, intergenrica y entre taxa superiores

Tipos de hbridos somticos

Hibridacin simtrica Hibridacin asimtrica Cibridacin

TRANSFERENCIA MEDIADA POR PROTOPLASTOS

LA TRANSFORMACIN DE
PROTOPLASTOS FUE LA PRIMERA TCNICA DE TRANSFORMACIN EN PLANTAS USANDO LA VIA DIRECTA DE DNA. EN ESTE MTODO, LOS PROTOPLASTOS DERIVAN DE TEJIDOS FINOS DE LA PLANTA O DIRECTAMENTE DE UN CULTIVO EN SUSPENSIN DE CLULAS. LA PLANTA ES INDUCIDA A TOMAR EL DNA DESNUDO MEDIANTE TRATAMIENTOS CON AGENTES DE PERMEABILIZACIN DE LA MEMBRANA TALES COMO POLIETILEN-GLICOL (PEG) O POR ELECTROPORACION.

OBTENCION: en la actualidad la fuente de protoplastos ms habitual

es el tejido de mesfilo de las hojas jovenes, tejidos de callo, pices de raz, pices de tallo, frutos, ndulos de races, lminas de aleurona (cereales), microsporas, tubos polnicos
AISLAMIENTO: celulasa, pectinasa, hemicelulasa .pH 6-7; T ptima

40-60C controladores osmticos (inicos o no inicos) como sorbitol, manitol, sacarosa, glucosa, cloruro clcico, etc, a distintas dosis.
a) FUSION QUIMICA INDUCIDA: la superficie de los protoplastos

( - ) repulsin entre los protoplastos; se utilizan qumicos PEG (polietilen-glicol) aumenta la permeabilidad de la membrana y la estimulacin para la transferencia del DNA.

No puede ser utilizada para

todas las especies.

b) ELECTROFUSION: utiliza pulsos

elctricos cortos en un campo de alta frecuencia (0.5~1.5 Mhz) para aumentar la permeabilidad de las membranas del protoplasto, se mantiene una corriente baja para estimular que pp entren en contacto y se induce a fusin por alta corriente. La principal ventaja es que se tenga un mayor grado de control en el proceso de la fusin, a pesar que se sabe que los pulsos demasiado largos de alto voltaje provoca la muerte del protoplasto.

Medicago sativa (Leve V., Bertrand M., Duval M., Bilodeau P., Aquin S.,Vzina L.-P.)

METODO 1: LAS HOJAS

FUERON CORTADAS, TRITURADAS Y DIGERIDAS EN UNA SOLUCIN DE ENZIMA QUE CONTIENE SUCROSA. ESTA DIGESTIN DIO MUCHOS RESIDUOS; Y LOS PROTOPLASTOS TUVIERON QUE SER PURIFICADOS EN UN GRADIENTE DE SUCROSA. (protoplasto granulado)

METODO 2 : LAS HOJAS SON CORTADAS EN DELGADAS HILERAS Y SON DIGERIDAS EN UNA SOLUCIN DE ENZIMA CON MANNITOL COMO MEDIO OSMOTICO. ESTA DIGESTIN PRODUCE POCO O NINGUN RESIDUO Y LOS PROTOPLASTOS FUERON SEPARADOS POR CENTRIFUGACIN.
Solucin enzimtica A (Neuhauss 2001) Solucin enzimtica B (Song 1990)

La primera divisin ocurri en el plazo de 10 das 20% de los protoplastos se han convertido en colonias 3-4 semanas despus del aislamiento del protoplasto Ocho semanas despus del aislamiento, el microcalli era 1 milmetro de tamao

Finalmente se transfieren sobre medio de B5h para inducir la embriognesis y el desarrollo de plntulas

Seleccin de hbridos somticos y cbridos

Seleccin sobre la base de caracteres
morfolgicos. Seleccin por complemetacion. Defectos metablicos o genticos no allicos. Carcter dominante Mutacin autotrfica. Seleccin por aislamiento de clulas hbridas. Seleccin mecnica directa. Citometra de flujo.

ESTRATEGIAS

METODOS

APLICACIONES

Incorporacin de organelos

Introduccin de caracteres citoplasmticos

Transformacin gentica

Fusin de liposomas Rescate gentico Alta frecuencia de Microinyeccin incorporacin Endocitosis Electroporacin Geminivirus Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Aceleracin de partculas Garantiza la incorporacin y expresin de los genes introducidos Empleo en todo tipo de explantes

QUE ES TRANSFORMACION?
LA TRANSFORMACIN ES UN
CAMBIO HEREDABLE EN UNA CLULA U ORGANISMO, PRODUCIDO POR LA ABSORCIN Y ESTABLECIMIENTO DEL ADN INTRODUCIDO POR UN MEDIO DISTINTO AL DE LA FUSION DE GAMETOS O DE OTRAS CELULAS.

Electroporacin
Poros creados por
descargas elctricas DNA transformante ingresa a travs de los poros y se incorpora al genoma celular

Con Polietilenglicol
Este mtodo es usado en protoplasto
o en clulas osmticamente sensibles Implica la degradacin de la pared celular con enzimas Poros creados por modificacin de los fosfolpidos de membrana hacindola permeable Ingreso del DNA al protoplasma

Figure 2. Histochemical localization of GUS activity in Arabidopsis mesophyll protoplasts transfected with translational GUS fusions Purified protoplasts (a) were mock-transfected (d) or challenged with th following plasmid DNAs: pRTL2-GUS which encodes the nonfused, authentic GUS protein (b); pRTL2GUS::IAAI encoding a GUS::IAAl fusion protein (c); pRTL2-GUS::PS-IAA6 encoding a GUS::PS-IAA6 fusion protein (e and f). Transfected protoplasts were cultured for 20 h, stained for GUS activity (b-e) and nuclei (f).

Agro-infeccin en Solanum

tuberosum

Aislamiento de explantes de hojas

Formacin de heridas Infeccin del tejido herido por Agrobacterium

Fuente: CIP (2005)

Seleccin de clulas transformadas

Despus de 4 a 6 semanas de la infeccin, se regenera plntulas en medio de seleccin con el antibitico kanamicina.

Papa transgnica
Propagacin de plntulas transgnicas ADN genmico vegetal con el gen de inters y el de seleccin incorporados

Anlisis moleculares

PCR
C 1

Southern Blot
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Western Blot

Anlisis en invernadero

TRANSFORMACIN GENTICA FORESTAL

Es una herramienta con gran potencial en la mejora de especies leosas, si bien debe ser complementaria de las lneas de mejora clsica. Los sistemas de transformacin gentica comnmente utilizados en rboles: - Agrobacterium tumefaciens (angiospermas). - Biobalstica (gimnospermas). Debido a su genoma pequeo, ciclo de rotacin corto, rpido crecimiento y fcil propagacin vegetativa, el lamo (Populus sp.) se ha constituido en un sistema modelo en biotecnologa forestal

Principales objetivos reportados en investigaciones relacionadas con la modificacin gentica de forestales

AREAS POTENCIALES DE APLICACIN

Modificacin de la forma y el tamao Reduccin del tiempo generacional y de la

floracin Modificacin del contenido de lignina y celulosa Resistencia a plagas y enfermedades Tolerancia a herbicidas Tolerancia a estrs abitico Fitorremediacin

Modificacin de la forma y el tamao

Se transformaron varias especies forestales con genes que participan en la sntesis de hormonas, tales como: Genes de Agrobacterium tumefaciens: iaaM iaaH (sntesis de auxinas); isopenteniltransferase (ipt) (sntesis de citoquininas). Genes de Agrobacterium rhizogenes: rol A, B, C, D, aux1 y aux2 (sntesis de auxinas y citoquininas). Gen de la GA 2-oxidasa (GA2ox), involucrado en la sntesis del cido giberlico. Resultados: Modifican el fenotipo, las caractersticas de la madera y el crecimiento. Aplicaciones: Modificacin de la produccin de frutos, rboles enanos para manejo de riesgo, cambio de las fibras para industria del papel, manejo de huertos semilleros y produccin de ornamentales.

Transformacin de Populus tremuloides con genes que participan en la sntesis de auxinas

El gen iaaM est involucrado en la sntesis del

cido indol actico En las lneas transformadas con el gen iaaM se observaron diferencias en la proliferacin de yemas axilares y la disposicin de las hojas

Lneas silvestres y transgnicas

Fenotipos de lamo silvestre (izq.) y transgnico (der.)

Transformacin de Populus spp. con genes rolC yrolD de Agrobacterium rhizogenes

lamos transgnicos que expresan el gen rolC (izq. y cent.) y control (der.)
Reversin al genotipo silvestre de lamos transgnicos que expresan el gen rolC

- Los genes rolC y rolD originan plantas ms bajas, con hojas pequeas y hbito arbustivo. - Las plantas con genes rol producen menos xilema y rompen sus yemas ms tarde que las plantas control. - Las fibras de xilema son ms cortas y tienen menor concentracin de carbohidratos solubles. - Los genes rolC y rolD inducen el fenotipo rol, el que se acenta por los genes rolA y rolB y se atena por los genes aux1 y aux2.

Transformacin de Populus spp. con modificaciones en la sntesis de giberelinas

lamos transformados con el gen de GA20 oxidasa

Lneas transgnicas de lamo (Lnea 11), mostrando mayor altura y crecimiento en dimetro que el fenotipo salvaje.

La planta stumpy se muestra del lado izquierdo y la wild type a la derecha.

Modificacin de la forma, el tamao y el crecimiento-Sntesis de giberelinas.

Hbridos de lamo 6 semanas. lnea transgnica con el gen antisentido de GA 20-oxidasa tipo silvestre lnea transgnica que sobrexpresa el gen de GA 20-oxidasa

Tomado de http://www.upsc.nu/Default.asp?pageid=720&path=756%2C760%2C766

Induccin de floracin temprana y esterilidad

Reduccin del tiempo generacional y la floracin

- Debido a la maduracin tarda de las especies forestales, la floracin precoz se considera un objetivo importante en la mejora gentica de rboles. - Es interesante obtener rboles estriles que redirijan el gasto energtico dedicado a la floracin hacia la produccin de madera y que no permitan la diseminacin de polen.
Induccin de floracin precoz en lamo transgnico 35S::LFY (flor masculina) Expresin tejidoespecfica del gen uidA en lamo transgnico

Represin de la sntesis de lignina mediante un gen antisentido de C4L

Transformacin de Populus tremuloides con una
construccin antisentido de la 4-cumarato:CoA ligasa

Plantas control de 10 semanas y transgnicas crecidas en invernadero (regla = 25 cm).

Tolerancia a herbicidas (lamos transgnicos tolerantes a glifosato y glufosinato de amonio)

Pruebas de campo
Ensayos de tolerancia in vitro PV-LEGT02 Control

Glifosato 1 mg/L

Alamos resistentes a insectos transformados con el gen cry3A

Daos en hbridos de lamo control (derecha) y transgnico (izquierda) expresando el gen cry3A, expuestos a larvas del coleptero Chrysometa scripta en pruebas de invernadero.

 Transformacin de Liriodendron tulipifera con

rboles transformados con genes para fitorremediacin

genes bacterianos merA para la remediacin de suelos contaminados con Hg2+
wild type

merA

merA
Tomado de: www.forestry.UGA.edu//merkle/merklecont.html

- Las plntas transgnicas crecen vigorosamente en medios que contienen niveles txicos de Hg2+. - Las plantas transgnicas absorben 10 veces ms Hg2+ que las plantas no transformadas.

 Transformacin de Populus deltoides con genes

rboles transformados con genes para fitorremediacin

bacterianos merA para la remediacin de suelos contaminados con Hg2+

-Las plantas transgnicas cultivadas en un medio con 25 M Cl2Hg muestran un crecimiento normal, mientras las plantas control mueren

Tomado de: www.forestry.UGA.edu//merkle/merklecont.html

Pruebas a campo con rboles transgnicos en Estados Unidos