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Regeneración in vitro de tres

variedades de Crisantemo
(Dendranthema grandiflora)
vía organogénesis y
embriogénesis somática

Hodson, E., Cancino, G. Forero a.


Unidad de Biotecnología Vegetal
INTRODUCCIÓN
Colombia
es el segundo exportador mundial de
flores frescas de corte
4211 Toneladas
anuales

Valor estimado
US$11.513.470
La floricultura en Colombia genera en forma
directa e indirecta 163.300 empleos
Países importadores de
flores Colombianas

El 98% de la producción total de flores se exporta


Crisantemo
(Dendrathema grandiflora)

Esta especie presenta


una alta demanda en el
exterior y es
ampliamente cultivada a
nivel interno
La producción de crisantemo se ve seriamente
afectada por el ataque de hongos patogenos,
requiere de grandes cantidades de fungicidas, lo cual
incrementa los costos a nivel económico y ecológico

Puccinia horiana
La evaluación de
sistemas de
regeneración in vitro de
plantas de crisantemo
vía organogénesis o
embriogénesis
somática, constituye un
primer paso para la
transformación genética
Objetivo: Evaluar la respuesta de regeneración in vitro, a
partir de discos de hoja vía organogénesis y
embriogénesis somática de tres variedades de crisantemo
(Dendrathema grandiflora) cultivadas en Colombia

aa bb cc
White
Whitealbatross
albatross Escapade
Escapade Yellow
Yellowalbatross
albatross
Materiales y
Métodos

Establecimiento y
propagación de
segmentos nodales
las tres variedades de
D. grandiflora
ORGANOGéNESIS
ANA BAP
(µM) (µM)
0 0
1.61 4.44
3.22 8.87
4.83 13.32
TRATAMIENTOS 16
REPETICIONES 40
REPLICAS 3

Medio de cultivo: Murshige & Skoog (1962)


Individualización,
enraizamiento y endurecimento
de las plantas regeneradas
Organogénesis

Individualización y Enraizamiento
Medio de cultivo Murashige & Skoog (1962)

Condiciones durante el
Endurecimiento:
Cámara húmeda
Sustrato : turba
Embriogénesis somática
2,4-D Tiempos de exposición
(µM) (días)
0 7
1.12 14
2.26 21
3.39 -
4.52 -
TRATAMIENTOS 15
REPETICIONES 40
REPLICAS 3

Medio de cultivo: Mum B (May & Trigiano,


1991; Urban et al, 1994)
Individualización y endurecimento
de las plantas regeneradas

Embriogénesis somática

Individualización: Medio de cultivo Mum B

Condiciones durante el endurecimiento:


Cámara Húmeda
Sustrato : turba
Resultados y Discusión
El medio Murashige & Skoog (MS) y las condiciones de
incubación establecidas son adecuados para
el establecimiento y multiplicación de los segmentos nodales
de las tres variedades en estudio

Wambagu et al., 1981; Dabin et al., 1983; Kushal, 1994;


Khan et al., 1994; Haq et al., 1999
Regeneración viaOrganogénesis
12 DDS 14 DDS (29X) 20 DDS (29X)

40 DDS

Estado Planta
individualización enraizada

Variedad White Albatross


Frecuencias de regeneración de brotes
• Se requiere de un balance de BAP y ANA para
obtener una regeneración exitosa en D. grandiflora
Ledger et al., 1991 Arbos, 1992; Courtney-Gutterson et al., 1993; Renou et al., 1993;
Khan et al., 1994; Kushai et al., 1994; Seiichi et al., 1995; Roxas et al., 1996;
Sangwan et al., 1998

• La variación de los niveles exógenos de


citoquininas en plantas, puede causar incrementos
en las concentraciones de auxinas endógenas y a
su vez las auxinas controlan los niveles endógenos
de citoquininas activas
(Coenen & Lomas et al., 1997)
Escapade

ANA 4.83 µM y BAP 4.44 µM (T14)


Frecuencia de regeneración de brotes: 73 %
Número promedio de brotes por explante: 4.9
White Albatross

ANA 4.83 µM + BAP 13.32 µM (T16)


Frecuencia de regeneración de brotes: 62.5%
Número promedio de brotes por explante: 14.45
Yellow Albatross

ANA 4.83 µM y BAP 4.44 µM (T14)


Frecuencia de regeneración de brotes: 57.3%
Número promedio de brotes por explante: 3.58
La capacidad de regeneración de brotes de
crisantemo vía organogénesis es dependiente de la
variedad

Protoplastos (Sauvadet et al., 1990)


Pétalos florales (Malure et al., 1991)
Embriones somáticos (May and Trigiano et al., 1991)
Discos de hoja (Sherman et al., 1998)

Perdida del potencial de regeneración en algunas


especies, por acumulación masiva de poliaminas
causada por el estrés generado durante el cultivo in
vitro del tejido vegetal
(Aribaud, et al., 1994; Martín et al., 1997)
Individualización y Enraizamiento

El medio con MS sales completas, sin reguladores de


crecimiento, favorece la elongación y el enraizamiento de
los brotes, en contraste con lo requerido por otras
variedades
Hill 1968, Langhans 1972, Kaul et al. 1990, Tian et al. 1993, Rout et al. 1996, Sherman
et al. 1998
Frecuencias de enraizamiento y endurecimiento

Variedad Enraizamiento Endurecimiento


(%) (%)
Escapade
90 97

White albatross
87 100

Yellow albatross
92 97
Embriogénesis somática

Variedad Escapade Vista estereoscópica 93.5 X

Mum B + 2,4-D 2.26 µM


La composición del medio de cultivo Mum B
favoreció la respuesta embriogénica

La interacción adecuada de citoquinina - auxina estimula


estados tempranos de diferenciación celular

La citoquinina incrementa la sensibilidad del tejido al


estimulo de la auxina y este incremento de sensibilidad
favorece la desdiferenciación celular

Ambos reguladores participan en la dinámica del ciclo


celular, importante en el proceso de diferenciación y
posterior desarrollo de embriones somáticos
(Aloni, 1995).
Inducción embriones: Tratamientos mas efectivos
Concentración Tiempo de
Variedad T 2,4-D exposición
µM (días)
Escapade
T9 2.26 21

White albatross
T8 2.26 14

Yellow albatross
T9 2.26 21
Formación de masas pre-embrionicas
y desarrollo de brotes
Masas Pro- Brotes Número Plantas
embrionicas (%) Br/Exp completas
Variedad T
(%) (%)
Escapade
T9 76.4 51.14 2 86

White albatross
T8 69.4 5.7 1.4 89

Yellow albatross
T9 72.03 5.3 1 84
• Efecto positivo del 2,4-D sobre la inducción de
embriogénesis somática en las tres variedades
evaluadas
(Bhattacharya et al., 1990; Fujii & Shimizu, 1990)

• La adicción exógena de auxinas (2-4D) puede


producir un aumento sustancial de los niveles de
AIA endógenos
(Pasternak et al. 2003)

• La maduración y germinación de los embriones,


ocurren sin adición de auxinas
(Sherman et al., 1998 )
Endurecimiento
De las plantas regeneradas

Es posible endurecer y
transferir exitosamente a
suelo las plantas de la tres
variedades en estudio
propagadas in vitro,
utilizando cámara húmeda y
sustrato turba
Frecuencias de enraizamiento y
endurecimiento
Endurecimiento
(%)
Variedad Plantas obtenidas vía
Organogénesis Embriogénesis
Escapade
97 90

White albatross
100 80

Yellow albatross
97 100
Conclusiones regeneración D. grandiflora
Organogénesis

• Alta capacidad morfogenética en los segmentos


nodales de D.grandiflora
• El medio MS con ANA 4.83 µM y BAP 4.44-13.32
µM, permite regeneración de plantas vía
organogénesis de D.grandiflora.
• Hay elongación y enraizamiento espontáneo de
brotes obtenidos vía organogénesis en medio MS sin
reguladores de crecimiento
Conclusiones regeneración D. grandiflora
Embriogénesis

• El 2,4-D (2.26 µM) favorece la inducción de


embriones somáticos a partir de discos foliares de
las tres variedades de D.grandiflora

• El medio de cultivo Mum B sin reguladores


permite la germinación de los embriones
somáticos y el desarrollo de brotes
Entidades
financiadoras